INTRODUÇÃO O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 8 milhões de mortes por ano, segundo dados da OMS. As mortes por câncer são provocadas por tumores que se originam em órgãos como pulmão, fígado, estômago, intestino, mama e esôfago. As células-tronco mesenquimais (CTM) foram identificadas em vários órgãos e estudos da sua interação com células tumorais têm apresentado resultados indicando ação inibitória sobre alguns tipos de tumores. Para explorar essa questão foram analisados os efeitos sobre células tumorais de carcinoma hepatocelular humano (HepG-2) do meio condicionado (MC) obtido do cultivo de CTM isoladas de tecido adiposo (TA), líquido amniótico (LA) e geleia de Wharton (GW). MÉTODOS Os MCs foram coletados após 24 horas de incubação das CTM sub-confluentes com ?-MEM contendo 20% de soro fetal bovino (SFB). Os MCs foram centrifugados e passados através de filtros de 0,22 ?M e armazenadas a -20 °C. O MC da própria célula HepG-2 foi utilizado como controle. Os efeitos dos MCs sobre a proliferação de células HepG-2 foram testados por ensaio MTT, em várias concentrações após 24 h de incubação. O ciclo celular de células HepG-2 tratadas com MC a 25%, 50% ou 75% foi analisado por citometria de fluxo (coloração IP) utilizando o software Modfit LT. A expressão dos genes bcl-2, bcl-6, CCND1 foi analisada por RT-PCR. A proliferação celular foi avaliada pela expressão das proteínas survivina, Bcl-2, PCNA e Ki-67 e pela quantificação de mitocôndrias com corante MitoTracker, assim como pelo potencial de membrana mitocondrial por corante JC-1 Mitoscreen utilizando equipamento de high content analysis. RESULTADOS Os meios condicionados de células-tronco de tecido adiposo (MC-TA) não alteraram a proliferação de células tumorais HepG-2 e os meios condicionados de células-tronco de líquido amniótico (MC-LA) e de geleia de Wharton (MC-GW) provocam aumento da proliferação, confirmada pela contagem de células com núcleos corados com Hoescht 33342. A análise de alterações do ciclo celular demonstrou que a exposição de células HepG-2 aos meios MC-LA diminuem as células na fase G0/G1 e aumentam na fase G2/M do ciclo celular. A expressão dos genes CCND1, Bcl2 e Bcl6 que estão relacionados à proliferação e morte celular não apresentaram alteração. A quantificação das proteínas PCNA e survivina não apresentou alteração sob efeito dos MC, porém a comparação direta entre células tratadas com MC-LA e MC-TA indicou a tendência das células tratadas com MC-LA proliferarem. O percentual de células HepG-2 expressando a proteína Ki-67 foi significativamente menor em relação ao controle quando tratadas com MC-TA, não apresentando diferenças quando tratadas com MC-LA e MC-GW. A contagem de mitocôndrias evidenciou aumento de mitocôndrias nas células HepG-2 tratadas com MC-LA e efeito não significativo dos tratamentos com MC-TA e MC-GW. A diferença do potencial de membrana mitocondrial por JC-1 apresentou aumento da polarização nas células HepG-2 cultivadas com MC-TA. CONCLUSÃO Os resultados confirmam que as células-tronco mesenquimais diferem de acordo com a sua origem tecidual em sua ação na proliferação das células HepG-2. Mais estudos são necessários para estabelecer a causa destas ações, que não parecem ser devido a mediadores mais comuns na proliferação e morte celular / INTRODUCTION Cancer is a leading cause of death worldwide, accounting for about 8 million deaths per year, according to WHO data. Cancer deaths are caused by tumors that originate in organs such as lung, liver, stomach, bowel, breast and esophagus. The mesenchymal stem cells (MSCs) have been identified in many organs and studies of their interaction with tumor cells have shown results indicating an inhibitory effect on some types of tumors. To explore this question the effects of the conditioned medium (CM) obtained from mesenchymal stem cell isolated from adipose tissue (AT), amniotic fluid (AF) and Wharton jelly (WJ) on tumor cells of human hepatocellular carcinoma (HepG-2) were analyzed. METHODS The MSC CM was collected after 24 hours incubation of sub confluent MSC with ?-MEM containing 20% fetal bovine serum (FBS). The MSC CM were centrifuged and passed through 0.22 ?M filter and stored at -20° C. The CM of HepG-2 cell itself was used as control. The effects of contrast media on proliferation of HepG-2 cells were tested by MTT assay at various concentrations after 24 h of incubation. The cell cycle HepG-2 cells treated with CM at 25%, 50% or 75% was analyzed by flow cytometry (PI staining) using Modfit software LT. The expression of the genes Bcl-2, Bcl-6, CCND1 was analyzed by RT-PCR. Cell proliferation was assessed by the expression of survivin, Bcl-2, Ki-67 and PCNA proteins, and the quantization of mitochondrial by MitoTracker dye, as well as the mitochondrial membrane potential by JC-1 Mitoscreen dye using high content analysis equipment. RESULTS The conditioned media of mesenchymal stem cells (MSC) from adipose tissue (AT-CM) did not alter the proliferation of tumor HepG-2 cells and conditioned media of MSC cells from amniotic fluid (AF-CM) and Wharton jelly (WJ-CM) caused increased proliferation, confirmed by counting cells with nuclei stained with Hoechst 33342. The cell cycle analysis showed that exposure of HepG-2 cells to AF-CM means decrease the cells in G0 / G1 cell cycle phase and increase in phase G2 / M. The expression of Bcl2, Bcl6 and CCND1 genes that are related to proliferation and cell death did not change. The quantization of PCNA and survivin protein did not change under the effect of conditioned media, but a direct comparison between cells treated with AF-CM and AT-CM indicated the tendency of cells treated with AF-CM proliferate. The percentage of HepG-2 cells expressing the protein Ki-67 was significantly lower than the control when treated with AT-CM and no differences when treated with AF-CM and WJ-CM. The counting of mitochondria showed increased mitochondria in HepG-2 cells treated with AF-CM and no significant effect of treatment with WJ-CM and AT-CM. The difference in mitochondrial membrane potential by JC-1 showed an increase in polarization in HepG-2 cells cultured with AT-CM. CONCLUSION The results confirm that mesenchymal stem cells differ according to their tissue origin in its action on the proliferation of HepG-2 cells. More studies are needed to establish the cause of these actions, which seem to be not related to the most common mediators in cell proliferation and death

A cicatrização de feridas crônicas e de defeitos complexos representam desafios para a cirurgia plástica reconstrutiva. Novos tratamentos emergiram com a utilização de células tronco mesenquimais, com especial interesse para as derivadas de tecido adiposo (CTMs-TA), por possuir algumas vantagens em relação às derivadas da medula óssea. Algumas doenças poderiam se beneficiar com o uso das CTMs-TA, em particular, as feridas de pacientes portadores de anemia falciforme que ainda representam um desafio terapêutico. Neste estudo, investigou-se a existência de possíveis áreas doadoras preferenciais de CTMs-TA no tecido adiposo (TA) por meio da comparação de aspectos qualitativos e quantitativos das CTMs-TA derivadas de cinco diferentes áreas corporais. Posteriormente, analisou-se a influência do sobrenadante dessas células, rico em citocinas e fatores de crescimento, sobre a migração de fibroblastos de indivíduos normais e de portadores de anemia falciforme in vitro. Não foram observadas diferenças qualitativas entre as CTMs-TA das cinco áreas analisadas. A região do dorso apresentou número maior de CTMs, com diferença significativa em relação à região das coxas. A adição de sobrenadante produzido por CTMs-TA demonstrou aumento da velocidade de migração dos fibroblastos de forma similar para os normais e os falciformes. O microambiente desfavorável presente nas feridas falciformes parece exercer importante influência sobre esses fibroblastos, pois uma vez corrigido o microambiente com os meios de cultivo apropriados, as células apresentaram taxa de duplicação e velocidade de migração semelhante à dos fibroblastos normais in vitro. / The healing of chronic wounds and complex defects represents challenges for reconstructive plastic surgery. New treatments have emerged with the use of multipotent mesenchymal cells, with special interest for the adipose-derived stem cells (ADSCs) as it has some advantages over the bone marrow-derived. Some diseases could benefit from the use of ADSCs, in particular, the wounds of patients with sickle cell anemia that still represent a therapeutic challenge. In this study, we investigated the existence of possible preferential donor areas of ADSCs in adipose tissue by comparing qualitative and quantitative aspects of ADSCs derived from five different body areas. Later, we analyzed the influence of the supernatant of these cells, rich in cytokines and growth factors, on the migration of fibroblasts from healthy individuals and from patients with sickle cell anemia in vitro. No qualitative differences were observed among the ADSCs of the five areas analyzed. The dorsum presented a higher number of ADSCs, with a significant difference in relation to the thigh. Addition of supernatant produced by ADSCs has been shown to increase the rate of migration of fibroblasts in a similar way to healthy and sickle cells. The unfavorable microenvironment present in sickle wounds seems to exert a significant influence on these fibroblasts because once the microenvironment was corrected with the appropriate culture media, the cells had a doubling rate and migration rate similar to normal fibroblasts in vitro.

Orientador: Carolina Pacheco Bertozzi / Abstract: The Franciscana dolphin (Pontoporia blanvillei) is a small odontocete impacted by anthropic activities (bycatch, habitat degradation). The hormonal measurement in biological matrices (feces, urine, blubber, milk, saliva, blow) has been increasingly used in aquatic mammals for certain reproductive parameters. The present study validated the method of extraction and measurement of testosterone and progesterone in blubber kept in two different temperatures (-20°C and -196°C), besides correlating the hormone concentration with gender, sexual maturity, age, stage of development, body length and occurrence of pregnancy. The carcasses were collected from stranded and bycatch dolphins of the coast of São Paulo. Blubber samples were collected and frozen at -20°C (n=101) and -196°C (liquid nitrogen) (n=28). The extraction was performed with a method described in literature and the hormonal analyses were done by enzyme immunoassay for the two hormones. An analysis was performed on two units of hormone concentration (ng/g and ng/mg). The inter-assay coefficient of variation was 6.89% for progesterone and 1.67% for testosterone, the intra-assay coefficient of variation was 7.82% for progesterone and 3.29% for testosterone. The progesterone assay presented parallelism F1.5= 0.87, p= 0.45 and testosterone presented F1.5= 3.79, p= 0.11. The mean extraction efficiency was 66% for progesterone and 70% for testosterone. The method of extraction and hormonal analysis was feasible for Pontoporia ... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: A toninha (Pontoporia blanvillei) é um pequeno odontoceto impactado pelas atividades antrópicas (capturas acidentais, degradação de habitat). A dosagem hormonal em diferentes matrizes (fezes, urina, tecido adiposo, leite, saliva, borrifo) tem sido cada vez mais utilizada em mamíferos aquáticos para determinar parâmetros reprodutivos. O objetivo deste estudo foi validar o método de extração e mensuração de testosterona e progesterona em camada de gordura subcutânea de carcaças de toninha armazenadas em duas temperaturas (-20°C e -196ºC), além de correlacionar as dosagens com parâmetros de sexo, maturidade gonadal, idade, estágio de desenvolvimento, comprimento total e ocorrência de prenhez. As amostras foram colhidas de carcaças provenientes de encalhe e captura acidental do litoral de São Paulo. Foram colhidos fragmentos de gordura, armazenados em freezer a -20°C (n=101) e em nitrogênio líquido (-196ºC) (n=28). A extração hormonal foi realizada com modificações a partir do método descrito em literatura e a dosagem foi feita por enzimaimunoensaio para os dois hormônios. Os resultados das análises estatísticas foram expressos em duas unidades de concentração de hormônio (ng/g e ng/mg). O coeficiente de variação inter-ensaio foi de 6,89% para progesterona e 1,67% para testosterona, o coeficiente de variação intra-ensaio foi de 7,82% para progesterona e 3,29% para testosterona. Os resultados do paralelismo para o ensaio de progesterona foi F1,5 =0,87 e p=0,45 e para testosterona ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Evidências na literatura demonstraram que o aumento da adiposidade confere maior suscetibilidade ao desenvolvimento de diabetes tipo 2, pois o tecido adiposo branco (TAB) atua na regulação da homeostasia energética e da sensibilidade à insulina através da sua atividade endócrina e de interações com reguladores neuroendócrinos. O treinamento físico aeróbio tem sido fortemente recomendado para a prevenção e tratamento do diabetes tipo 2, pois promove adaptações no metabolismo energético que contribuem diretamente para a melhora da resposta glicêmica e para o controle de peso corporal. Embora esteja claro na literatura o papel do treinamento físico contra o desenvolvimento de distúrbios no metabolismo da glicose e obesidade, uma lacuna de conhecimento ainda existe quando buscamos informações a respeito da participação metabólica do TAB na prevenção do diabetes tipo 2 através do treinamento físico aeróbio. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo testar a hipótese de que o efeito protetor do treinamento físico contra o desenvolvimento de diabetes tipo 2 é mediado por adaptações funcionais do TAB. Para isso, foram utilizados camundongos alimentados com dieta normocalórica e de cafeteria submetidos ou não ao treinamento físico aeróbio. O treinamento físico aeróbio foi eficaz para a prevenção do diabetes tipo 2, e essa resposta foi associada à menor adiposidade corporal resultante do aumento da lipólise e da capacidade oxidativa do TAB induzido pela maior ativação via da AMPK/ACC / Evidence in the literature have shown that increased adiposity confers greater susceptibility to developing type 2 diabetes and white adipose tissue (WAT) acts in the regulation of energy homeostasis and insulin sensibility through its endocrine activity and interaction with neuroendocrine regulators. Aerobic physical training has been strongly recommended for the prevention and treatment of type 2 diabetes because it promotes adaptations in the energy metabolism that contribute directly to the improvement of glycemic metabolism and body weight control. Although it is clear in the literature the role of physical training against the development of disturbances in the glucose metabolism and obesity, the role of WAT to prevent type 2 diabetes through physical training was poorly investigated. Thus, the present study aimed to test the hypothesis that the protective effect of physical training against the development of type 2 diabetes is mediated by functional adaptations of WAT. For this, we used mice fed with control or cafeteria diet and submitted or not to aerobic physical training. The physical training was effective for the prevention of type 2 diabetes, and this response was associated with lower body fat due to increased lipolysis and oxidative capacity of WAT induced by the activation of AMPK/ACC

A manutenção do estado progenitor durante o cultivo de células mesenquimais progenitoras derivadas do tecido adiposo (MSCs-TA), caracterizado pelo potencial de diferenciação e da capacidade de autorrenovação, é atualmente um dos maiores desafios da terapia celular. Sabendo da influência da angiogênese no desenvolvimento de tecidos de origem mesenquimal, avaliamos se um ambiente pro-angiogênico mimetizado em cultura forneceria condições para manutenção de um estado progenitor durante o processo de expansão celular. Utilizando como modelo de um ambiente pró-angiogênico o cultivo no meio EGM-2, o qual é suplementado pelos fatores de crescimento EGF, FGF-2, IGF e VEGF, nós demonstramos que a presença de tais fatores pró-angiogênicos é fundamental para a manutenção do estado progenitor de MSCs-TA em cultura. Verificamos que a presença de tais fatores de crescimento possibilitaram às MSCs-TA apresentarem um alto potencial de diferenciação adipogênico e osteogênico em comparação ao meio convencional DMEM/F12 e ao meio EBM, ausente de fatores. Além disso, o cultivo na presença de fatores pró-angiogênicos aumentou o potencial clonogênico das MSCs-TA, ao mesmo tempo em que aumentou a capacidade proliferativa destas células. Dentre os fatores de crescimento, EGF e FGF-2 foram responsáveis pelos efeitos mais robustos. Ao mesmo tempo, células cultivadas nas presença destas citocinas foram capazes de manter a morfologia fibroblastóide e apresentaram alta expressão do fator de pluripotência Klf-4. Em concordância com estes achados, o transplante subcutâneo de MSCs-TA cultivadas nestas condições mostrou que aquelas mantidas em EGM-2 geram um tecido semelhante ao tecido formado pela fração estromal vascular não cultivada. Estes resultados reforçam o papel do ambiente pró-angiogênico na manutenção do estado progenitor de MSCs-TA, e que tal estado foi proporcionado pela ação dos fatores de crescimento pró-angiogênicos EGF, FGF-2, IGF e VEGF nas células em cultivo, com destaque para as citocinas EGF e FGF-2. Em conclusão, o uso do ambiente pró-angiogênico no cultivo de MSCs-TA mostrou-se como uma abordagem promissora para a manutenção do estado progenitor destas células in vitro. / The maintenance of the progenitor state in the culture of adipose tissue derived- mesenchymal progenitor cell (TA-MSCs), characterized by the differentiation potential and self-renewal capability, is currently one of the major challenges of cell therapy. The information that the angiogenesis influences the development of mesenchymal tissues, has led us to evaluate how a pro-angiogenic environment mimicked in culture would provide conditions for maintaining a progenitor state during the cell expansion process. We designe a model for a pro-angiogenic environment in which cells grown in EGM-2 supplemented with the following growth factors: EGF, FGF-2, IGF and VEGF, and demonstrated that the presence of such pro-angiogenic growth factors was crucial for maintenance of the progenitor of AT-MSCs in culture. We observed that the presence of such growth factors allowed to AT-MSCs a high potential of adipogenic and osteogenic differentiation compared to conventional DMEM/F12 medium and the EBM medium, in the absence of the factors. Furthermore, the culture in presence of pro-angiogenic growth factors increased the clonogenic potential of AT-MSCs and increased the proliferative capability of these cells. Among the growth factors, EGF and FGF-2 were responsible for most robust effects. At the same time, cells cultured in the presence of these cytokines were able to maintaining the fibroblastoid morphology and presented high expression levels of Klf-4 pluripotency factor. In agreement with these observations, the subcutaneous transplantation of AT-MSCs cultured under these conditions showed that those cells kept in EGM-2 generated a tissue-like to tissue formed by the stromal vascular fraction uncultivated. These results reinforce the role of the pro-angiogenic environment in the maintenance of the progenitor state of AT-MSCs, and that such a state was provided by the action of the pro-angiogenic growth factors EGF, FGF-2, IGF and VEGF in cultured cells, highlighting EGF and FGF-2 cytokines. In conclusion, we showed that the use of a pro-angiogenic environment in AT-MSCs culture is a promising approach to the maintain the progenitor state of these cells in vitro.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A obesidade está associada com a inflamação crônica atribuída à liberação de citocinas e adipocinas, à homeostase desregulda da glicemia e à dislipidemia. Intervenções nutricionais são frequentemente acompanhadas por episódios repetidos de perda e recuperação do peso, fenômeno conhecido como efeito sanfona ou ciclagem da massa corporal. Foram avaliados os efeitos da ciclagem da massa corporal sobre os parâmetros: eficiência alimentar, massa corporal (MC), perfil lipídico, metabolismo de carboidratos, indíce de adiposidade corporal, marcadores inflamatórios, esteatose hepática e triglicerídeo (TG) hepático em camundongos C57BL/6 machos que ciclaram a massa corporal duas ou três vezes consecutivas pela alternância de dieta hiperlipídica (high-fat, HF) e dieta padrão (standard-chow,SC). Após cada ciclo de dieta HF, os animais ficavam cada vez mais pesados e, após cada ciclo de dieta SC, os animais perdiam cada vez menos peso. A ciclagem da massa corporal provocou flutuação nas reservas de gordura e nos lipídeos sanguíneos. O colesterol total dos animais, após mudança da dieta HF para dieta SC, apresentou redução dos seus valores, assim como os TG plasmáticos. No teste oral de tolerância à glicose, após o perído de ingestão da dieta HF, os animais apresentaram intolerância à glicose e, após a troca para dieta SC, os animais continuaram com intolerância à glicose. Em relação as adipocinas e citocinas, a leptina, resistina e o fator de necrose tumoral (TNF) alfa séricos aumentaram após o ciclo da dieta HF e diminuíram após a troca por dieta SC. Ao contrário, a adiponectina sérica diminuiu após dieta HF e aumentou após troca por dieta SC. A IL-6 aumentou após ingestão da dieta HF, porém após a troca para dieta SC, a IL-6 permaneceu elevada. Enquanto o MCP-1 não variou durante as trocas de dietas. A expressão da adiponectina no tecido adiposo diminuiu após a dieta HF e os valores permaneceram reduzidos mesmo após a troca para dieta SC. As expressões da leptina e IL-6 no tecido adiposo aumentaram após dieta HF e continuaram aumentados mesmo após a troca para dieta SC. Da mesma forma, a esteatose hepática e os TG hepáticos não reduziram após a mudança da dieta HF para dieta SC. Tanto a dieta HF, como a ciclagem da massa corporal são relevantes para o remodelamento do tecido adiposo e provoca repercussões nos lipídios séricos, na homeostase da glicose, na secreção de adipocinas e provoca acúmulo de gordura no fígado. A troca para dieta SC e redução da MC não são capazes de normalizar a secreção de adipocinas no tecido adiposo e nem das citocinas pró-inflamatórias que permaneceram aumentadas. A esteatose hepática e os TG hepáticos também não são recuperados com a troca para dieta SC e redução da massa corporal. Estes resultados indicam que a ciclagem da MC cria um ambiente inflamatório, que é agraado com adipocinas alteradas, intolerância à glicose e acúmulo de gordura no fígado / Obesity is associated with low-grade chronic inflammation attributed to release of cytokines and adipokines and to dysregulated glucose-insulin homeostasis and dyslipidemia. Nutritional interventions such as dieting are often accompanied by repeated bouts of weight loss and regain, a phenomenon known as weight cycling (WC). In this work we studied the effects of WC on the parameters: feed efficiency, body mass (BM), blood lipids, carbohydrate metabolism, adiposity, inflammatory markers, hepatic steatosis and hepatic triglyceride (TG) in C57BL/6 male mice that WC two or three consecutive times by alternation of a high-fat (HF) diet with standard chow (SC). The body mass (BM) grew up in each cycle of HF feeding, and decreased after each cycle of SC feeding. After three consecutive WC, less marked was the BM reduction during SC feeding, while more severe was the BM increase during HF feeding. After each cycle of the HF diet body mass grew up in each cycle of HF feeding, became increasingly heavier and after each cycle of SC feeding, the animals lost less weight. The WC mass caused fluctuations in fat reserves and blood lipids total cholesterol, after shift the HF diet by SC diet showed a reduction of their values and plasma TG. The oral glucose tolerance test after the regular intake of HF diet, the animals showed glucose intolerance and, after switching to SC diet, the animals continued with glucose intolerance. Regarding the adipokines and cytokines, leptin, resistin and tumor necrosis factor alpha (TNF) serum increased after the cycle of HF feeding and decreased after the switch to SC feeding. In contrast, serum adiponectin decreased after HF feeding and increased after dietary exchange for SC. The IL-6 increased after intake of HF diet, but after switching to SC feeding, which remained elevated, while the MCP-1 was not changed during the shift of diets. The expression of adiponectin in adipose tissue decreased after the HF feeding and the values remained low even after switching to diet SC. The expression of leptin, IL-6 in the adipose tissue increased after HF feeding and remained elevated after the change to SC diet. Similarly, hepatic steatosis, and hepatic TG not reduced after the change to the diet HF diet SC. The results of the present study showed that both the HF diet and WC are relevant to BM evolution and fat pad remodeling in mice, with repercussion in blood lipids, homeostasis of glucose-insulin, adipokine levels and causes fat accumulation in the liver. The simple reduction of the BM during a WC is not able to recover the high levels of adipokines in the adipose tissue and serum as well as the pro-inflammatory cytokines. Hepatic steatosis and hepatic TG are not recovered with the change to SC feeding and body mass reduction. These findings indicate that the WC creates an inflammatory environment; with altered adipokines in association with WC which potentially aggravates the chronic inflammation attributed to dysregulated production and release of adipokines in mice

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O aumento da longevidade evidenciou nas mulheres os efeitos deletérios da deficiência ovariana como, a obesidade central e as doenças neurodegenerativas. Os hábitos alimentares modernos favorecem o consumo excessivo de gorduras, que contribuem para efeitos adversos sobre a saúde, incluindo alteração da composição corporal e da função nervosa. Assim, objetivamos estudar como a dieta hiperlipídica (DH), contendo óleo de soja, associada à perda da função gonadal influenciam o comportamento e o desenvolvimento corporal de ratas adultas. Ratas Wistar adultas foram ovariectomizadas (OVX) ou pseudo-operadas (C) e após 7d passaram a receber dieta contendo 4%(normo) ou 19%(hiperlípidica) de óleo de soja: C4 (n=29), OVX4 (n=30), C19 (n=30), OVX19 (n=30). Foram avaliados a massa e o comprimento corporais e a ingestão alimentar, e aspectos comportamentais de ansiedade, através de teste no Labirinto em Cruz Elevado (LCE); de busca pela novidade, por testes no Campo Vazado (CV); e aprendizagem/memória avaliada no labirinto aquático radial de 8 braços (LAROB). Ao final dos testes, os animais foram anestesiados, exsanguinados e o tecido adiposo intra-abdominal foi coletado e pesado. O soro foi utilizado para dosagens de triglicerídeo (TG), VLDL-c, colesterol (COL), HDL-c e estradiol. A ingestão alimentar média e o comprimento corporal não diferiram entre os grupos, mas o grupo OVX19 mostrou ganho significativo (13,6%) de massa corporal mais precocemente que os demais. O mesmo padrão foi observado quanto à massa de tecido adiposo, que foi 86% maior no OVX19. Os TG, VLDL e COL aumentaram cerca de 28% no OVX19, porém sem alteração de HDL-c (33,762,2 mg/dl). A DH e a ovariectomia se mostraram ansiogênicos e quando associados, a DH parece reverter o efeito ansiogênico da castração. Padrão similar de resposta foi observado na resposta ao teste de busca por novidade. No teste de aprendizagem/memória o OVX4 apresentou maior tempo de latência no primeiro dia, e todos responderam de forma semelhante nos demais dias. Conclui-se que a deficiência de estradiol acompanhada da ingestão de dieta hiperlipídica mantém o desempenho cognitivo, o comportamento emocional e a motivação, embora prejudique a adiposidade e o metabolismo lipídico. / The increase in longevity in women showed the deleterious effects of ovarian failure such as central obesity and neurodegenerative diseases. The modern feeding habits are associated with increased consumption of fats that contribute to adverse health effects, including changes in body composition and nervous function. The aim of present study was to assess how a hyperlipidic diet (HD) containing soybean oil, coupled with the loss of the gonadal function influence behavior and body development of adult rats. Adult female rats were ovariectomized (OVX) or pseudo-op (C) and after 7d began to receive a diet containing 4% (normo) or 19% (hyperlipidic) of soybean oil: C4 (n = 29), OVX4 (n = 30), C19 (n = 30), OVX19 (n = 30). We evaluated the length and body mass and food intake, and behavioral aspects of anxiety through the test Plus Maze (EPM), the search for novelty, for testing in the field not (CV) and learning / memory evaluated in the maze Water radial eight arms (LAROB). At the end of testing, animals were anesthetized, exsanguinated and intra-abdominal adipose tissue was collected and weighed. The serum was used for total serum triglyceride (TG), VLDL-C, cholesterol (COL), HDL-C and estradiol. The average dietary intake and body length did not differ between groups, but the group showed significant gain OVX19 (13.6%) body mass earlier than the others. The same pattern was observed for adipose tissue mass, which was 86% higher in OVX19. TG, VLDL and COL increased by about 28% in OVX19, but no change in HDL-C (33.76 2.2 mg / dl). The DH and ovariectomy proved anxieties and when combined, the DH appears to reverse the anxiogenic effect of castration. Similar pattern of response was observed in response to the test to search for novelty. In the test of learning/memory the OVX4 showed higher latency on the first day, and all responded similarly in the other days. It is concluded that deficiency of estradiol followed by the intake of fat diet keeps the cognitive, emotional behavior and motivation, although detrimental to adiposity and lipid metabolism.

Produtos de glicação avançada (AGE) contribuem para o estresse oxidativo e inflamatório, os quais constituem as bases celulares para as complicações a longo prazo do diabete melito (DM). A albumina é a principal proteína sérica modificada por AGE e afeta adversamente o metabolismo de lípides e a resposta infamatória em macrófagos, a função das ilhotas pancreáticas e a sensibilidade insulínica no músculo. Neste estudo, avaliamos o efeito da administração crônica de albumina AGE, associada ou não ao tratamento com N-acetilcisteína (NAC), sobre a sensibilidade periférica à insulina, infiltrado total e perfil de macrófagos, transcriptoma do tecido adiposo periepididimal e padrão de diferenciação de macrófagos peritoneais em ratos saudáveis. Albumina AGE foi produzida pela incubação de albumina de rato com glicolaldeído 10 mM, durante 4 dias a 37 °C, em agitação, no escuro. Albumina controle (C) foi preparada na presença de PBS apenas. Ratos Wistar com 4 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n = 7-8), os quais receberam injeção intraperitoneal diária de albumina C ou albumina AGE (20 mg/Kg/dia) concomitantemente ou não a administração da NAC (600mg/L de água) (grupos albumina C + NAC e albumina AGE + NAC), durante 90 dias consecutivos. Parâmetros bioquímicos foram determinados por técnicas enzimáticas, peroxidação lipídica, pela medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) na urina, expressão gênica, por RT-qPCR, e conteúdo proteico, por imuno-histoquímica. AGE total foi determinado por ELISA, carboximetil-lisina (CML) e pirralina (PYR), por cromatografia líquida/espectrometria de massa. O tecido adiposo periepididimal foi analisado por estereologia. A concentração de AGE total, CML e PYR foi, respectivamente, 9,2, 7000 e 235 vezes maior na albumina AGE em comparação à C. Consumo de ração, massa corporal, pressão arterial sistólica e concentração plasmática de colesterol total, triglicérides, ácidos graxos livres, glicose, insulina, ureia, creatinina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e excreção urinária de proteínas (24 h) foram semelhantes entre os grupos. A NAC reduziu em 1,4 e 1,6 vezes a concentração urinária de TBARS nos animais tratados com albumina AGE + NAC, em comparação aos grupos AGE e C+NAC, respectivamente. A albumina AGE reduziu em, aproximadamente, 1,4 vezes a sensibilidade à insulina em comparação ao C, o que foi prevenido pela NAC. O peso relativo do tecido adiposo periepididimal, a fração de área e o volume dos adipócitos foram semelhantes entre os grupos experimentais. Maior infiltrado macrofágico, (células F4/80 positivas), foi observado nos animais tratados com albumina AGE (1,3 x), o que também foi prevenido pela NAC. CD11b e CD206 permaneceram inalterados. O tratamento com albumina AGE também não alterou a expressão do mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2, Il12. No entanto, Itgam (CD11b - M1) e Mrc foram reduzidos no grupo AGE + NAC em comparação a C + NAC (2 e 1,9 x) e AGE (1,8 e 1,5 x, respectivamente). Aumento do mRNA de Slc2a4 (GLUT-4) e Ppara foi observado nos animais tratados com albumina AGE + NAC em comparação a C + NAC (Slc2a4: 1,6; Ppara 2,2 x) e AGE (2,3; 3,3 x). A albumina AGE contribuiu para maior expressão do Col12a1 (3,1 x) em relação ao C. Análise de macrófagos isolados da cavidade peritoneal apontaram elevação no mRNA de Il6 (2,6 x) e Ddost (1,4 x) no grupo AGE em relação ao C. Ddost também foi aumentado (1,2 x) no grupo AGE + NAC quando comparado ao C+NAC. Além disso, a NAC favoreceu o aumento do Arg1 (arginase 1) nos grupos albumina C + NAC (2,5 x) e AGE + NAC (2,6 x) quando comparados aos seus respectivos controles. Em conclusão, a albumina AGE favorece o infiltrado de macrófagos no tecido adiposo o que evidencia a sensibilização deste território à ação dos AGE e pode, a longo prazo, contribuir para piora na resistência à insulina, observada neste modelo animal. A NAC antagoniza os efeitos da albumina AGE e exerce, por si, efeitos benéficos sobre o perfil de diferenciação de macrófagos no tecido adiposo e peritônio, resposta inflamatória, peroxidação lipídica e resistência insulínica. A NAC pode ser uma ferramenta útil na prevenção das ações dos AGE sobre o desenvolvimento de resistência insulínica e complicações do DM / [Thesis]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2016\". Advanced glycation end-products (AGE) contribute to oxidative and inflammatory stress, which constitute the cellular basis for long-term complications of diabetes mellitus (DM). Albumin is the major serum protein modified by AGE and adversely affects macrophage lipid metabolism and inflammatory response, pancreatic islet function and muscle insulin sensitivity. We investigated the effect of chronic administration of AGE-albumin, associated or not with N-acetylcysteine (NAC) treatment, in peripheral insulin sensitivity, macrophage infiltration and polarization and transcriptome of periepididimal adipose tissue and peritoneal macrophage differentiation in healthy rats. AGE-albumin was prepared by incubating rat albumin with 10 mM glycolaldehyde for 4 days, 37 °C, under shaker, in the dark. Control albumin (C) was incubated with PBS alone. Four-weeks old male Wistar rats (n = 7-8/group) were randomized into four groups receiving daily intraperitoneal injections of C or AGE albumin (20 mg/kg/day) alone or together with NAC (600mg/L drinking water) (C + NAC albumin and AGE + NAC albumin), for 90 consecutive days. Biochemical parameters were determined by enzymatic techniques, lipid peroxidation by the measurement of urinary thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), gene expression by RT-qPCR and protein content by immunohistochemistry. Total AGE was determined by ELISA and carboxymethyllysine (CML) and pyrraline (PYR) by liquid chromatography/ mass spectrometry. Periepididimal adipose tissue was analyzed by stereology. Total AGE concentration, CML and PYR were, respectively, 9.2, 7000 and 235 times higher in AGE albumin as compared to C. Food consumption, body weight, systolic blood pressure and plasma total cholesterol, triglycerides, free fatty acids, glucose, insulin, urea, creatinine, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and urinary protein excretion (24 h) were similar among groups. NAC reduced urinary TBARS in AGE + NAC group as compared to AGE (1.4 x) and C + NAC (1.6 x), respectively. AGE albumin reduced 1.4 times the insulin sensitivity as compared to C albumin; this was prevented by NAC. Adipose tissue relative weight, adipocyte area fraction and volume were similar among groups. A higher (1.3 x) macrophage infiltrate (F4/80 positive cells) was observed in AGE albumin treated animals in comparison to those treated with C albumin and this was prevented by NAC. CD11b and CD206 were unchanged as well as mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2 and Il12. Itgam (CD11b - M1) and Mrc (CD206 - M2) were reduced in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (2 and 1.9 x, respectively) and AGE (1.8 and 1.5 x, respectively). Increased Slc2a4 (GLUT-4) and Ppara mRNA were observed in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (Slc2a4: 1.6 x; Ppara: 2.2 x) and to AGE (Slc2a4: 2.3 x; Ppara: 3.3 x). AGE albumin increased the expression of Col12a1 in 3.1 times as compared to C albumin. In peritoneal macrophages there was an increase in Il6 (2.6 x) and Ddost (1.4 x) in AGE group as compared to C. Ddost was also 1.2 times increased in AGE + NAC as compared to C+NAC. NAC increased Arg1 (arginase 1) in C + NAC (2.5 x) and AGE + NAC (2.6 x) as compared to their respective controls. In conclusion, AGE albumin favors macrophage infiltration in adipose tissue promoting over time tissue sensitization to AGE that may contribute to worsening insulin resistance in this animal model. NAC antagonizes the effects of AGE albumin and by itself has beneficial effects in macrophage differentiation in adipose tissue and peritoneal cavity, inflammatory response, lipid peroxidation and insulin sensitivity. NAC may be a useful tool in the prevention of AGE actions on the development of insulin resistance and long-term complications of DM

INTRODUÇÃO O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 8 milhões de mortes por ano, segundo dados da OMS. As mortes por câncer são provocadas por tumores que se originam em órgãos como pulmão, fígado, estômago, intestino, mama e esôfago. As células-tronco mesenquimais (CTM) foram identificadas em vários órgãos e estudos da sua interação com células tumorais têm apresentado resultados indicando ação inibitória sobre alguns tipos de tumores. Para explorar essa questão foram analisados os efeitos sobre células tumorais de carcinoma hepatocelular humano (HepG-2) do meio condicionado (MC) obtido do cultivo de CTM isoladas de tecido adiposo (TA), líquido amniótico (LA) e geleia de Wharton (GW). MÉTODOS Os MCs foram coletados após 24 horas de incubação das CTM sub-confluentes com ?-MEM contendo 20% de soro fetal bovino (SFB). Os MCs foram centrifugados e passados através de filtros de 0,22 ?M e armazenadas a -20 °C. O MC da própria célula HepG-2 foi utilizado como controle. Os efeitos dos MCs sobre a proliferação de células HepG-2 foram testados por ensaio MTT, em várias concentrações após 24 h de incubação. O ciclo celular de células HepG-2 tratadas com MC a 25%, 50% ou 75% foi analisado por citometria de fluxo (coloração IP) utilizando o software Modfit LT. A expressão dos genes bcl-2, bcl-6, CCND1 foi analisada por RT-PCR. A proliferação celular foi avaliada pela expressão das proteínas survivina, Bcl-2, PCNA e Ki-67 e pela quantificação de mitocôndrias com corante MitoTracker, assim como pelo potencial de membrana mitocondrial por corante JC-1 Mitoscreen utilizando equipamento de high content analysis. RESULTADOS Os meios condicionados de células-tronco de tecido adiposo (MC-TA) não alteraram a proliferação de células tumorais HepG-2 e os meios condicionados de células-tronco de líquido amniótico (MC-LA) e de geleia de Wharton (MC-GW) provocam aumento da proliferação, confirmada pela contagem de células com núcleos corados com Hoescht 33342. A análise de alterações do ciclo celular demonstrou que a exposição de células HepG-2 aos meios MC-LA diminuem as células na fase G0/G1 e aumentam na fase G2/M do ciclo celular. A expressão dos genes CCND1, Bcl2 e Bcl6 que estão relacionados à proliferação e morte celular não apresentaram alteração. A quantificação das proteínas PCNA e survivina não apresentou alteração sob efeito dos MC, porém a comparação direta entre células tratadas com MC-LA e MC-TA indicou a tendência das células tratadas com MC-LA proliferarem. O percentual de células HepG-2 expressando a proteína Ki-67 foi significativamente menor em relação ao controle quando tratadas com MC-TA, não apresentando diferenças quando tratadas com MC-LA e MC-GW. A contagem de mitocôndrias evidenciou aumento de mitocôndrias nas células HepG-2 tratadas com MC-LA e efeito não significativo dos tratamentos com MC-TA e MC-GW. A diferença do potencial de membrana mitocondrial por JC-1 apresentou aumento da polarização nas células HepG-2 cultivadas com MC-TA. CONCLUSÃO Os resultados confirmam que as células-tronco mesenquimais diferem de acordo com a sua origem tecidual em sua ação na proliferação das células HepG-2. Mais estudos são necessários para estabelecer a causa destas ações, que não parecem ser devido a mediadores mais comuns na proliferação e morte celular / INTRODUCTION Cancer is a leading cause of death worldwide, accounting for about 8 million deaths per year, according to WHO data. Cancer deaths are caused by tumors that originate in organs such as lung, liver, stomach, bowel, breast and esophagus. The mesenchymal stem cells (MSCs) have been identified in many organs and studies of their interaction with tumor cells have shown results indicating an inhibitory effect on some types of tumors. To explore this question the effects of the conditioned medium (CM) obtained from mesenchymal stem cell isolated from adipose tissue (AT), amniotic fluid (AF) and Wharton jelly (WJ) on tumor cells of human hepatocellular carcinoma (HepG-2) were analyzed. METHODS The MSC CM was collected after 24 hours incubation of sub confluent MSC with ?-MEM containing 20% fetal bovine serum (FBS). The MSC CM were centrifuged and passed through 0.22 ?M filter and stored at -20° C. The CM of HepG-2 cell itself was used as control. The effects of contrast media on proliferation of HepG-2 cells were tested by MTT assay at various concentrations after 24 h of incubation. The cell cycle HepG-2 cells treated with CM at 25%, 50% or 75% was analyzed by flow cytometry (PI staining) using Modfit software LT. The expression of the genes Bcl-2, Bcl-6, CCND1 was analyzed by RT-PCR. Cell proliferation was assessed by the expression of survivin, Bcl-2, Ki-67 and PCNA proteins, and the quantization of mitochondrial by MitoTracker dye, as well as the mitochondrial membrane potential by JC-1 Mitoscreen dye using high content analysis equipment. RESULTS The conditioned media of mesenchymal stem cells (MSC) from adipose tissue (AT-CM) did not alter the proliferation of tumor HepG-2 cells and conditioned media of MSC cells from amniotic fluid (AF-CM) and Wharton jelly (WJ-CM) caused increased proliferation, confirmed by counting cells with nuclei stained with Hoechst 33342. The cell cycle analysis showed that exposure of HepG-2 cells to AF-CM means decrease the cells in G0 / G1 cell cycle phase and increase in phase G2 / M. The expression of Bcl2, Bcl6 and CCND1 genes that are related to proliferation and cell death did not change. The quantization of PCNA and survivin protein did not change under the effect of conditioned media, but a direct comparison between cells treated with AF-CM and AT-CM indicated the tendency of cells treated with AF-CM proliferate. The percentage of HepG-2 cells expressing the protein Ki-67 was significantly lower than the control when treated with AT-CM and no differences when treated with AF-CM and WJ-CM. The counting of mitochondria showed increased mitochondria in HepG-2 cells treated with AF-CM and no significant effect of treatment with WJ-CM and AT-CM. The difference in mitochondrial membrane potential by JC-1 showed an increase in polarization in HepG-2 cells cultured with AT-CM. CONCLUSION The results confirm that mesenchymal stem cells differ according to their tissue origin in its action on the proliferation of HepG-2 cells. More studies are needed to establish the cause of these actions, which seem to be not related to the most common mediators in cell proliferation and death

Na Síndrome Metabólica, ações lipotóxicas e glicotóxicas contribuem para a aceleração do processo aterogênico cuja base é a inflamação. O tecido adiposo epicárdico vem sendo reconhecido como metabolicamente ativo e foi relacionado à elevação da produção de citocinas e adipocinas inflamatórias e aumento de DAC. Pioglitazona e Sinvastatina comprovadamente atuam como drogas pleiotrópicas na redução do processo inflamatório sistêmico. O presente estudo teve como objetivo principal avaliar possíveis correlações entre a presença de citocinas inflamatórias plasmáticas versus teciduais e a resposta de ambas à terapia medicamentosa. Para tanto, foram utilizadas monoterapia com Sinvastatina ou Pioglitazona e terapia combinada Pioglitazona+Sinvastatina e acompanhadas as variáveis lipídicas, glicêmicas e inflamatórias sistêmicas, células e citocinas inflamatórias em TAE, um tipo de tecido adiposo branco visceral instalado nas adjacências de focos ateroscleróticos em artérias coronárias de pacientes portadores de DAC e SMet. O estudo envolveu 73 pacientes com DAC multiarterial, avaliada pela cinecoronariografia e SMet que foram submetidos a revascularização e 20 pacientes submetidos à cirurgia valvar para substituição de valva mitral. Os pacientes com DAC eram incluídos de forma não aleatória a um dos 4 subgrupos: controle (n = 17), Simvastatina (20 mg / dia, n = 20), Pioglitazona (15 mg ou 30 mg / dia, n = 18) e Simvastatina + Pioglitazona (20 mg / dia + 15 mg ou 30 mg / dia, respectivamente, n = 18). Amostras de tecido adiposo epicárdico foram obtidas durante a cirurgia. Infiltração de macrófagos, linfócitos e secreção adipocitocinas foram investigados por coloração imunohistoquímica e comparados aos biomarcadores inflamatórios plasmáticos. Os resultados mostraram que a infiltração de macrófagos e a presença de citocinas pró-inflamatórias tais como TNF-, IL-6, leptina and resistina foram reduzidas em TAE de pacientes DAC/SMet após monoterapia com Pioglitazona. Os pacientes tratados apenas com Sinvastatina apresentaram os menores valores plasmáticos de leptina, resistina and MCP-1. Pioglitazona+Sinvastatina foram associadas aos menores valores plasmáticos de IL-6, TNF-, resistina, ADMA, MMP-9 em comparação ao grupo de pacientes não tratados. Além disso, a terapia combinada revelou a mais alta concentração de adiponectina plasmática concomitante ao menor valor de PCRus. Esses achados refletiram não só a condição plasmática como se correlacionaram positivamente à condição tecidual mostrada pela porcentagem média de área ocupada por macrófagos no TAE e a quantidade de PCRus presente no plasma após os tratamentos. Houve correlação positiva também entre citocinas sistêmicas e teciduais após os tratamentos, exceto para o TNF- após o tratamento com sinvastatina ( r = - 0,025, p = 0,33) e leptina após o tratamento com pioglitazona (r = -0,877, p <0,0001). Nos pacientes tratados com Sinvastatina, os fragmentos de TAE apresentaram agregados de linfócitos T, B e macrófagos concentrados na borda e ao redor de vasos sanguíneos / In the Metabolic Syndrome, the concentration of free fatty acids and the elevation of glycemia result in lipotoxic and glycotoxic actions, respectively, which contribute to accelerate the atherogenic process. (MS). Inapropriate secretion of adipocytokines plays a critical role in chronic inflammatory states associated with obesity-linked diseases, such as type 2 diabetes and atherosclerosis. The pleiotropic anti-inflammatory action of Simvastatin and/or Pioglitazone may counteract such systemic effects but its influence upon human epicardial adipose tissue is unknown. To assess the anti-inflammatory action of Simvastatin, Pioglitazone or both in epicardial adipose tissue in patients with coronary artery disease (CAD) and metabolic syndrome. The study comprised 73 patients with multivessel CAD, evaluated by cinecoronariography, and MS who underwent bypass grafting and 20 valvar patients who underwent surgery for mitral valve replacement. The 73 who underwent elective bypass grafting were non-randomly allocated to one of 4 subgroups: control (n=17), Simvastatin alone (20 mg/day, n=20), Pioglitazone alone (15 mg or 30 mg/day, n=18), or Simvastatin+Pioglitazone (20 mg/day + 15 mg or 30 mg/day, respectively, n=18). Epicardial adipose tissue sample was obtained during surgery. Infiltration of macrophages, lymphocytes and adipocytokines secretion were investigated by immunohistochemical staining and compared to plasma inflammatory biomarkers. Among CAD/MS patients, treatment with Simvastatin alone, Pioglitazone alone and Simvastatin+Pioglitazone significantly reduced plasma CRP and cytokines compared with control group. Monotherapy with Simvastatin significantly reduced plasma IL-6, leptin, resistin, MCP-1 (p<0.001 for all), whereas monotherapy with Pioglitazone reduced IL-6, TNF-, resistin and MMP-9 (p<0.001 for all) compared with control group. Simvastatin+Pioglitazone treatment reduced more plasmatic variables (IL-6, TNF-, resistin, ADMA and MMP-9 vs. control group (p<0.001). All treatments increased adiponectin plasma levels (p<0.001). In the combined treatment group, higher concentration in plasma adiponectin and lower hsCRP, were found simultaneously. There was positive correlation between mean percentage macrophages area in EAT and plasma hsCRP; also between systemic and tecidual citokynes after the treatments, except for TNF- after treatment with simvastatin (r = -0.025, p = 0.33) and leptin after treatment with pioglitazone (r = -0.877, p <0.0001). In fat fragments of patients treated with Simvastatin, T- and B-lymphocytes, and macrophages clusters concentrated near the edge or around blood vessels were observed by first time. In patients with CAD and MS treatment with Pioglitazone, Sinvastatin or combination can substantially reduce both epicardial tissue and plasma inflammatory markers. Such tissue effects may contribute to the control of coronary atherosclerosis progression