Anexina A5 (ANXA5) é uma proteína intracelular humana de 36kDa com alta afinidade pela fosfatidilserina que é seletivamente externalizada na superfície de células apoptóticas. A apoptose apresenta um papel importante na fisiologia normal e em numerosos estados patológicos. A aplicação clínica da ANXA5 em imagem da apoptose tem sido desenvolvida em oncologia, transplante de órgãos e doenças cardiovasculares. Várias estratégias para radiomarcação da proteína têm sido descritas, incluindo marcação direta, derivatização com quelante bifuncional (BFC), produção de proteína mutante ou peptídeos análogos. Muitas técnicas de marcação com 99mTc têm sido descritas utilizando diferentes núcleos, tais como [Tc=O]+3, [99mTc]HYNIC, [TcºN]+2 e [Tc(CO3)]+1. Neste estudo, avaliamos a influência do núcleo de 99mTc no comportamento biológico e propriedades físico-químicas da anexina radiomarcada. A radiomarcação utilizando o núcleo [TcºN]+2 foi realizada em duas etapas incluindo a reação do 99mTcO4 - com SDH na presença de SnCl2 e PDTA para obter o intermediário 99mTcN-SDH, seguida da adição de ANXA5. Os resultados obtidos não estão em acordo com a literatura, apesar da alta eficiência na produção do intermediário. O núcleo [Tc=O]+3 foi produzido usando a etilenodicisteina 7 (EC) como BFC. Para derivatização empregou-se o TSTU para obter o éster succinato correspondente. Diferentes razões de ANXA5:EC foram estudadas e todas as condições de marcação resultaram em alta pureza radioquímica, porém diferenças foram observadas na lipofilicidade, estabilidade, distribuição biológica e afinidade por células apoptóticas. A ANXA5-HYNIC também produziu a proteína radiomarcada com alta pureza radioquímica. A estabilidade das ANXA5 radiomarcadas foi avaliada após incubação à temperatura ambiente, a 28°C e em incubação em soro humano a 37°C. A análise destes resultados demonstrou que a ANXA5- EC-99mTc (razão 10-2) foi o composto mais estável em todas as condições estudadas. O ensaio de coeficiente de partição demonstrou que os compostos do EC apresentam uma menor lipossolubilidade em relação a ANXA5-HYNIC-99mTc. A atividade biológica das anexinas radiomarcadas foi avaliada em células PC-3 com apoptose radioinduzida demonstrando que a ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) foi a proteína com maior porcentagem de ligação específica. A biodistribuição in vivo das anexinas radiomarcadas demonstrou uma alta captação na região abdominal, especialmente para a ANXA5-HYNIC-99mTc. Os resultados indicam que ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) pode ser uma alternativa atrativa para o uso da ANXA5-HYNIC-99mTc em imagem de receptores de fosfatidilserina. / Annexin A5 (ANXA5) is an intracellular human protein of 36 kDa with high affinity for membrane-bound phosphatidylserine that is selectively exposed on the surface of cells undergoing apoptosis. Apoptosis is important in normal physiology and innumerous pathologic states. Clinical applications for ANXA5 imaging are being developed in oncology, organ transplantation and cardiovascular diseases. Many strategies to radiolabel the protein have been described, including direct labeling, derivatization through a bifunctional chelanting agent (BFC), production of mutated protein or peptide analogs. Several 99mTc-labeling techniques have been reported using different cores, including [Tc=O]+3, [Tc]HYNIC, [TcºN]+2 and [Tc(CO3)]+1. In this study, we evaluated the influence of 99mTc cores on biological behavior and physico-chemical properties of radiolabeled annexin. Radiolabeling procedure using [TcºN]+2 core was a two-step procedure including the reaction of 99mTcO4 - with SDH in the presence of SnCl2 and PDTA to obtain the intermediate 99mTcN-SDH, and successive addition of ANXA5. The results obtained were not satisfactory, despite the high efficiency in the production of the intermediate. The [Tc=O]+3 core was produced using the ethylenedicysteine (EC) as BFC. TSTU was 9 employed in the derivatization to produce the corresponding hydroxysuccinimide ester. Different ANXA5:EC ratios were studied and all labeling conditions resulted in high radiochemical yield but with differences in lipophilicity, stability, biological distribution and affinity for apoptotic cells. The HYNIC-ANXA5 also produced the labeled protein with high radiochemical yield. The stability of the radiolabeled ANXA5 was evaluated after storing at room temperature, at 2 - 8° C and in human serum at 37° C. The analysis of these results showed that the 99mTc-EC-ANXA5 (ratio 10-2) was the most stable compound in all the studied conditions. Partition coefficient assay resulted in lower lipophilicity for EC-complexes than 99mTc-HYNIC-ANXA5. The biological activity of radiolabeled annexins was studied in PC-3 cells with radiation induced apoptosis showing that 99mTc- EC-ANXA5 (ratio 10-2) was the protein with higher percentage of specific binding. In vivo biodistribution of the radiolabeled annexins showed a high uptake in the abdominal region, especially for the HYNIC compound. The results indicated that 99mTc-EC-ANXA5 (10-2) may be an attractive alternative to 99mTc-HYNIC-ANXA5 for the in vivo imaging of phosphatidylserine receptors.

Análogos da timidina têm sido marcados com diferentes radioisótopos devido ao seu potencial em monitorar a proliferação incontrolável de células. Considerando que o radioisótopo tecnécio-99m mantém ainda uma posição privilegiada devido às suas propriedades químicas e nucleares, este trabalho constituiu-se do desenvolvimento de uma nova técnica de marcação da timidina com o 99mTc, mediante o emprego de complexos organometálicos. Os objetivos do trabalho foram: a síntese do complexo organometálico carbonil-tecnécio-99m; marcação da timidina com este complexo precursor; avaliação da estabilidade; e avaliações radioquímicas e biológicas com animais sadios e portadores de tumor. A preparação do complexo precursor, utilizando o gás CO foi de fácil execução, assim como a marcação da timidina com este precursor, obtendo-se uma pureza radioquímica ≥ 97% e ≥ 94%, respectivamente. Sistemas cromatográficos com bons níveis de confiabilidade foram utilizados, podendo qualificar e quantificar as espécies radioquímicas. O resultado do estudo in vitro da lipofilicidade revelou que o a timidina radiomarcada é hidrofílica, com um coeficiente de partição (log P) de -1,48. O complexo precursor e a timidina radiomarcada apresentaram boa estabilidade radioquímica em até 6 h em temperatura ambiente. A estabilidade com soluções de cisteína e histidina apresentaram perdas entre oito e onze pontos percentuais para concentrações de até 300 mM. Os ensaios de biodistribuição em camundongos sadios indicaram que a timidina radiomarcada apresentou uma rápida depuração sangüínea e baixa captação nos demais órgãos, com predominância de excreção da droga pelo sistema urinário e hepatobiliar. A captação tumoral foi baixa, apresentando valores de 0,28 e 0,18 %DI/g para tumor de pulmão e mama, respectivamente. Os resultados obtidos sugerem mais investigações em outros modelos tumorais ou a modificação da estrutura da molécula orgânica que atua como ligante. / Thymidine analogs have been labeled with different radioisotopes due to their potential in monitoring the uncontrollable cell proliferation. Considering that the radioisotopes technetium-99m still keep a privileged position as a marker due to its chemical and nuclear properties, this dissertation was constituted by the developed of a new technique of labeling of thymidine analog with 99mTc, by means of the organometallic complex. The aims of this research were: synthesis of the organometallic complex technetium-99m-carbonyl, thymidine labeling with this precursor, evaluation of stability, and radiochemical e biological evaluation with healthy and tumor-bearing animals. The preparation of the organometallic precursor, using the CO gas, was easily achieved, as well as the labeling of thymidine with this precursor, resulting itself a radiochemical pureness of ≥ 97% and ≥ 94%, respectively. Chromatography systems with good levels of trustworthiness were used, ensuring the qualification and quantification of the radiochemical samples. The result of in vitro testing of lipophilicity disclosed that the radiolabeled complex is hydrophilic, with a partition coefficient (log P) of -1.48. The precursor complex and the radiolabeled have good radiochemical stability up to 6 h in room temperature. The cysteine and histidine challenge indicated losses between 8 and 11% for concentrations until 300 mM. The biodistribution assay in healthy mice revealed rapid blood clearance and low uptake by general organs with renal and hepatobiliary excretion. The tumor concentration was low with values of 0.28 and 0.18 %ID/g for lung and breast cancer, respectively. The results imply more studies in other tumor models or the modification of the structure of the organic molecule that act like ligand.

Anexina A5 (ANXA5) é uma proteína intracelular humana de 36kDa com alta afinidade pela fosfatidilserina que é seletivamente externalizada na superfície de células apoptóticas. A apoptose apresenta um papel importante na fisiologia normal e em numerosos estados patológicos. A aplicação clínica da ANXA5 em imagem da apoptose tem sido desenvolvida em oncologia, transplante de órgãos e doenças cardiovasculares. Várias estratégias para radiomarcação da proteína têm sido descritas, incluindo marcação direta, derivatização com quelante bifuncional (BFC), produção de proteína mutante ou peptídeos análogos. Muitas técnicas de marcação com 99mTc têm sido descritas utilizando diferentes núcleos, tais como [Tc=O]+3, [99mTc]HYNIC, [TcºN]+2 e [Tc(CO3)]+1. Neste estudo, avaliamos a influência do núcleo de 99mTc no comportamento biológico e propriedades físico-químicas da anexina radiomarcada. A radiomarcação utilizando o núcleo [TcºN]+2 foi realizada em duas etapas incluindo a reação do 99mTcO4 - com SDH na presença de SnCl2 e PDTA para obter o intermediário 99mTcN-SDH, seguida da adição de ANXA5. Os resultados obtidos não estão em acordo com a literatura, apesar da alta eficiência na produção do intermediário. O núcleo [Tc=O]+3 foi produzido usando a etilenodicisteina 7 (EC) como BFC. Para derivatização empregou-se o TSTU para obter o éster succinato correspondente. Diferentes razões de ANXA5:EC foram estudadas e todas as condições de marcação resultaram em alta pureza radioquímica, porém diferenças foram observadas na lipofilicidade, estabilidade, distribuição biológica e afinidade por células apoptóticas. A ANXA5-HYNIC também produziu a proteína radiomarcada com alta pureza radioquímica. A estabilidade das ANXA5 radiomarcadas foi avaliada após incubação à temperatura ambiente, a 28°C e em incubação em soro humano a 37°C. A análise destes resultados demonstrou que a ANXA5- EC-99mTc (razão 10-2) foi o composto mais estável em todas as condições estudadas. O ensaio de coeficiente de partição demonstrou que os compostos do EC apresentam uma menor lipossolubilidade em relação a ANXA5-HYNIC-99mTc. A atividade biológica das anexinas radiomarcadas foi avaliada em células PC-3 com apoptose radioinduzida demonstrando que a ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) foi a proteína com maior porcentagem de ligação específica. A biodistribuição in vivo das anexinas radiomarcadas demonstrou uma alta captação na região abdominal, especialmente para a ANXA5-HYNIC-99mTc. Os resultados indicam que ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) pode ser uma alternativa atrativa para o uso da ANXA5-HYNIC-99mTc em imagem de receptores de fosfatidilserina. / Annexin A5 (ANXA5) is an intracellular human protein of 36 kDa with high affinity for membrane-bound phosphatidylserine that is selectively exposed on the surface of cells undergoing apoptosis. Apoptosis is important in normal physiology and innumerous pathologic states. Clinical applications for ANXA5 imaging are being developed in oncology, organ transplantation and cardiovascular diseases. Many strategies to radiolabel the protein have been described, including direct labeling, derivatization through a bifunctional chelanting agent (BFC), production of mutated protein or peptide analogs. Several 99mTc-labeling techniques have been reported using different cores, including [Tc=O]+3, [Tc]HYNIC, [TcºN]+2 and [Tc(CO3)]+1. In this study, we evaluated the influence of 99mTc cores on biological behavior and physico-chemical properties of radiolabeled annexin. Radiolabeling procedure using [TcºN]+2 core was a two-step procedure including the reaction of 99mTcO4 - with SDH in the presence of SnCl2 and PDTA to obtain the intermediate 99mTcN-SDH, and successive addition of ANXA5. The results obtained were not satisfactory, despite the high efficiency in the production of the intermediate. The [Tc=O]+3 core was produced using the ethylenedicysteine (EC) as BFC. TSTU was 9 employed in the derivatization to produce the corresponding hydroxysuccinimide ester. Different ANXA5:EC ratios were studied and all labeling conditions resulted in high radiochemical yield but with differences in lipophilicity, stability, biological distribution and affinity for apoptotic cells. The HYNIC-ANXA5 also produced the labeled protein with high radiochemical yield. The stability of the radiolabeled ANXA5 was evaluated after storing at room temperature, at 2 - 8° C and in human serum at 37° C. The analysis of these results showed that the 99mTc-EC-ANXA5 (ratio 10-2) was the most stable compound in all the studied conditions. Partition coefficient assay resulted in lower lipophilicity for EC-complexes than 99mTc-HYNIC-ANXA5. The biological activity of radiolabeled annexins was studied in PC-3 cells with radiation induced apoptosis showing that 99mTc- EC-ANXA5 (ratio 10-2) was the protein with higher percentage of specific binding. In vivo biodistribution of the radiolabeled annexins showed a high uptake in the abdominal region, especially for the HYNIC compound. The results indicated that 99mTc-EC-ANXA5 (10-2) may be an attractive alternative to 99mTc-HYNIC-ANXA5 for the in vivo imaging of phosphatidylserine receptors.

Introdução: A incidência do melanoma cutâneo (MC) está crescendo mais rapidamente que a de qualquer outro câncer. Devido ao seu potencial para metástases e à falta de terapias efetivas para a maioria dos pacientes em estágio avançado, o diagnóstico precoce do MC é crucial. Alguns dos fatores prognósticos mais importantes no MC são a espessura de Breslow e a presença de metástase linfonodal. O Tecnécio-99m-sestamibi (MIBI) é um radiofármaco usado rotineiramente em cintilografias miocárdicas e tem conhecidas propriedades para detecção de tumores malignos, incluindo câncer de mama, tumores cerebrais e melanomas primários e metastáticos. Objetivo: Avaliar a correlação entre a espessura de Breslow e a intensidade da captação de MIBI (IC-MIBI) em lesões primárias de MC. Métodos: Foram selecionados pacientes com lesões clinica e dermatoscopicamente suspeitas de MC. Os pacientes receberam uma injeção intravenosa de 740 – 1110 MBq (20 mCi) de MIBI. Após 10 minutos, o equipamento gamma-probe foi usado para detectar a IC-MIBI na lesão cutânea e em 2 pontos equidistantes na pele normal. A razão entre as contagens radioativas na lesão e a média da pele normal foi considerada a IC-MIBI. A seguir, pacientes realizaram SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) do local da lesão e da região linfonodal correspondente. Exérese da lesão cutânea e exame anatomopatológico foram então realizados. Pacientes portadores de lesões com Breslow > 1 mm ou < 1mm com ulceração/regressão espontânea realizaram biópsia do linfonodo sentinela. Resultados: Dezesseis pacientes com 20 lesões foram estudados (8 homens, 8 mulheres, de 34 – 81 anos, média 61 anos). Quatorze lesões eram melanomas e 6 eram nevos melanocíticos (NM). Cinco lesões eram melanomas in situ. A média da espessura de Breslow foi de 0,45 mm (variação: 0,30 – 14,90 mm). A média da IC-MIBI foi 1,54 (±0.58) contagens radioativas nos MC e 1,04 (±0.10) nos NM (P = 0.007). Houve forte correlação positiva entre a IC-MIBI e a espessura de Breslow (rs = 0.74, P= 0.003). Analisando as lesões em categorias de Breslow, houve diferença estatisticamente significativa (P < 0.001) entre as lesões com Breslow < 1mm (IC-MIBI = 1.23 ± 0.28 contagens radioativas) e Breslow > 1 mm (IC-MIBI = 2.32 ± 0.32 contagens radioativas). Nenhum dos NM apareceu nas imagens de SPECT. Dos MC, 4 lesões, que apresentavam Breslow > 1mm, apareceram nas imagens de SPECT. Conclusão: Neste estudo, embora tenha demonstrado uma diferença significativa entre melanomas finos (< 1mm) e espessos (> 1mm), a IC-MIBI no local da lesão não foi diferente entre NM e melanomas finos ou in situ. Por isso, MIBI parece ser útil principalmente em melanomas espessos, o que também foi confirmado pela positividade do SPECT apenas nestes casos. Entretanto, a possibilidade de correlacionar a IC-MIBI com categorias de Breslow pode facilitar os procedimentos cirúrgicos, permitindo a remoção de melanomas com margens cirúrgicas adequadas e a realização ou não de biópsia de linfonodo sentinela em um mesmo momento cirúrgico, reduzindo morbidade e custos. / Introduction: Given its propensity to metastasize, and lack of effective therapies for most patients with advanced disease, early detection of melanoma is a clinical imperative. The most important prognostic factors are Breslow thickness and nodal metastases. Technetium-99m-sestamibi (MIBI) is a radiopharmaceutical used routinely for cardiologic scintigraphy and has also well-known tumor-seeking properties. It has been used successfully to detect various tumors, including breast cancer, brain tumors, and primary and metastatic melanoma. Objetive: This study has been designed in order to evaluate the correlation between Breslow thickness and MIBI uptake by primary CM lesions. Methods: Patients were recruited by a dermatologist on the grounds of a clinically and dermoscopically suspicious melanocytic lesion. Patients received intravenous injection of 740 – 1110 MBq (20 mCi) of MIBI. After 10 minutes, gamma-probe was used to detect the intensity of MIBI uptake by the cutaneous lesion and at two equidistant points on normal skin. The ratio number of radioactive counts at cutaneous lesion / mean of radioactive counts at normal skin was considered to determinate the MIBI uptake intensity (MIBI-UI). Then, SPECT imaging of the lesion site and respective lymph node region was obtained. After scintigraphy, exeresis of the cutaneous lesion and histological analysis were performed. Lesions with Breslow thickness > 1 mm or < 1 mm with ulceration/spontaneous regression underwent sentinel lymph node biopsy. Results: Sixteen patients with 20 lesions were investigated (8 males, 8 females, age range 34 – 81 years, mean 61 years). Fourteen lesions were CM and 6 were melanocytic nevi (MN). Five lesions were melanoma in situ. Breslow thickness median was 0.45 mm (range 0.30 - 14,9 mm). The mean MIBI-UI was 1.54 (±0.58) radioactive counts in CM and 1.04 (±0.10) radioactive counts in MN (P = 0.007). There was strong positive correlation between MIBI-UI and Breslow thickness (rs = 0.74, P= 0.003). Grouping the lesions on Breslow categories, there was a statistically significant difference (P < 0.001) between lesions with Breslow thickness < 1 mm (MIBI-UI = 1.23 ± 0.28 radioactive counts) and Breslow thickness > 1 mm (MIBI-UI = 2.32 ± 0.32 radioactive counts). None of the MN appeared at SPECT images. Of melanomas, 4 (28,6%) were SPECT positive at cutaneous site. All those were Breslow thickness > 1 mm. Conclusion: On this study, although there is a significant difference between thin (< 1 mm) and thick (> 1 mm) melanomas, MIBI intensity at the lesion site is not different between benign nevus and in situ or thin melanomas. Then, MIBI seems to be useful mainly in thick melanomas, as also confirmed by the positivity of the SPECT image only in these cases. However, the possibility of correlating MIBI uptake intensity with Breslow categories may facilitate surgical procedures, allowing to remove melanomas with appropriated surgical margins and to perform or not sentinel lymph node biopsy in the same surgical time, reducing morbidity and cost.

Introdução: A incidência do melanoma cutâneo (MC) está crescendo mais rapidamente que a de qualquer outro câncer. Devido ao seu potencial para metástases e à falta de terapias efetivas para a maioria dos pacientes em estágio avançado, o diagnóstico precoce do MC é crucial. Alguns dos fatores prognósticos mais importantes no MC são a espessura de Breslow e a presença de metástase linfonodal. O Tecnécio-99m-sestamibi (MIBI) é um radiofármaco usado rotineiramente em cintilografias miocárdicas e tem conhecidas propriedades para detecção de tumores malignos, incluindo câncer de mama, tumores cerebrais e melanomas primários e metastáticos. Objetivo: Avaliar a correlação entre a espessura de Breslow e a intensidade da captação de MIBI (IC-MIBI) em lesões primárias de MC. Métodos: Foram selecionados pacientes com lesões clinica e dermatoscopicamente suspeitas de MC. Os pacientes receberam uma injeção intravenosa de 740 – 1110 MBq (20 mCi) de MIBI. Após 10 minutos, o equipamento gamma-probe foi usado para detectar a IC-MIBI na lesão cutânea e em 2 pontos equidistantes na pele normal. A razão entre as contagens radioativas na lesão e a média da pele normal foi considerada a IC-MIBI. A seguir, pacientes realizaram SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) do local da lesão e da região linfonodal correspondente. Exérese da lesão cutânea e exame anatomopatológico foram então realizados. Pacientes portadores de lesões com Breslow > 1 mm ou < 1mm com ulceração/regressão espontânea realizaram biópsia do linfonodo sentinela. Resultados: Dezesseis pacientes com 20 lesões foram estudados (8 homens, 8 mulheres, de 34 – 81 anos, média 61 anos). Quatorze lesões eram melanomas e 6 eram nevos melanocíticos (NM). Cinco lesões eram melanomas in situ. A média da espessura de Breslow foi de 0,45 mm (variação: 0,30 – 14,90 mm). A média da IC-MIBI foi 1,54 (±0.58) contagens radioativas nos MC e 1,04 (±0.10) nos NM (P = 0.007). Houve forte correlação positiva entre a IC-MIBI e a espessura de Breslow (rs = 0.74, P= 0.003). Analisando as lesões em categorias de Breslow, houve diferença estatisticamente significativa (P < 0.001) entre as lesões com Breslow < 1mm (IC-MIBI = 1.23 ± 0.28 contagens radioativas) e Breslow > 1 mm (IC-MIBI = 2.32 ± 0.32 contagens radioativas). Nenhum dos NM apareceu nas imagens de SPECT. Dos MC, 4 lesões, que apresentavam Breslow > 1mm, apareceram nas imagens de SPECT. Conclusão: Neste estudo, embora tenha demonstrado uma diferença significativa entre melanomas finos (< 1mm) e espessos (> 1mm), a IC-MIBI no local da lesão não foi diferente entre NM e melanomas finos ou in situ. Por isso, MIBI parece ser útil principalmente em melanomas espessos, o que também foi confirmado pela positividade do SPECT apenas nestes casos. Entretanto, a possibilidade de correlacionar a IC-MIBI com categorias de Breslow pode facilitar os procedimentos cirúrgicos, permitindo a remoção de melanomas com margens cirúrgicas adequadas e a realização ou não de biópsia de linfonodo sentinela em um mesmo momento cirúrgico, reduzindo morbidade e custos. / Introduction: Given its propensity to metastasize, and lack of effective therapies for most patients with advanced disease, early detection of melanoma is a clinical imperative. The most important prognostic factors are Breslow thickness and nodal metastases. Technetium-99m-sestamibi (MIBI) is a radiopharmaceutical used routinely for cardiologic scintigraphy and has also well-known tumor-seeking properties. It has been used successfully to detect various tumors, including breast cancer, brain tumors, and primary and metastatic melanoma. Objetive: This study has been designed in order to evaluate the correlation between Breslow thickness and MIBI uptake by primary CM lesions. Methods: Patients were recruited by a dermatologist on the grounds of a clinically and dermoscopically suspicious melanocytic lesion. Patients received intravenous injection of 740 – 1110 MBq (20 mCi) of MIBI. After 10 minutes, gamma-probe was used to detect the intensity of MIBI uptake by the cutaneous lesion and at two equidistant points on normal skin. The ratio number of radioactive counts at cutaneous lesion / mean of radioactive counts at normal skin was considered to determinate the MIBI uptake intensity (MIBI-UI). Then, SPECT imaging of the lesion site and respective lymph node region was obtained. After scintigraphy, exeresis of the cutaneous lesion and histological analysis were performed. Lesions with Breslow thickness > 1 mm or < 1 mm with ulceration/spontaneous regression underwent sentinel lymph node biopsy. Results: Sixteen patients with 20 lesions were investigated (8 males, 8 females, age range 34 – 81 years, mean 61 years). Fourteen lesions were CM and 6 were melanocytic nevi (MN). Five lesions were melanoma in situ. Breslow thickness median was 0.45 mm (range 0.30 - 14,9 mm). The mean MIBI-UI was 1.54 (±0.58) radioactive counts in CM and 1.04 (±0.10) radioactive counts in MN (P = 0.007). There was strong positive correlation between MIBI-UI and Breslow thickness (rs = 0.74, P= 0.003). Grouping the lesions on Breslow categories, there was a statistically significant difference (P < 0.001) between lesions with Breslow thickness < 1 mm (MIBI-UI = 1.23 ± 0.28 radioactive counts) and Breslow thickness > 1 mm (MIBI-UI = 2.32 ± 0.32 radioactive counts). None of the MN appeared at SPECT images. Of melanomas, 4 (28,6%) were SPECT positive at cutaneous site. All those were Breslow thickness > 1 mm. Conclusion: On this study, although there is a significant difference between thin (< 1 mm) and thick (> 1 mm) melanomas, MIBI intensity at the lesion site is not different between benign nevus and in situ or thin melanomas. Then, MIBI seems to be useful mainly in thick melanomas, as also confirmed by the positivity of the SPECT image only in these cases. However, the possibility of correlating MIBI uptake intensity with Breslow categories may facilitate surgical procedures, allowing to remove melanomas with appropriated surgical margins and to perform or not sentinel lymph node biopsy in the same surgical time, reducing morbidity and cost.

Introdução: A incidência do melanoma cutâneo (MC) está crescendo mais rapidamente que a de qualquer outro câncer. Devido ao seu potencial para metástases e à falta de terapias efetivas para a maioria dos pacientes em estágio avançado, o diagnóstico precoce do MC é crucial. Alguns dos fatores prognósticos mais importantes no MC são a espessura de Breslow e a presença de metástase linfonodal. O Tecnécio-99m-sestamibi (MIBI) é um radiofármaco usado rotineiramente em cintilografias miocárdicas e tem conhecidas propriedades para detecção de tumores malignos, incluindo câncer de mama, tumores cerebrais e melanomas primários e metastáticos. Objetivo: Avaliar a correlação entre a espessura de Breslow e a intensidade da captação de MIBI (IC-MIBI) em lesões primárias de MC. Métodos: Foram selecionados pacientes com lesões clinica e dermatoscopicamente suspeitas de MC. Os pacientes receberam uma injeção intravenosa de 740 – 1110 MBq (20 mCi) de MIBI. Após 10 minutos, o equipamento gamma-probe foi usado para detectar a IC-MIBI na lesão cutânea e em 2 pontos equidistantes na pele normal. A razão entre as contagens radioativas na lesão e a média da pele normal foi considerada a IC-MIBI. A seguir, pacientes realizaram SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) do local da lesão e da região linfonodal correspondente. Exérese da lesão cutânea e exame anatomopatológico foram então realizados. Pacientes portadores de lesões com Breslow > 1 mm ou < 1mm com ulceração/regressão espontânea realizaram biópsia do linfonodo sentinela. Resultados: Dezesseis pacientes com 20 lesões foram estudados (8 homens, 8 mulheres, de 34 – 81 anos, média 61 anos). Quatorze lesões eram melanomas e 6 eram nevos melanocíticos (NM). Cinco lesões eram melanomas in situ. A média da espessura de Breslow foi de 0,45 mm (variação: 0,30 – 14,90 mm). A média da IC-MIBI foi 1,54 (±0.58) contagens radioativas nos MC e 1,04 (±0.10) nos NM (P = 0.007). Houve forte correlação positiva entre a IC-MIBI e a espessura de Breslow (rs = 0.74, P= 0.003). Analisando as lesões em categorias de Breslow, houve diferença estatisticamente significativa (P < 0.001) entre as lesões com Breslow < 1mm (IC-MIBI = 1.23 ± 0.28 contagens radioativas) e Breslow > 1 mm (IC-MIBI = 2.32 ± 0.32 contagens radioativas). Nenhum dos NM apareceu nas imagens de SPECT. Dos MC, 4 lesões, que apresentavam Breslow > 1mm, apareceram nas imagens de SPECT. Conclusão: Neste estudo, embora tenha demonstrado uma diferença significativa entre melanomas finos (< 1mm) e espessos (> 1mm), a IC-MIBI no local da lesão não foi diferente entre NM e melanomas finos ou in situ. Por isso, MIBI parece ser útil principalmente em melanomas espessos, o que também foi confirmado pela positividade do SPECT apenas nestes casos. Entretanto, a possibilidade de correlacionar a IC-MIBI com categorias de Breslow pode facilitar os procedimentos cirúrgicos, permitindo a remoção de melanomas com margens cirúrgicas adequadas e a realização ou não de biópsia de linfonodo sentinela em um mesmo momento cirúrgico, reduzindo morbidade e custos. / Introduction: Given its propensity to metastasize, and lack of effective therapies for most patients with advanced disease, early detection of melanoma is a clinical imperative. The most important prognostic factors are Breslow thickness and nodal metastases. Technetium-99m-sestamibi (MIBI) is a radiopharmaceutical used routinely for cardiologic scintigraphy and has also well-known tumor-seeking properties. It has been used successfully to detect various tumors, including breast cancer, brain tumors, and primary and metastatic melanoma. Objetive: This study has been designed in order to evaluate the correlation between Breslow thickness and MIBI uptake by primary CM lesions. Methods: Patients were recruited by a dermatologist on the grounds of a clinically and dermoscopically suspicious melanocytic lesion. Patients received intravenous injection of 740 – 1110 MBq (20 mCi) of MIBI. After 10 minutes, gamma-probe was used to detect the intensity of MIBI uptake by the cutaneous lesion and at two equidistant points on normal skin. The ratio number of radioactive counts at cutaneous lesion / mean of radioactive counts at normal skin was considered to determinate the MIBI uptake intensity (MIBI-UI). Then, SPECT imaging of the lesion site and respective lymph node region was obtained. After scintigraphy, exeresis of the cutaneous lesion and histological analysis were performed. Lesions with Breslow thickness > 1 mm or < 1 mm with ulceration/spontaneous regression underwent sentinel lymph node biopsy. Results: Sixteen patients with 20 lesions were investigated (8 males, 8 females, age range 34 – 81 years, mean 61 years). Fourteen lesions were CM and 6 were melanocytic nevi (MN). Five lesions were melanoma in situ. Breslow thickness median was 0.45 mm (range 0.30 - 14,9 mm). The mean MIBI-UI was 1.54 (±0.58) radioactive counts in CM and 1.04 (±0.10) radioactive counts in MN (P = 0.007). There was strong positive correlation between MIBI-UI and Breslow thickness (rs = 0.74, P= 0.003). Grouping the lesions on Breslow categories, there was a statistically significant difference (P < 0.001) between lesions with Breslow thickness < 1 mm (MIBI-UI = 1.23 ± 0.28 radioactive counts) and Breslow thickness > 1 mm (MIBI-UI = 2.32 ± 0.32 radioactive counts). None of the MN appeared at SPECT images. Of melanomas, 4 (28,6%) were SPECT positive at cutaneous site. All those were Breslow thickness > 1 mm. Conclusion: On this study, although there is a significant difference between thin (< 1 mm) and thick (> 1 mm) melanomas, MIBI intensity at the lesion site is not different between benign nevus and in situ or thin melanomas. Then, MIBI seems to be useful mainly in thick melanomas, as also confirmed by the positivity of the SPECT image only in these cases. However, the possibility of correlating MIBI uptake intensity with Breslow categories may facilitate surgical procedures, allowing to remove melanomas with appropriated surgical margins and to perform or not sentinel lymph node biopsy in the same surgical time, reducing morbidity and cost.

O aumento nos casos de obesidade em todo o mundo tem gerado grande preocupação e estimulado pesquisas na prevenção e tratamento dessa condição patológica. A combinação de diabetes tipo 2 ou resistência insulínica com obesidade agrava o potencial evolutivo da enfermidade. Mesmo pacientes submetidos com sucesso à cirurgia bariátrica ou metabólica, podem não se curar do diabetes, pois a melhora das taxas circulantes de glicose e insulina nem sempre corresponde à recuperação da massa beta pancreática. Até o momento, não há consenso sobre como medir a massa de células beta in vivo. As ferramentas disponíveis padecem de baixa sensibilidade e especificidade, muitas vezes revelando-se também complexas e dispendiosas. Incretinas radiomarcadas ,como os análogos do peptídeo glucagon-like-peptide-1 / GLP-1, têm-se revelado promissoras para avaliação de células beta pancreáticas, em diabetes e insulinoma. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de dois conjugados de análogo de incretina GLP-1, marcados com tecnécio-99m, a fim de propor um método não invasivo de imagem, para monitoração da massa de células beta pancreáticas, em organismos afetados por obesidade. O estudo foi conduzido em diferentes modelos animais, incluindo obesidade induzida por dieta hiperlipídica, estado pós-obesidade em que o distúrbio inicialmente gerado foi parcialmente corrigido, e como controle, diabetes induzido com aloxana. Nos resultados, os radiotraçadores alcançaram um rendimento radioquímico superior a 97%. O melhor radiomarcador, dentre os dois análogos ensaiados, foi o 99mTc-HYNIC-&beta;Ala-Exendin-4. Animais com obesidade induzida por dieta revelaram captação reduzida nas células beta pancreáticas. A restrição dietética (estado pós-obesidade) não se seguiu de recuperação completa, embora notável melhora de glicemia haja sido observada. Estudos futuros são indicados em modelos de obesidade, diabetes tipo 2 e tratamento dietético, incluindo cirurgia bariátrica e metabólica. / Increased prevalence of obesity worldwide, has become a vast concern, stimulating investigations focusing prevention and therapy of this condition. The association of type 2 diabetes or insulin resistance aggravates the prognosis of obesity. Even patients successfully submitted to bariatric or metabolic surgery, may not be cured of diabetes, as improvement of circulating values of glucose and insulin not necessarily reflects recovery of pancreatic beta cell mass. There is no consensus about how to estimate beta cell mass in vivo. Available tools suffer from low sensitivity and specificity, often being as well cumbersome and expensive. Radiolabeled incretins, such as glucagon-like-peptide 1 (GLP-1) analogs, seem to be promising options for the measurement of beta cell mass in diabetes and insulinoma. The objective of this study was the development of two conjugates of GLP-1 analog, radiolabeled with 99m Technetium, as a noninvasive imaging method for the estimation of pancreatic beta cell mass, in the presence of obesity. Animal models were selected, including hyperlipidic diet-induced obesity, diet restricted obesity, and as controls, alloxan diabetes. Results indicated that both radiotracers achieved over 97% radiochemical yield. The most successful product was 99mTc-HYNIC-&beta;Ala-Exendin-4. Low beta cell mass uptake occurred in diet-induced obesity. Diet-restricted obesity, with substantial shedding of excess body weight, was followed by remarkable decrease of fasting blood glucose, however beta cell mass uptake was only mildly improved. Future studies are recommended in obesity, type 2 diabetes, and dieting, including bariatric and metabolic operations.

O aumento nos casos de obesidade em todo o mundo tem gerado grande preocupação e estimulado pesquisas na prevenção e tratamento dessa condição patológica. A combinação de diabetes tipo 2 ou resistência insulínica com obesidade agrava o potencial evolutivo da enfermidade. Mesmo pacientes submetidos com sucesso à cirurgia bariátrica ou metabólica, podem não se curar do diabetes, pois a melhora das taxas circulantes de glicose e insulina nem sempre corresponde à recuperação da massa beta pancreática. Até o momento, não há consenso sobre como medir a massa de células beta in vivo. As ferramentas disponíveis padecem de baixa sensibilidade e especificidade, muitas vezes revelando-se também complexas e dispendiosas. Incretinas radiomarcadas ,como os análogos do peptídeo glucagon-like-peptide-1 / GLP-1, têm-se revelado promissoras para avaliação de células beta pancreáticas, em diabetes e insulinoma. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de dois conjugados de análogo de incretina GLP-1, marcados com tecnécio-99m, a fim de propor um método não invasivo de imagem, para monitoração da massa de células beta pancreáticas, em organismos afetados por obesidade. O estudo foi conduzido em diferentes modelos animais, incluindo obesidade induzida por dieta hiperlipídica, estado pós-obesidade em que o distúrbio inicialmente gerado foi parcialmente corrigido, e como controle, diabetes induzido com aloxana. Nos resultados, os radiotraçadores alcançaram um rendimento radioquímico superior a 97%. O melhor radiomarcador, dentre os dois análogos ensaiados, foi o 99mTc-HYNIC-&beta;Ala-Exendin-4. Animais com obesidade induzida por dieta revelaram captação reduzida nas células beta pancreáticas. A restrição dietética (estado pós-obesidade) não se seguiu de recuperação completa, embora notável melhora de glicemia haja sido observada. Estudos futuros são indicados em modelos de obesidade, diabetes tipo 2 e tratamento dietético, incluindo cirurgia bariátrica e metabólica. / Increased prevalence of obesity worldwide, has become a vast concern, stimulating investigations focusing prevention and therapy of this condition. The association of type 2 diabetes or insulin resistance aggravates the prognosis of obesity. Even patients successfully submitted to bariatric or metabolic surgery, may not be cured of diabetes, as improvement of circulating values of glucose and insulin not necessarily reflects recovery of pancreatic beta cell mass. There is no consensus about how to estimate beta cell mass in vivo. Available tools suffer from low sensitivity and specificity, often being as well cumbersome and expensive. Radiolabeled incretins, such as glucagon-like-peptide 1 (GLP-1) analogs, seem to be promising options for the measurement of beta cell mass in diabetes and insulinoma. The objective of this study was the development of two conjugates of GLP-1 analog, radiolabeled with 99m Technetium, as a noninvasive imaging method for the estimation of pancreatic beta cell mass, in the presence of obesity. Animal models were selected, including hyperlipidic diet-induced obesity, diet restricted obesity, and as controls, alloxan diabetes. Results indicated that both radiotracers achieved over 97% radiochemical yield. The most successful product was 99mTc-HYNIC-&beta;Ala-Exendin-4. Low beta cell mass uptake occurred in diet-induced obesity. Diet-restricted obesity, with substantial shedding of excess body weight, was followed by remarkable decrease of fasting blood glucose, however beta cell mass uptake was only mildly improved. Future studies are recommended in obesity, type 2 diabetes, and dieting, including bariatric and metabolic operations.

Esta tese apresenta a síntese e a caracterização de novos complexos de rênio e tecnécio utilizando como agentes complexantes ligantes assimétricos do tipo base de Schiff e ligantes triaminas derivadas da dietilenotriamina. Os ligantes assimétricos foram sintetizados através de reações de condensação entre 2,2\'-dihidroxibenzofenona e as aminas alifáticas etilenodiamina e dietilenotriamina, formando, respectivamente, os ligantes 2,2\'-(((2-aminoetill)imino)metileno)difenol(HL1) e 2,2\'-(((2-((2-aminoetil)amino)etil)imino) metileno)difenol (HL2). Os ligantes simétricos foram sintetizados através de reações de condensação entre benzaldeído, 4-hidroxibenzofenona e 3- e 4-metoxibenzaldeído com a amina alifática dietilenotriamina, formando, respectivamente, os ligantes simétricos tridentados tricloridrato de N1-benzil-N2-(2-(benzilamino)etil)etano-1,2-diamina (HL3), 4,4\'-(((azanodiilbis(etano-2,1-diil))bis- (azanediil))bis(phenilmetileno))difenol (HL4), tricloridrato de N1-(4-metoxibenzil)-N2-(2-((4-metoxibenzil)amino)etil) etano-1,2-diamina (HL5) e tricloridrato de N1-(3-metoxibenzil)-N2-(2-((3-metoxibenzil)amino)etil)etano-1,2-diamina (HL6). Reações de complexação foram conduzidas com os precursores metálicos de ReI eTcI. O complexo [Re(CO)5Br] foi utilizado como precursor de ReI. Foi obtido o complexo neutro do tipo fac-[Re(CO)3(L1)] e complexos catiônicos do tipo fac-[Re(CO)3(HL2,3,4,5,6)]Br. Os ligantes e complexos foram caracterizados por ponto de fusão, análise elementar (CHN), espectroscopia de absorção na região do infravermelho, espectroscopia de absorção na região do ultravioleta visível, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C, espectrometria de massas (MS-ESI) e, no caso dos complexos com os ligantes HL1,2,5,6, difração de raios X pelo método do monocristal. Foi realizada a marcação do ligante HL3 com o complexo fac-[[99mTc](H2O)(CO)3]+, formando o complexo fac-[[99mTc](CO)3(HL3)]Br e outras espécies em solução, que foram separadas por HPLC. Adicionalmente, realizou-se um estudo comparativo entre o método convencional de síntese (aquecimento) com o método de síntese no qual microondas são utilizadas. O complexo de tecnécio foi caracterizado por HPLC e eletroforese em papel. Foram realizados testes de estabilidade em cisteína, histidina e tampão PBS. Os testes de estabilidade mostraram que o complexo apresenta boa estabilidade por período de 3 horas. Foi determinado o coeficiente de partição desse complexo, tendo sido observado o caráter lipofílico do mesmo. Foram também realizados testes biológicos in vitro de captação e extrusão com células B16F10 (melanoma murino), onde as células captaram o complexo fac-[[99mTc](CO)3(HL3)]Br,em torno de 4,2%, e mantiveram retidas em seu interior cerca de 20% do complexo, após 60 minutos de incubação. O teste de viabilidade celular por azul de Tripan, mostrou estabilidade das células, durante os experimentos de captação e extrusão, frente às espécies radioativas, apresentando uma viabilidade celular superior a 90% em todos os casos. / This thesis presents the synthesis and characterization of novel rhenium and technetium complexes using as complexing agents asymmetric ligands (Schiff\'s bases type ligands) and triamines ligands derived from diethylenetriamine. The asymmetric ligands were synthesized by condensation reactions between 2,2\'-dihydroxybenzophenone and the aliphatic amines ethylenediamine and diethylenetriamine, giving rise, respectively, to the ligands 2,2\'-(((2-aminoetill)imino) methylene)diphenol (HL1) and 2,2\'-(((2-((2-aminoethyl)amino)ethyl)imino) methylene) diphenol (HL2). The symmetrical ligands were synthesized by condensation reactions between benzaldehyde, 4-hydroxybenzophenone and 3- and 4-methoxybenzaldehyde with the aliphatic amine diethylenetriamine, resulting in the formation, respectively, of the symmetrical tridentated ligands trihydrochloride N1-benzyl-N2-(2-(benzylamino)ethyl)ethane-1,2-diamine (HL3), 4,4\'-(((azanodiilbis(ethane-2,1-diyl))bis(azanediil))bis(phenilmetileno))diphenol (HL4), trihydrochloride N1-(4-methoxybenzyl)-N2-(2-((4-methoxybenzyl)amino)ethyl)ethane-1,2-diamine (HL5) and trihydrochloride N1-(3-methoxybenzyl)-N2-(2-((3-methoxybenzyl)amino)ethyl)ethane-1,2-diamine (HL6). Complexation reactions were carried out using ReI and TcI as metal precursors. The complex [Re(CO)5Br] was used as ReI precursor. Neutral complexe of the type fac-[Re(CO)3(L1)] and cationic complexes of the type fac-[Re(CO)3(HL2,3,4,5,6)]Br were obtained. The ligands and complexes were characterized by melting point, elemental analysis (CHN), infrared absorption spectroscopy, UV-visible absorption spectroscopy, 1H and 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry (MS-ESI) and for the complexes with the ligands HL1,2,5,6, single crystal X ray diffraction method. Labeling studies were carried out for the HL3 ligand with the complex fac-[[99mTc](H2O)(CO)3]+, forming the complex fac-[[99mTc](CO)3(HL3)]Br and other species in solution, which were separated by high performance liquid chromatography (HPLC). Additionally, a comparative study was done between the conventional (heating) and the synthesis method using microwaves. The technetium complex was characterized by HPLC and electrophoresis on paper. Stability tests were conducted on cysteine, histidine and PBS buffer. The stability tests showed that the compound presents good stability over a 3 hour period. The lipophilic character of the complex was confirmed by the determination of the partition coefficient. In addition, In vitro biolgical tests of captation and influx were performed on B16F10 cells (murine melanoma). The cells captured around 4.2% of the complex fac-[[99mTc](CO)3(HL3)]Br and retained 20% of the amount inside after 60 minutes of incubation. The Trypan blue exclusion test of cell viability showed stability of the cells during the influx and captation experiments, front of the radioactive species, showing cell viability greater than 90% in all cases.

A importância do aumento da permeabilidade e da limpeza da dentina radicular está ligada à melhora da sanificação e obturação do sistema de canais radiculares. Este estudo teve como objetivo, avaliar as variações da permeabilidade dentinária radicular de dentes humanos, após o preparo químico-cirúrgico e irradiação com laseres de Er: YAG, Nd:YAG, por meio da utilização do radioisótopo 99mTc livre, assim como, analisar, valendo-se da microscopia eletrônica de varredura (MEV) a limpeza, contaminação e aderência bacteriana valendo-se de inoculação de Enterococcus faecalis. Trinta raízes palatinas de primeiros pré-molares superiores humanos hígidos e foram preparadas pela técnica seriada. Posteriormente, foram divididas, aleatoriamente, em 3 grupos experimentais com 10 raízes cada: G1 - controle, G2 - irradiação com laser de Er:YAG e G3 - irradiação com laser de Nd:YAG. As amostras preparadas receberam quantidade suficiente de 99mTc livre no interior do canal radicular para o prenchimento do mesmo e colocadas em tubos de ensaio contendo 1mL de solução salina. Após 1 hora, a contagem do isótopo radioativo (99mTc) foi realizada. Findo esse período, 3 raízes foram processadas para análise da limpeza dentinária radicular por MEV e os canais radiculares das 7 raízes restantes foram contaminados com Enterococcus faecalis por 21 dias. A presença e aderência microbiana foram constatadas e avaliadas por fotomicrografias eletrônicas. O tratamento estatístico dos dados permitiu concluir que a o G3 provocou uma diminuição significativa da permeabilidade dentinária radicular; o G2 e o G1, em relação à permeabilidade dentinária radicular, não apresentaram diferença estatisticamente significante em nível de 5%; o G2 mostrou-se eficiente na limpeza das paredes dentinárias do canal radicular e, o G1 apresentou os menores índices de aderência e contaminação da parede dentinária radicular, nos diferentes terços avaliados, sendo maior no G2, seguido pelo G3. / The permeability increasing and the cleanliness of root dentin walls are important to improve the sanitization and root canal filling. Thus, this study aimed to evaluate the variations of root dentin permeability of human teeth, after endodontic preparation followed by Er:YAG and Nd:YAG laser irradiation, using free Technetium-99m radioisotope (99mTc) as tracer. Additionally, SEM images were analyzed to evaluate the cleanliness of dentin walls and possible bacterial adhesion after Enterococcus faecalis inoculation. Thirty palatal roots of human first pre-molars were prepared by conventional technique. Therefore, the sample were randomly divided into 3 experimental groups with 10 teeth each: G1 - control, G2 - Er:YAG laser irradiation and G3 - Nd:YAG laser irradiation. Samples were filled with free 99mTc and placed in test tubes containing 1ml of saline solution. After 1 hour, the radioactive isotope (99mTc) was counted. After that, 3 roots were processed for analysis of dentin cleaning through SEM images and the 7 remaining roots were infected with Enterococcus faecalis for 21 days. The microbial presence and adhesion were verified and evaluated by SEM. After the statistical treatment (ANOVA), it was concluded that Nd:YAG irradiation significantly decreased dentin permeability. Er:YAG irradiation showed significant differences in cleaning efficacy and the G1 (control) had the lowest rates of adherence and contamination of dentin walls, followed by the G3 and G2.