As Distrofias Musculares Progressivas (DMPs) constituem um grupo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Dentre as diferentes abordagens terapêuticas propostas para esse grupo de doenças, a terapia celular com células-tronco mesenquimais (CTMs) tem sido um foco importante de pesquisas. Muitos tipos de CTMs já foram descritas com o intuito de reconhecer qual o tipo ideal a ser usado em uma possível terapia celular para DMPs. Neste trabalho comparamos o potencial terapêutico de células-tronco de diferentes fontes obtidas de um mesmo doador. Escolhemos as células de pericito (CP) como ferramenta de estudo, uma vez que elas estão presentes em todos os tecidos irrigados por vasculatura. Isolamos pericitos de 4 tecidos da mesma doadora (endométrio, trompa, tecido adiposo e músculo). Em seguida, injetamos 1 milhão dessas células intraperitonialmente em camundongos Utrntm1KedDmdmdx/J (duplo knockout para o gene da distrofina e utrofina) semanalmente, por 8 semanas, e avaliamos a clínica e a sobrevida desses animais. Observamos que nas condições experimentais desse estudo, o potencial miogênico dessas células é insuficiente para ser utilizado como terapia regenerativa. Entretanto, apesar dos testes padronizados não detectarem nenhuma melhora clínica aparente, os animais tratado com pericitos de gordura mostraram uma curva de sobrevivência significativamente maior do que os controles não tratados. Como não houve diferenciação miogênica, esses resultados sugerem que os efeitos benéficos ocorreram através de liberação de fatores tróficos e imunoreguladores (efeito parácrino). É digno de nota que apesar das células serem todas derivadas de pericito e de uma mesma doadora o aumento de sobrevida só foi observado com células do tecido adiposo. Esses resultados indicam que o potencial terapêutico de CP difere de acordo com sua origem e que essa diferença não depende do genoma do doador. Esses resultados constituem um passo inicial, porém, valioso na compreensão do potencial de utilização dessas células em terapias / Progressive Muscular Disorders (PMDs) are a group of heterogeneous genetic diseases characterized by an irreversible degeneration of the muscle tissue due to mutation or absence of a protein. Among the many different available therapeutic approaches to treat PMDs, cell therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the most studied ones. There are many types of MCSs described to date and the need to identify the best one suited to treat PMDs has yet to be addressed. In this thesis, we compared the therapeutic potential of different types of stem cells derived from the same donor. First, we chose pericytes as a tool of comparison, as this cell is unequivocally present in all vascularized tissues. We isolated pericytes of 4 different tissues from the same donor (endometrium, fallopian tubes, adipose tissue and muscle). We injected 1 million of these cells intraperitonially in Utrntm1KedDmdmdx/J mice (knockout for the dystrophin and utrophin gene) weekly for 8 weeks evaluating the clinical features and survival curve of these mice. We observed that, in the experimental conditions of this study, the myogenic potential of these cells is insufficient to be harnessed as therapy for regenerative purposes. However, despite the fact that the standardized tests did not detect any apparent clinical improvement, mice treated with pericytes derived from adipose tissue had a survival curve greater than control treated mice. As we could not observe any myogenic differentiation or cell engraftment, this results suggests that the beneficial effect observed could be due to the releasing of trophic and immune modulator factors (paracrine effect). It is noteworthy that despite all cells being derived from the same donor, the increase in life expectancy was only observed in pericytes derived from the adipose tissue. These results indicate that the therapeutic potential of pericytes differs according to their tissue of origin and the difference is not due to genetic differences. This is still preliminary data but it is valuable in understanding the therapeutic potential of these cells

A crescente prevalência de diabetes mellitus (DM) em nível mundial, a sua incidência cada vez maior em crianças e adolescentes e resultados prévios obtidos em nosso laboratório (piora do quadro diabético em ratos na puberdade) nos levaram a investigar o metabolismo de glicose em tecido adiposo branco na puberdade em ratos controle (CO) e intolerantes à glicose (STZ). Parâmetros de desenvolvimento corporal e maturação sexual foram estudados entre a 5ª e a 10ª semanas de vida dos animais, identificando-se a 6ª e 7ª semanas como importante fase da puberdade. Desta forma, os estudos metabólicos foram realizados neste período. Os animais CO apresentaram franca resistência à insulina no período da puberdade, com prejuízos no metabolismo de glicose em adipócitos isolados. A injeção de estreptozotocina no quinto dia de vida produziu um quadro de intolerância à glicose em nossos animais, resultando em atraso no início do estirão de crescimento e desenvolvimento sexual. A resistência fisiológica à insulina da puberdade não produziu piora da resposta à insulina no tecido adiposo branco. / The growth in the prevalence of diabetes mellitus (DM), a larger incidence of type 1 and 2 DM in children and adolescents and the previous results of our laboratory (worsening of the metabolic picture in diabetic rats during puberty) motivate us to study the glucose metabolism in the puberty in order to assess the possible influence of the physiological insulin resistance characteristic of this period on the course of the diabetic status. Five-day old male Wistar rats were divided into two experimental groups: control group (CO) and streptozotocin group (STZ). Body development and sexual maturation were weekly evaluated between the 5th and 10th weeks of life. We identify the 6th and 7th weeks as an important early phase of the puberty. The insulin resistance and a slight degree of glucose intolerance were determined in non-diabetic rats. On the other hand, STZ group showed insulin resistance and it was impaired in the course of puberty suggesting that the developing of this resistance during the puberty presents a different characteristic of that seen in normal rats.

A obesidade é fator de risco para o desenvolvimento de resistência à insulina (RI), diabetes tipo 2 (DM2) e doenças cardiovasculares, e o treinamento físico aeróbio (TFA) é recomendado para a prevenção e o tratamento de tais doenças. O sistema renina angiotensina (SRA), especificamente as alças ECA/Ang II/AT1 e ECA2/Ang (1-7)/Mas, está envolvido no desenvolvimento e progressão da obesidade e da RI, e por isso é considerado um potencial alvo terapêutico. O objetivo do estudo foi investigar se a prevenção da obesidade e da RI está associada com a modulação das alças do SRA no tecido adiposo branco (TAB). Para isso, camundongos machos adultos C57BL6/J foram separados em grupos (n=10/grupo) sedentários (SED) alimentados com dieta normocalórica (NO) e de cafeteria (CAF) (SED-NO e SED-CAF) e treinados (TF) alimentados com dieta NO e CAF (TF-NO e TF-CAF). O TFA foi realizado simultaneamente com as dietas durante 8 semanas. Os resultados revelaram que o grupo SED-CAF apresentou maior peso corporal e adiposidade, intolerância à glicose e RI, enquanto o TFA preveniu tais prejuízos no grupo TF-CAF. No TAB periepididimal (TAB-PE), os grupos SED-CAF e TF-CAF reduziram a expressão de p-AKT, aumentaram a expressão de ATGL, p-HSL e IL-6. Embora a ECA2 sérica tenha aumentado nos grupos TF-NO e TF-CAF, e a Ang (1-7) sérica aumentado no grupo TFNO, não houve modificação nos componentes de ambas as alças do SRA no TAB-PE. No TAB subcutâneo (TAB-SC), o TFA reduziu a razão p-AKT/t-AKT e aumentou a expressão da ATGL nos grupos TF-NO e TF-CAF e, aumentou a t-HSL e razão p-HSL/t-HSL no TF-CAF. O TFA preveniu a hipertrofia dos adipócitos no TF-CAF e aumentou a expressão da UCP-1 apenas no TF-NO. O grupo TF-CAF aumentou a expressão dos receptores AT1, AT2 e Mas, enquanto o TF-NO aumentou a Ang (1-7) e a razão Ang (1-7)/Ang II no TAB-SC. Foi observada correlação positiva entre a UCP-1 e a constante de decaimento de glicose (Kitt) e, entre a UCP-1 e a Ang (1-7). O TFA preveniu a obesidade e a RI em animais submetidos à dieta de cafeteria, e a contribuição do TAB-PE e do TAB-SC foi por meio da redução na expressão de proteínas envolvidas na sinalização da insulina e do aumento na expressão de proteínas sinalizadoras de lipólise. Além disso, o TFA não impediu o aumento de marcador inflamatório no TAB-PE, porém preveniu o prejuízo na expressão de genes termogênicos no TAB-SC induzido pela dieta de cafeteria. A inalteração ou a modulação parcial de componentes das alças ECA/Ang II/AT1 e ECA2/Ang(1-7)/Mas no TAB-PE sugere que o SRA não participou dos efeitos induzidos pelo TFA associados à prevenção de obesidade e RI. No entanto, no TAB-SC, o aumento na concentração de Ang (1-7) no grupo dieta normocalórica e dos receptores Mas e AT2 no grupo dieta cafeteria induzido pelo TFA, sugerem a contribuição do SRA na prevenção de obesidade e RI / Obesity is a risk factor for the development of insulin resistance (IR), type 2 diabetes (T2D) and cardiovascular disease, and aerobic exercise training (AET) is recommended for the prevention and treatment of such diseases. The renin angiotensin system (RAS), specifically the ACE/Ang II/AT1 and ACE2/Ang (1-7)/Mas, is involved in the development and progression of obesity and IR, and is therefore considered a potential therapeutic target. The aim of the study was to investigate whether the prevention of obesity and IR is associated with the modulation of the RAS axis in white adipose tissue (WAT). For this, adult male C57BL6/J mice were divided into groups (n= 10/group) sedentary (SED) fed normocaloric diet (NO) and cafeteria diet (CAF) (SED-NO and SED-CAF) and trained (TF) fed NO and CAF diet (TF-NO and TF-CAF). The AET was performed simultaneously with the diets for 8 weeks. The results showed that the SEDCAF group presented higher body weight and adiposity, glucose intolerance and IR, while AET prevented such damages in the TF-CAF group. In the periepididimal WAT (WAT-PE), the SED-CAF and TF-CAF groups reduced the expression of p-AKT, increased the expression of ATGL, p-HSL and IL-6. Although serum ACE2 increased in the TF-NO and TF-CAF groups, and Ang (1-7) increased in the TF-NO group, there was no change in the components of both RAS axis in WAT-PE. In the subcutaneous WAT (WAT-SC), AET reduced the p-AKT/t-AKT ratio and increased ATGL expression in TFNO and TF-CAF groups and increased t-HSL and p-HSL/t-HSL ratio in TF-CAF. AET prevented adipocyte hypertrophy in TF-CAF and increased UCP-1 expression only in TF-NO. The TF-CAF group increased the expression of AT1, AT2 and Mas receptors, whereas TF-NO increased Ang (1-7) and Ang (1-7)/Ang II ratio in WAT-SC. Positive correlation was observed between UCP-1 and the glucose decay constant (Kitt) and between UCP-1 and Ang (1-7). In conclusion, AET prevented obesity and IR in animals submitted to the cafeteria diet, and the contribution of WAT-PE and WAT-SC was reducing the expression of proteins involved in insulin signaling and increasing the expression of signaling proteins of lipolysis. In addition, AET did not prevent the increase of inflammatory marker in the WAT-PE, but prevented the loss in the expression of thermogenic genes in the WAT-SC induced by the cafeteria diet. The unalteration or partial modulation of components of the ACE/Ang II/AT1 and ACE2/Ang (1-7)/Mas axis in WAT-PE suggests that RAS did not participate in the AET-induced effects associated with prevention of obesity and IR. However, in the WAT-SC, the Ang (1-7) concentration increase in the normocaloric diet group and the Mas and AT2 receptors increase in the cafeteria diet group induced by AET suggest the association of RAS with the prevention of obesity and IR

Estudos realizados em nosso laboratório encontraram que o aumento do conteúdo corporal de ácidos graxos N3, pela produção endógena via modificação genética, protege camundongos do ganho de peso corporal e obesidade induzida por dieta hiperlipídica. Objetivo: Investigar os mecanismos pelos quais o óleo de peixecontrola o balanço energético de camundongos C57BL6/J e UCP1selvagens e Knockout (KO) protegendo do desenvolvimento da obesidade induzida por dieta, com ênfase nos processos termogênicos dependentes e independentes da UCP1. Materiais e Métodos: Protocolo 1- Camundongos C57BL6/J alimentados por 8 semanas com dieta normal (DN) contendo 10% de lipídeos oriundos do óleo de soja e banha de porco, dieta normal N3 (DNN3) contendo 10% de lipídeos oriundos do óleo de soja e óleo de peixe, dieta hiperlipídica (HFD) contendo 60% de lipídeos oriundos do óleo de soja e banha de porco e dieta hiperlipídica (HFDN3) contendo 60% de lipídeos oriundos do óleo de soja e óleo de peixe foram avaliados para o peso corporal, a eficiência energética, a ingestão alimentar, a calorimetria indireta, a adiposidade, a tolerância à glicose e à insulina, o consumo de oxigênio tecidual e a análise lipidômica do tecido adiposo inguinal (TAI) e marrom (TAM). Protocolo 2- Camundongos selvagens e Knockout para a UCP1 alimentados por 8 semanas com dieta (HFD) e (HFDN3) foram avaliados para o peso corporal, a eficiência energética, a ingestão alimentar, a calorimetria indireta, a adiposidade, a tolerância à glicose, e o consumo de oxigênio tecidual. Resultados: Protocolo 1- Não houve diferenças significativas no ganho de peso, adiposidade, ingestão alimentar, consumo de oxigênio e tolerância à glicose entre camundongos C57BL6/J alimentados com as dietas DN e DNN3. Entretanto, aqueles alimentados com dieta HFDN3, apresentaram reduzido ganho de peso corporal, massa dos tecidos adiposos e eficiência energética quando comparados a camundongos alimentados com dieta HFD. Esses efeitos aconteceram na ausência de alterações significativas na ingestão alimentar medida tanto em gramas quanto em Kcal entre esses grupos. Corroborando a menor eficiência energética, camundongos C57BL6/J alimentados com dieta HFDN3 apresentaram maior consumo de oxigênio e similar atividade locomotora espontânea que camundongos alimentados com dieta HFD. Demonstramos que o consumo de oxigênio do TAI foi maior no grupo HFDN3 quando comparado ao grupo HFD. Por fim, a análise lipidômica do TAI e TAM revelou que a principal modificação ocorreu no enriquecimento dos triacilgliceróis (TAG) desses tecidos, sobretudo um aumento de ácidos graxos altamente insaturados (HUFA) nos TAG de camundongos alimentados com dieta HFDN3. Protocolo 2- Demonstramos que a dieta HFDN3 protege os camundongos UCP1 KO contra o ganho de peso corporal, aumenta o gasto energético e melhora à tolerância à glicose de maneira independente da UCP1. Além disso, observamos que o grupo UCP1 KO HFD aumentou a massa do TAM quando comparado aos outros grupos. Conclusão: A substituição da banha de porco pelo óleo de peixe na dieta aumenta o gasto energético de camundongos reduzindo o ganho de peso corporal e a adiposidade de maneira independente da UCP1. Digno de nota, o enriquecimento dos TAG com HUFA, pode ser um importante fenótipo para respostas observadas no balanço energético do grupo HFDN3 de ambos os protocolos. Acreditamos, em parte, que uma alta mobilização dos HUFA para a beta-oxidação possa estar acontecendo em paralelo com a ativação de vias alternativas de gasto energético. Os mecanismos responsáveis por estas ações serão investigados futuramente. / We have previously shown that diet-induced obesity is prevented by increasing N3 fatty acids content in the body of mice through genetic modification. Aim: In the present study, we investigated the mechanisms by which the fish oil control the energy balance protecting mice from diet-induced obesity, with emphasis at shivering and non-shivering thermogenesis. Materials and Methods: Protocol 1- C57BL6/J mice were fed during 8 weeks with normal diet (DN) containing 10% of lipids from soy oil and lard, normal diet N3 (DNN3) containing 10% of lipids from soy and fish oils, high fat diet (HFD) 60% of lipids from soy oil and lard and high fat diet (HFDN3) containing 60% of lipids from soy and fish oils. The evaluated parameters were body weight, energy efficiency, food intake, indirect calorimetry, adiposity, glucose and insulin tolerance, tissue oxygen consumption and lipidomic analysis of the white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT). Protocol 2- Wild type (WT) and UCP1 knockout (KO) mice were fed during 8 weeks with HFD and HFDN3. In Protocol 2, body weight, energy efficiency, food intake, indirect calorimetry, adiposity, glucose tolerance and tissue oxygen consumption were evaluated. Results: Protocol 1- No significant differences were observed in body weight, adiposity, food intake, oxygen consumption and glucose tolerance between mice fed with DN and DNN3. Mice fed with HFDN3, however, displayed reduced body weight gain, epididimal, inguinal and retroperitoneal adipose tissue masses, and energy efficiency when compared to mice fed with HFD. These effects occurred in the absence of significant alterations in food intake measured in grams and Kcal. Corroborating the decrease in energy efficiency, C57BL6/J mice fed with HFDN3 have increased oxygen consumption, but similar spontaneous locomotor activity when compared to mice fed with HFD. We show that oxygen consumption in the WAT in mice fed with HFDN3 was higher than in mice fed with HFD. Finally, the lipidomics analysis in both WAT and BAT revealed an enrichment of the triacylglycerol (TAG) linked to highly unsaturated fatty acids (HUFA, 46 double bonds) in mice fed with HFDN3. Protocol 2- The HFDN3 protects both WT and UCP1 KO groups from body weight gain, increases energy expenditure, and improves glucose tolerance. Moreover, we observe that UCP1 KO HFD group increased the weight of the TAM relative to the other groups. Conclusion: Our results indicate that replacement of lard by fish oil in the diet of mice increases energy expenditure independently of UCP1, decreasing the gain in body weight and adiposity in both protocols. To account for these findings, a model based on the higher mobilization of TAG linked to HUFA for beta-oxidation (relative to less unsaturated moieties) and activation of alternative mechanisms of energy expenditure are proposed to explain the lean phenotype of mice fed with HFDN3. This and other mechanisms of energy expenditure, however, require further investigations.

Muitos estudos epidemiológicos existentes na literatura revelaram que insultos que ocorrem durante a vida intra-uterina estão associados com diversas anormalidades, tanto funcionais quanto estruturais na vida adulta. Estes estudos revelaram uma associação entre baixo peso fetal e subseqüente diabetes tipo 2, hipertensão e obesidade[1]. Mães que tiveram uma dieta restrita em nutrientes durante a gestação geraram proles com baixo peso ao nascimento e obesidade na vida adulta. Há ainda um aumento na expressão de genes que estão relacionados ao metabolismo lipídico, alem disso há menor expressão gênica da aminopetidase leucil específica, uma enzima que inativa a AII. AII é capaz de regular e estimular diversos fatores que podem modificar o metabolismo do tecido adiposo marrom e do tecido adiposo branco, como as prostaglandinas, enzimas lipogênicas (GPDH e a FAS), 3\' - 5\' monofosfato de adenosina cíclico, catecolaminas, proteína desacopladora mitocondrial (UCP1), prolactina. É conhecido que na vigência de restrição de sal há ativação do sistema renina-angiotensina (SRA) circulante. Desta forma, dieta hipossódica durante a gestação pode alterar o desenvolvimento fetal através de um efeito da angiotensina II. O objetivo do presente estudo foi avaliar a função do sistema renina-angiotensina circulante e no tecido adiposo, renal e cardíaco em prole adulta cujas mães receberam diferentes conteúdos de sal na dieta. Para tanto, ratas Wistar foram alimentadas a partir do segundo mês de vida com dieta hipo, normo ou hipersódica. Subgrupos de ratas em cada uma das dietas foram tratados com bloqueadores do SRA ou com angiotensina II. A prole teve seu peso acompanhado desde o nascimento até a 12a semana de idade, quando foi sacrificada por decapitação para coleta de sangue e retirada dos tecidos adiposos retroperitoneal, inguinal, marrom, rins e coração que foram armazenados para determinação das atividades de renina plasmática, ECA sérica, ECA renal, ECA cardíaca e Western blot dos componentes do SRA. Restrição de sal no período perinatal induz baixo peso ao nascimento. Maior índice de adiposidade, maior expressão protéica da enzima conversora da angiotensina I na gordura inguinal e menor expressão protéica do receptor AT2 na gordura marrom foram verificados na prole de fêmeas adultas de mães submetidas à restrição de sal durante a gestação e amamentação. A atividade de renina plasmática foi maior na prole de machos adultos cujas mães foram alimentadas com dieta hipossódica durante o período perinatal. Sobrecarga de sal na dieta durante o período perinatal também induziu baixo peso ao nascimento, somente na prole de fêmeas que na idade adulta tem maior massa de tecido adiposo inguinal. Concluindo, sobrecarga e restrição de sal durante o período perinatal induzem alterações no tecido adiposo e no sistema renina - angiotensina na prole adulta de fêmeas, mas não de machos. / Epidemiologic studies reported that insults during the intrauterine life have been associated with many abnormalites such low birth weigth, type 2 diabetes, hypertension and obesity in adulthood[1]. Low birth weight and obesity in adulthood were observed in offspring of undernourished dams. In addition, a high expression of genes related with lipid metabolism, and a low expression of the leucyl-specific aminopetidase gene, an enzyme that inactivates angiotensin II (AII) was also observed in offspring of undernourished dams. AII is capable to regulate and stimulate many factors that can change the brown (BAT) and white adipose tissue (WAT) metabolism, like a prostaglandin, lipogenic enzymes (GPDH and FAS), cAMP, catecholamins, mitochondrial uncoupling protein one (UCP1) and prolactin (PRL). It is well estabilish that low sodium diet stimulates the RAS. Therefore, low sodium diet during pregnancy may alter fetus development due to an effect of AII. The objective of this study was to evaluate the function of the circulating and adipose tissue, kidney and heart RAS in the adult offspring of dams that received differents contents of salt during the pregnancy and lactation. Wistar rats were fed a low (LSD), normal (NSD) or high (HSD:) salt diet since 8 weeks of age. Subgroups that received RAS blockers or AII were also studied. BW was measured since birth until adulthood. At 12 weeks of age, the mesenteric (MES), gonadal (GON), and retroperitoneal (RET) white adipose tissue (WAT), brown adipose tissue, heart and kidney were excised and stored. Low birth weight was observed in offspring of dams on salt restriction during pregnancy and lactation. Higher adiposity index, higher protein expression of the angiotensin I converting enzyme in inguinal fat tissue, and lower protein expression of the AT2 receptor in brown adipose tissue were observed in adult female offspring of salt restricted dams during the perinatal period. Plasma renin activity was higher in adult male offspring of salt restricted dams. Dietary salt overload during the perinatal period also induced lower birth weight but only in female offspring in which higher inguinal adipose tissue mass was observed in adulthood. In conclusion, changes in adipose tissue and renin-angiotensin system occur in female but not in male adult offspring in response to salt overload and restriction during pregnancy and lactation.

Introdução: A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é definida como um tipo de doença fibrosante intersticial crônica de etiologia desconhecida limitada aos pulmões e que apresenta padrão histológico de pneumonia intersticial usual. A prevalência de FPI é estimada em, aproximadamente, 20/100.000 em homens e em 13/100.000 em mulheres, sendo que a idade média do diagnóstico é 67 anos e a sobrevivência média é 2 a 5 anos. Estima-se que 5 milhões de pessoas sejam afetadas em todo o mundo. O tratamento clínico atual está associado com melhora parcial e transitória, com resultados duvidosos ou insatisfatórios. Na abordagem cirúrgica da FPI, tem destaque o transplante pulmonar, cuja realização é rara, devido à escassez de doadores e à limitação das equipes capazes de realizar tais procedimentos. A terapia celular é uma alternativa terapêutica com grande potencial de aplicabilidade na fibrose pulmonar. Objetivos: Utilizar um modelo de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina em ratos para investigar os efeitos da terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) e o meio condicionado no remodelamento pulmonar com objetivo de elucidar o mecanismo de ação das CTM e meio condicionado, na reversão da fibrose pulmonar. Para tanto, buscamos: 1) padronizar a cultura de células-tronco mesenquimais e meio de cultura; 2) caracterizar o modelo experimental de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina por microscopia óptica antes e após o tratamento com CTM e meio de cultura; 3) avaliar a expressão de biomarcadores sorológicos (Fibrinogênio, Fator von Willebrand e PDGF); 4) quantificar a expressão de proteínas relacionadas ao estresse oxidativo (NOS), citocinas pró-inflamatórias e pró-fibróticas (IL-17 e TGF-beta) e pró-angiogênicas (VEGF e endotelina) por imuno-histoquímica; e 5) quantificar a deposição de fibras do colágeno I e V por imunofluorescência. Materiais e Métodos: Utilizou-se um total de 44 ratos Wistar machos albinos com peso médio de 250-300g e 8 semanas de idade. Quatro grupos experimentais foram compostos de 10 animais, que participaram do experimento divididos em três momentos: D0, D10 e eutanásia (D14 ou D21). Em D0, foi realizada a instilação orotraqueal de bleomicina na dose de 1,5 U/kg; em D10, foi realizada a infusão em veia caudal de células-tronco mesenquimais na dose de 106 CTM/Kg ou 200 ?l de meio condicionado. Para o preparo das CTM, foi obtido, em média, 1,2 g de tecido adiposo, procedida a dissociação com colagenase tipo I, sendo que a contagem média de células foi de 3,05 x 106 células linfomononucleares/g de tecido adiposo. Estas células foram cultivadas durante 21 dias em meio Knockout DMEM-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino. Os seguintes três critérios foram utilizados para comprovar o perfil das células-tronco mesenquimais: aderência plástica, expressão de CD90 por citometria de fluxo ( > 90%) e capacidade de diferenciação em três linhagens mesodérmicas. Em D10, um pool destas células alogênicas foi infundido intravenosamente, na veia caudal, a uma concentração de 1 x 106 células/ animal num volume de 200 ul de solução salina. Em D14 ou D21, os animais foram eutanasiados e analisados quanto ao peso e conforme análises microscópico-laboratoriais. As análises histológicas foram realizadas por dois especialistas diferentes em estudo duplo-cego. Os parâmetros de ganho de peso e recuperação microscópica do tecido pulmonar foram analisados em cada grupo. Resultados: Nossos dados mostram que as células-tronco mesenquimais oriundas do tecido adiposo abdominal de ratos Wistar tiveram seu perfil fenotípico, capacidade de adesão plástica e diferenciação em 3 linhagens mesodérmicas estabelecidas inequivocamente, conforme estabelecido internacionalmente pela ISSCR. As células-tronco mesenquimais e o meio condicionado induziram: a recuperação clínica após tratamento; a reversão da inflamação e de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina; a reversão da arteriopatia no parênquima pulmonar distal; a redução das concentrações de fibrinogênio, fator von Willebrand e PDGF (marcadores sorológicos); a diminuição da expressão de enzimas oxidantes; a diminuição da expressão de endotelina e a modulação da expressão da proteína de remodelamento (IL-17), da ativação dos fibroblastos TGF-B e da síntese de colágeno. Conclusão: Neste estudo, comprovamos que as terapias com células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo e com o meio condicionado foram eficazes na modulação dos processos inflamatórios e fibrogênicos no modelo induzido por bleomicina, agindo na ativação miofibroblástica, e, também, na restauração tecidual e endotelial. Além disso, o meio condicionado se mostrou tão eficiente quanto as células-tronco propriamente ditas, no efetivo remodelamento pulmonar, devendo ser considerado como uma proposta terapêutica viável e inovadora / Introduction: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is defined as a type of chronic interstitial fibrosing disease of unknown etiology limited to the lungs and presenting a histological pattern of usual interstitial pneumonia. The prevalence of IPF is estimated at approximately 20/100,000 in men and 13/100,000 in women, with the mean age of diagnosis being 67 years and the average survival is 2 to 5 years. It is estimated that 5 million people are affected worldwide. The current clinical treatment is associated with partial and transient improvement, with dubious or unsatisfactory results. In the surgical approach to IPF, pulmonary transplantation is a prominent feature, which is rare because of the scarcity of donors and the limitation of the teams capable of performing such procedures. Cell therapy is a therapeutic alternative with great potential for applicability in pulmonary fibrosis. Objectives: To use a model of bleomycin-induced lung fibrosis in rats to investigate the effects of mesenchymal stem cell (MSC) therapy and conditioned medium on lung remodeling in order to elucidate the mechanism of action of MSC and conditioned medium, in the reversion of pulmonary fibrosis. To do so, we aim to: 1) standardize the culture of mesenchymal stem cells and conditioned medium; 2) characterize the experimental model of lung fibrosis induced by bleomycin by optical microscopy before and after treatment with MSC and conditioned medium; 3) to evaluate the expression of serological biomarkers (Fibrinogen, Factor von Willebrand and PDGF); 4) to quantify the expression of proteins related to oxidative stress (NOS), pro-inflammatory and pro-fibrotic (IL-17 and TGF-beta) and pro-angiogenic cytokines (VEGF and endothelin) by immunohistochemistry; and 5) to quantify the deposition of collagen I and V fibers by immunofluorescence. Materials and methods: A total of 44 male albino Wistar rats weighing 250-300g and 8 weeks of age were used. Four experimental groups were composed of 10 animals, which participated in the experiment divided in three moments: D0, D10 and euthanasia (D14 or D21). In D0, orotracheal instillation of bleomycin at the dose of 1.5 U/ kg was performed; in D10 caudal vein infusion of mesenchymal stem cells at the dose of 106 MSC/ kg or 200 ul of conditioned medium was performed. To prepare the MSC, a mean of 1.2 g of adipose tissue was obtained, dissociated with type I collagenase and the mean cell count was 3.05 x 106 lymphomonuclear cells / g of adipose tissue. These cells were cultured for 21 days in DMEM-F12 Knockout medium supplemented with 10% fetal bovine serum. The following three criteria were used to prove the profile of mesenchymal stem cells: plastic adherence, expression of CD90 by flow cytometry ( > 90%) and differentiation capacity in three mesodermal lines. In D10, a pool of these allogeneic cells was infused intravenously into the caudal vein at a concentration of 1 x 106 cells / animal in a volume of 200 ul of saline. In D14 or D21 the animals were euthanized and analyzed for weight and microscopic-laboratory analyzes. Histological analyzes were performed by two different specialists in a double-blind study. The parameters of weight gain and microscopic recovery of lung tissue were analyzed in each group. Results: Our data show that the mesenchymal stem cells derived from the abdominal adipose tissue of Wistar rats had their phenotypic profile, plastic adhesion capacity and differentiation in 3 mesodermal lines established unequivocally, as established internationally by ISSCR. Mesenchymal stem cells and conditioned medium induced: clinical recovery after treatment; bleomycin-induced reversal of inflammation and pulmonary fibrosis; the reversal of arteriopathy in the distal pulmonary parenchyma; the reduction of fibrinogen, von Willebrand factor and PDGF concentrations (serologic markers); decreased expression of oxidizing enzymes; the reduction of endothelin expression and the modulation of the expression of the remodeling protein (IL-17), the activation of TGF-B fibroblasts and the synthesis of collagen. Conclusion: In this study we demonstrated that therapies with mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and conditioned medium were effective in the modulation of inflammatory and fibrogenic processes in the bleomycin-induced model, acting to modulate myofibroblastic activation and also in tissue restoration and endothelial cells. In addition, the conditioned medium proved to be as efficient as the stem cells themselves, in effective pulmonary remodeling, and should be considered as a viable and innovative therapeutic proposal

A somatotropina (ST) pode reduzir a deposição de gordura em suínos, em crescimento em até 90%. Este efeito parece ser função de diversas alterações no metabolismo do tecido adiposo, incluindo a redução na atividade da sintetase de ácidos graxos (FAS), considerada uma enzima limitante na via da síntese de lipídeos de novo. A atividade da FAS parece ser regulada principalmente através de alterações na abundância de seu mRNA, sendo fundamental conhecer os efeitos exercidos pela ST. Com este objetivo procurou-se validar o uso conjunto de duas técnicas: 1) o RT-PCR Quantitativo Competitivo (QC-RT-PCR), que permite monitorar a expressão gênica da FAS mesmo quando as concentrações de mRNA ou a quantidade de tecido são muito pequenas; e 2) uso de culturas de explantes de tecido adiposo, que permite submeter o tecido a um grande número de tratamentos. As culturas de longa duração possibilitam avaliar o efeito crônico da ST. Foram construídos "primers" para geração de um amplicon "nativo" de 307 bp e um "primer" anti-senso-deleção para amplificação de umfragmento de 243 bp denominado de "competidor". Em etapa subseqüente foram realizadas clonagens dos amplicons nativo e competidor que foram seqüenciados. Foi construída uma curva padrão, utilizando diluições seriais do DNA nativo e uma concentração constante do DNA competidor. Tecido adiposo de sete suínos, com peso médio de 78 kg, foram retirados assepticamente e os explantes incubados em meio 199 na presença de insulina, dexametasona e antibióticos, com e sem ST recombinante suína (pST; Reporcin, Southern Cross Biotech), por 48 horas. O RNA total dos explantes foi extraído e, a partir destes, sintetizados os DNAs complementares (cDNA) à população de mRNAs. Os cDNAs foram amplificados pela PCR com "primers" específicos para a FAS capazes de amplificar também o fragmento nativo. Os resultados da amplificação foram avaliados utilizando-se a curva padrão citada. Os resultados, consistentes com a literatura, demonstraram uma redução da atividade enzimática da FAS em tecidos incubados por 48 h com pST, (46,4 vs 35,8 nmoles/mg.min; P<0,05). Consistente com os dados de atividade e dados da literatura, utilizando-se outras técnicas, observou-se redução de 40% na abundância de mRNA da FAS, em culturas de tecido adiposo, tratadas com somatotropina (P<0,05). Os resultados demonstram que o uso conjunto das técnicas de cultura primária de explantes por longo período e do QC-RT-PCR pode ser uma ferramenta para o estudo dos mecanismos envolvidos na modulação do metabolismo pela somatotropina no tecido adiposo. / In growing swine somatotropin (ST) treatment can reduce lipid deposition up to 90%. This effect seems to be a function of a number of alterations in adipose tissue metabolism, and include reductions in fatty acid synthetase activity (FAS), a rate-limiting enzyme in the de novo pathway of lipid synthesis. Activity of FAS appears to be regulated primarily by alterations in mRNA abundance. Thus it is important to understand ST effects and this require an adequate test model. The present paper validated the combined use of two techniques: 1) RT-PCR quantitative competitive (QC-RT-PCR), which allows monitoring gene expression of FAS even when very small quantities of tissue are available; and 2) use of cultures of adipose tissue explants, which allow to subject tissue samples to a large number of treatments. Long-term cultures allow evaluation of the chronic effects of somatotropin. Primers were constructed to generate a 307 bp native amplicon and an anti-sense deletion primer allowed amplification of a 243 bp competitive sequence. Amplicons were subsequently cloned,fragments. Results from amplifications were evaluated using the standard curve developed earlier. Results, consistent with the literature, demonstrated a reduction in the enzymatic activity of FAS in adipose tissue incubated with pST for 48 hours (46,4 vs. 35,8 nmoles/mg.min; P<0,05). Consistent with the activity data, and literature data using other methodologies, we observed a 40% reduction in FAS mRNA abundance in adipose tissue cultures treated with pST (P<0,05). Results demonstrate that the combined use of long-term primary cultures of adipose tissue explants and QC-RT-PCR can be a useful tool to study the mechanisms involved in somatotropin modulation of adipose tissue metabolism.

A cicatrização de feridas crônicas e de defeitos complexos representam desafios para a cirurgia plástica reconstrutiva. Novos tratamentos emergiram com a utilização de células tronco mesenquimais, com especial interesse para as derivadas de tecido adiposo (CTMs-TA), por possuir algumas vantagens em relação às derivadas da medula óssea. Algumas doenças poderiam se beneficiar com o uso das CTMs-TA, em particular, as feridas de pacientes portadores de anemia falciforme que ainda representam um desafio terapêutico. Neste estudo, investigou-se a existência de possíveis áreas doadoras preferenciais de CTMs-TA no tecido adiposo (TA) por meio da comparação de aspectos qualitativos e quantitativos das CTMs-TA derivadas de cinco diferentes áreas corporais. Posteriormente, analisou-se a influência do sobrenadante dessas células, rico em citocinas e fatores de crescimento, sobre a migração de fibroblastos de indivíduos normais e de portadores de anemia falciforme in vitro. Não foram observadas diferenças qualitativas entre as CTMs-TA das cinco áreas analisadas. A região do dorso apresentou número maior de CTMs, com diferença significativa em relação à região das coxas. A adição de sobrenadante produzido por CTMs-TA demonstrou aumento da velocidade de migração dos fibroblastos de forma similar para os normais e os falciformes. O microambiente desfavorável presente nas feridas falciformes parece exercer importante influência sobre esses fibroblastos, pois uma vez corrigido o microambiente com os meios de cultivo apropriados, as células apresentaram taxa de duplicação e velocidade de migração semelhante à dos fibroblastos normais in vitro. / The healing of chronic wounds and complex defects represents challenges for reconstructive plastic surgery. New treatments have emerged with the use of multipotent mesenchymal cells, with special interest for the adipose-derived stem cells (ADSCs) as it has some advantages over the bone marrow-derived. Some diseases could benefit from the use of ADSCs, in particular, the wounds of patients with sickle cell anemia that still represent a therapeutic challenge. In this study, we investigated the existence of possible preferential donor areas of ADSCs in adipose tissue by comparing qualitative and quantitative aspects of ADSCs derived from five different body areas. Later, we analyzed the influence of the supernatant of these cells, rich in cytokines and growth factors, on the migration of fibroblasts from healthy individuals and from patients with sickle cell anemia in vitro. No qualitative differences were observed among the ADSCs of the five areas analyzed. The dorsum presented a higher number of ADSCs, with a significant difference in relation to the thigh. Addition of supernatant produced by ADSCs has been shown to increase the rate of migration of fibroblasts in a similar way to healthy and sickle cells. The unfavorable microenvironment present in sickle wounds seems to exert a significant influence on these fibroblasts because once the microenvironment was corrected with the appropriate culture media, the cells had a doubling rate and migration rate similar to normal fibroblasts in vitro.

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do ácido linoléico conjugado (CLA), especificamente do isômero trans-10, cis-12 em culturas de explante de tecido adiposo de suínos, em crescimento. / The objective of this study was to evaluate the effects of conjugated linoleic acid (CLA), specifically the tnas-10, cis-12 isomer on cultures of adipose tissue explants from growing pigs.

A suplementação dietética com AGCM induz resistência à insulina, redução de peso ponderal e aumento da adiposidade em ratos Wistar. Adipócitos isolados apresentam reduzidas captação de glicose estimulada por insulina e atividade/fosforilação da proteína AMPK. A expressão protéica do IR no tecido hepático está aumentada em animais tratados com AGCM com redução do grau de fosforilação, enquanto que o grau de fosforilação da proteína AKT permaneceu semelhante entre os grupos. Ilhotas pancreáticas isoladas apresentam redução na secreção de insulina quando incubadas com altas concentrações de glicose, diminuição do conteúdo total de insulina, hipersensibilidade a leucina e/ou arginina e aumento do percentual de morte celular com diminuída expressão da proteína AKT_1 . Desta forma, utilização em longo prazo dessa estratégia nutricional pode interferir no crescimento normal do indivíduo, na sensibilidade à insulina e possívelmente, desenvolvimento e instalação do diabetes. / The introduction of MCFA into diet induces insulin resistance, reduced body weight gain, and increased adiposity in Wistar rats. Isolated adipocytes have reduced insulin induced glucose uptake and phosphorylation/activation of AMPK protein. The insulin receptor protein expression is increased in liver of MCFA fed rats accompanied by reduced tyrosine phosphorylation, with similar AKT serine phosphorylation. Isolated pancreatic islets had reduced glucose stimulated insulin secretion due to high glucose exposure and reduced insulin content; higher insulin secretion induced by leucine and arginine, and increased apoptosis with reduced AKT protein level. In these regard, the chronic ingestion of MCFA may interfere with normal body growth, with the insulin sensitivity and may participate with the development of diabetes.