Introdução: Células-troco mesenquimais (CTM) vêm mostrando seus benefícios na doença do enxerto-versus-hospedeiro (DECH), observada no transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH), existem três questões em aberto: (1) Expansão de CTM em meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SFB), pelo o risco de xenorreação; (2) Otimização de condições de cultura para a obtenção, em tempo hábil, de um numero que permita de 4 a 6 infusões de 2x106cells/kg do receptor; (3) Obter células do doador de medula óssea, evitando assim a utilização de um terceiro doador. Objetivos: Este estudo foi desenhado para comparar o lisado de plaquetas (LP) e o SFB na expansão de CTM, a densidade de plaqueamento das células e os dias entre cada passagem, e para investigar se as células nucleadas totais obtidas da bolsa e filtro do TCTH, podem ser utilizadas para expansão de CTM para utilização clínica. Métodos: Células residuais foram removidas do filtro e da bolsa utilizados para o TCTH, plaqueadas e depois da primeira passagem foram cultivadas em diferentes concentrações com SFB ou LP e observado o número de dias que levaram para chegar a 80% de confluência. Em seguida, as culturas com as mesmas densidades de plaqueamento foram suplementadas com LP ou SFB e depois de sete dias contou-se o número de células para analisar o quanto elas cresceram nesse período. Resultados: A proliferação de CTM, na presença de LP e SFB foi em média 11,88 e 2,5 vezes, respectivamente, num período de 7 dias. A concentração mais elevada de células usando LP demorou menos tempo para atingir a confluência, em comparação com os três inferiores. Este estudo sugere que o LP é a melhor escolha como suplemento para expandir CTM, e permite a proliferação de um número suficiente de CTM de doadores para uso clínico. / Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSC) have shown their benefits in graft-versus-host disease (GVHD), with three unsettled matters:(1) MSCs expansion in medium with Fetal Calf Serum (FCS) and its risk of xenoreaction; (2) The number of cells indicated for therapy is 2x106cells/Kg with the need to optimize expansion, number and time wise; and (3) the utilization of third party donors. Aims: This study was designed to compare the platelet lysate (LP) and FCS on the expansion of MSC, the optimal cell plating density and days between each pass, and to investigate if donor total nucleated cells (TNC) obtained from the washouts of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) explants can be expanded to be used at clinical grade. Methods: TNC were removed, plated and after the first passage were cultivated in different concentrations with FCS or PL and the number of days reach 80% of confluence was observed. Next, cultures with the same plating density were fed either with PL or FCS and after seven days counted to analyze how much they have grown in that period. Results: The proliferation of mesenchymal stromal cells in the presence of PL and SFB was averaged 11.88 and 2.5 times, respectively, in a period of 7 days. The highest concentration of plating cells using PL, took less time to reach confluence as compared with the three lower ones. This study suggests that the PL is the best choice as a supplement to expand MSC, and allows the proliferation of a sufficient number of donors MSC at P2 for clinical use.

A terapia celular utilizando células tronco-mesenquimais (MSCs) surge como alternativa para o tratamento das doenças inflamatórias intestinais (DII). Atualmente, os métodos terapêuticos consistem principalmente na utilização de fármacos que visam produzir e manter estados de remissão da colite ulcerativa e, muitas vezes, apresentam efeitos colaterais. Considerando a capacidade de modular células do sistema imune e de regenerar tecidos doentes, as MSCs podem ser consideradas uma alternativa para o tratamento de DII, como a colite ulcerativa. Além disso, muito tem se investigado a respeito do homing de MSCs exógenas infundidas por diversas vias em resposta a um insulto inflamatório e tem-se visto a capacidade de migração para tecidos afetados. A primeira etapa do trabalho consistiu na caracterização e desenvolvimento do modelo animal de colite ulcerativa aguda. Para isso, foram testados diferentes pesos moleculares e concentrações do reagente Dextran Sulfato de Sódio (DSS), a fim de verificar qual o melhor método de indução da doença. Após determinar o adequado modelo animal, que utilizou 2% DSS (36 000 – 50 000 Da), foi iniciado o experimento de terapia celular. Na tentativa de compreender como as MSCs podem influenciar a inflamação intestinal, o estudo avaliou o efeito do transplante de MSCs derivadas do tecido adiposo em duas diferentes vias de infusão, intraperitoneal e intravenosa, em modelo murino experimental de colite aguda. Foram avaliados os seguintes parâmetros: atividade clínica da doença, aspecto macroscópico e histopatológico do cólon, dosagem de citocinas inflamatórias, taxas de apoptose e parâmetros de estresse oxidativo. Os resultados obtidos no trabalho mostraram que o transplante celular intravenoso melhorou a severidade clínica de colite, como perda de peso, diarreia e presença de sangue nas fezes. Na avaliação histológica, observou-se a diminuição da inflamação colônica através da redução de perda de criptas e de infiltração de células inflamatórias. Ainda, os fatores secretados pelas MSCs parecem poder reduzir os níveis de IL-6 e aumentar os níveis de IL-10 e IL-4 do soro. Um aumento de células apoptóticas foi observado nos animais tratados com MSCs por via intravenosa, sugerindo que as MSCs induzem morte celular em células T resistentes à apoptose. Além disso, a terapia intravenosa foi capaz de aumentar os níveis de glutationa reduzida, um importante antioxidante natural, revertendo o dano causado pelo estresse oxidativo no cólon. Em conjunto, nossos resultados demonstram que a melhor via para a terapia celular na colite ulcerativa foi a intravenosa e que o tratamento proposto foi eficaz no que se refere à redução da inflamação do cólon. / Mesenchymal stem cell (MSC) therapy is an alternative for the treatment of inflammatory bowel disease (IBD). Currently, therapeutic methods consist primarily on the use of drugs which aim to produce and maintain state of ulcerative colitis remission and often present side effects. Considering the ability to modulate the immune system cells and regenerate injuried tissues, MSCs can be considered an alternative for treating IBD, such as ulcerative colitis. Moreover, there is many research investigating the homing of exogenous MSCs infused through different routes in response to an inflammatory insult, and has demonstrated the migration capacity of these cells into the affected tissues. The first stage of this study consisted in the characterization and development of acute animal model of ulcerative. For this, different molecular weights and concentrations of Dextran Sulfate Sodium (DSS) reagent were tested in order to verify the best method for disease induction. After determining the appropriate animal model, that uses 2% DSS (36000-50000 Da), the cell therapy experiment was initiated. In an attempt to understand how MSCs can influence intestinal inflammation, the study evaluated the effect of MSCs transplantation using two different infusion routes, intraperitoneal and intravenous, in an acute colitis murine model. The following parameters were evaluated: clinical disease activity, colon macroscopic and histological analysis, serum inflammatory cytokine, determination apoptosis rates and oxidative stress parameters. Results show that MSC intravenous transplantation has improved the clinical severity of colitis, such as weight loss, diarrhea, and blood stool. Histological evaluation demonstrated a decreased colonic inflammation by reducing colonic crypt loss and infiltration of inflammatory cells. Also, MSCs secreted factors which seem to reduce levels of IL-6 and increase levels of IL-10 and IL-4 in the serum. In addition, an increase of apoptotic cells was observed in animals treated with intravenous MSCs, suggesting that MSCs induce cell death in T cells resistant to apoptosis. Furthermore, intravenous therapy was able to increase the levels of reduced glutathione, an important natural antioxidant, reversing the damage caused by oxidative stress in the colon. Taken together, our results demonstrate that the best route for cell therapy in ulcerative colitis was intravenous and the proposed treatment was effective with regards to reducing colon inflammation.

Introdução: Células-troco mesenquimais (CTM) vêm mostrando seus benefícios na doença do enxerto-versus-hospedeiro (DECH), observada no transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH), existem três questões em aberto: (1) Expansão de CTM em meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SFB), pelo o risco de xenorreação; (2) Otimização de condições de cultura para a obtenção, em tempo hábil, de um numero que permita de 4 a 6 infusões de 2x106cells/kg do receptor; (3) Obter células do doador de medula óssea, evitando assim a utilização de um terceiro doador. Objetivos: Este estudo foi desenhado para comparar o lisado de plaquetas (LP) e o SFB na expansão de CTM, a densidade de plaqueamento das células e os dias entre cada passagem, e para investigar se as células nucleadas totais obtidas da bolsa e filtro do TCTH, podem ser utilizadas para expansão de CTM para utilização clínica. Métodos: Células residuais foram removidas do filtro e da bolsa utilizados para o TCTH, plaqueadas e depois da primeira passagem foram cultivadas em diferentes concentrações com SFB ou LP e observado o número de dias que levaram para chegar a 80% de confluência. Em seguida, as culturas com as mesmas densidades de plaqueamento foram suplementadas com LP ou SFB e depois de sete dias contou-se o número de células para analisar o quanto elas cresceram nesse período. Resultados: A proliferação de CTM, na presença de LP e SFB foi em média 11,88 e 2,5 vezes, respectivamente, num período de 7 dias. A concentração mais elevada de células usando LP demorou menos tempo para atingir a confluência, em comparação com os três inferiores. Este estudo sugere que o LP é a melhor escolha como suplemento para expandir CTM, e permite a proliferação de um número suficiente de CTM de doadores para uso clínico. / Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSC) have shown their benefits in graft-versus-host disease (GVHD), with three unsettled matters:(1) MSCs expansion in medium with Fetal Calf Serum (FCS) and its risk of xenoreaction; (2) The number of cells indicated for therapy is 2x106cells/Kg with the need to optimize expansion, number and time wise; and (3) the utilization of third party donors. Aims: This study was designed to compare the platelet lysate (LP) and FCS on the expansion of MSC, the optimal cell plating density and days between each pass, and to investigate if donor total nucleated cells (TNC) obtained from the washouts of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) explants can be expanded to be used at clinical grade. Methods: TNC were removed, plated and after the first passage were cultivated in different concentrations with FCS or PL and the number of days reach 80% of confluence was observed. Next, cultures with the same plating density were fed either with PL or FCS and after seven days counted to analyze how much they have grown in that period. Results: The proliferation of mesenchymal stromal cells in the presence of PL and SFB was averaged 11.88 and 2.5 times, respectively, in a period of 7 days. The highest concentration of plating cells using PL, took less time to reach confluence as compared with the three lower ones. This study suggests that the PL is the best choice as a supplement to expand MSC, and allows the proliferation of a sufficient number of donors MSC at P2 for clinical use.

A terapia celular utilizando células tronco-mesenquimais (MSCs) surge como alternativa para o tratamento das doenças inflamatórias intestinais (DII). Atualmente, os métodos terapêuticos consistem principalmente na utilização de fármacos que visam produzir e manter estados de remissão da colite ulcerativa e, muitas vezes, apresentam efeitos colaterais. Considerando a capacidade de modular células do sistema imune e de regenerar tecidos doentes, as MSCs podem ser consideradas uma alternativa para o tratamento de DII, como a colite ulcerativa. Além disso, muito tem se investigado a respeito do homing de MSCs exógenas infundidas por diversas vias em resposta a um insulto inflamatório e tem-se visto a capacidade de migração para tecidos afetados. A primeira etapa do trabalho consistiu na caracterização e desenvolvimento do modelo animal de colite ulcerativa aguda. Para isso, foram testados diferentes pesos moleculares e concentrações do reagente Dextran Sulfato de Sódio (DSS), a fim de verificar qual o melhor método de indução da doença. Após determinar o adequado modelo animal, que utilizou 2% DSS (36 000 – 50 000 Da), foi iniciado o experimento de terapia celular. Na tentativa de compreender como as MSCs podem influenciar a inflamação intestinal, o estudo avaliou o efeito do transplante de MSCs derivadas do tecido adiposo em duas diferentes vias de infusão, intraperitoneal e intravenosa, em modelo murino experimental de colite aguda. Foram avaliados os seguintes parâmetros: atividade clínica da doença, aspecto macroscópico e histopatológico do cólon, dosagem de citocinas inflamatórias, taxas de apoptose e parâmetros de estresse oxidativo. Os resultados obtidos no trabalho mostraram que o transplante celular intravenoso melhorou a severidade clínica de colite, como perda de peso, diarreia e presença de sangue nas fezes. Na avaliação histológica, observou-se a diminuição da inflamação colônica através da redução de perda de criptas e de infiltração de células inflamatórias. Ainda, os fatores secretados pelas MSCs parecem poder reduzir os níveis de IL-6 e aumentar os níveis de IL-10 e IL-4 do soro. Um aumento de células apoptóticas foi observado nos animais tratados com MSCs por via intravenosa, sugerindo que as MSCs induzem morte celular em células T resistentes à apoptose. Além disso, a terapia intravenosa foi capaz de aumentar os níveis de glutationa reduzida, um importante antioxidante natural, revertendo o dano causado pelo estresse oxidativo no cólon. Em conjunto, nossos resultados demonstram que a melhor via para a terapia celular na colite ulcerativa foi a intravenosa e que o tratamento proposto foi eficaz no que se refere à redução da inflamação do cólon. / Mesenchymal stem cell (MSC) therapy is an alternative for the treatment of inflammatory bowel disease (IBD). Currently, therapeutic methods consist primarily on the use of drugs which aim to produce and maintain state of ulcerative colitis remission and often present side effects. Considering the ability to modulate the immune system cells and regenerate injuried tissues, MSCs can be considered an alternative for treating IBD, such as ulcerative colitis. Moreover, there is many research investigating the homing of exogenous MSCs infused through different routes in response to an inflammatory insult, and has demonstrated the migration capacity of these cells into the affected tissues. The first stage of this study consisted in the characterization and development of acute animal model of ulcerative. For this, different molecular weights and concentrations of Dextran Sulfate Sodium (DSS) reagent were tested in order to verify the best method for disease induction. After determining the appropriate animal model, that uses 2% DSS (36000-50000 Da), the cell therapy experiment was initiated. In an attempt to understand how MSCs can influence intestinal inflammation, the study evaluated the effect of MSCs transplantation using two different infusion routes, intraperitoneal and intravenous, in an acute colitis murine model. The following parameters were evaluated: clinical disease activity, colon macroscopic and histological analysis, serum inflammatory cytokine, determination apoptosis rates and oxidative stress parameters. Results show that MSC intravenous transplantation has improved the clinical severity of colitis, such as weight loss, diarrhea, and blood stool. Histological evaluation demonstrated a decreased colonic inflammation by reducing colonic crypt loss and infiltration of inflammatory cells. Also, MSCs secreted factors which seem to reduce levels of IL-6 and increase levels of IL-10 and IL-4 in the serum. In addition, an increase of apoptotic cells was observed in animals treated with intravenous MSCs, suggesting that MSCs induce cell death in T cells resistant to apoptosis. Furthermore, intravenous therapy was able to increase the levels of reduced glutathione, an important natural antioxidant, reversing the damage caused by oxidative stress in the colon. Taken together, our results demonstrate that the best route for cell therapy in ulcerative colitis was intravenous and the proposed treatment was effective with regards to reducing colon inflammation.

Introdução: Células-troco mesenquimais (CTM) vêm mostrando seus benefícios na doença do enxerto-versus-hospedeiro (DECH), observada no transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH), existem três questões em aberto: (1) Expansão de CTM em meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SFB), pelo o risco de xenorreação; (2) Otimização de condições de cultura para a obtenção, em tempo hábil, de um numero que permita de 4 a 6 infusões de 2x106cells/kg do receptor; (3) Obter células do doador de medula óssea, evitando assim a utilização de um terceiro doador. Objetivos: Este estudo foi desenhado para comparar o lisado de plaquetas (LP) e o SFB na expansão de CTM, a densidade de plaqueamento das células e os dias entre cada passagem, e para investigar se as células nucleadas totais obtidas da bolsa e filtro do TCTH, podem ser utilizadas para expansão de CTM para utilização clínica. Métodos: Células residuais foram removidas do filtro e da bolsa utilizados para o TCTH, plaqueadas e depois da primeira passagem foram cultivadas em diferentes concentrações com SFB ou LP e observado o número de dias que levaram para chegar a 80% de confluência. Em seguida, as culturas com as mesmas densidades de plaqueamento foram suplementadas com LP ou SFB e depois de sete dias contou-se o número de células para analisar o quanto elas cresceram nesse período. Resultados: A proliferação de CTM, na presença de LP e SFB foi em média 11,88 e 2,5 vezes, respectivamente, num período de 7 dias. A concentração mais elevada de células usando LP demorou menos tempo para atingir a confluência, em comparação com os três inferiores. Este estudo sugere que o LP é a melhor escolha como suplemento para expandir CTM, e permite a proliferação de um número suficiente de CTM de doadores para uso clínico. / Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSC) have shown their benefits in graft-versus-host disease (GVHD), with three unsettled matters:(1) MSCs expansion in medium with Fetal Calf Serum (FCS) and its risk of xenoreaction; (2) The number of cells indicated for therapy is 2x106cells/Kg with the need to optimize expansion, number and time wise; and (3) the utilization of third party donors. Aims: This study was designed to compare the platelet lysate (LP) and FCS on the expansion of MSC, the optimal cell plating density and days between each pass, and to investigate if donor total nucleated cells (TNC) obtained from the washouts of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) explants can be expanded to be used at clinical grade. Methods: TNC were removed, plated and after the first passage were cultivated in different concentrations with FCS or PL and the number of days reach 80% of confluence was observed. Next, cultures with the same plating density were fed either with PL or FCS and after seven days counted to analyze how much they have grown in that period. Results: The proliferation of mesenchymal stromal cells in the presence of PL and SFB was averaged 11.88 and 2.5 times, respectively, in a period of 7 days. The highest concentration of plating cells using PL, took less time to reach confluence as compared with the three lower ones. This study suggests that the PL is the best choice as a supplement to expand MSC, and allows the proliferation of a sufficient number of donors MSC at P2 for clinical use.

A terapia celular utilizando células tronco-mesenquimais (MSCs) surge como alternativa para o tratamento das doenças inflamatórias intestinais (DII). Atualmente, os métodos terapêuticos consistem principalmente na utilização de fármacos que visam produzir e manter estados de remissão da colite ulcerativa e, muitas vezes, apresentam efeitos colaterais. Considerando a capacidade de modular células do sistema imune e de regenerar tecidos doentes, as MSCs podem ser consideradas uma alternativa para o tratamento de DII, como a colite ulcerativa. Além disso, muito tem se investigado a respeito do homing de MSCs exógenas infundidas por diversas vias em resposta a um insulto inflamatório e tem-se visto a capacidade de migração para tecidos afetados. A primeira etapa do trabalho consistiu na caracterização e desenvolvimento do modelo animal de colite ulcerativa aguda. Para isso, foram testados diferentes pesos moleculares e concentrações do reagente Dextran Sulfato de Sódio (DSS), a fim de verificar qual o melhor método de indução da doença. Após determinar o adequado modelo animal, que utilizou 2% DSS (36 000 – 50 000 Da), foi iniciado o experimento de terapia celular. Na tentativa de compreender como as MSCs podem influenciar a inflamação intestinal, o estudo avaliou o efeito do transplante de MSCs derivadas do tecido adiposo em duas diferentes vias de infusão, intraperitoneal e intravenosa, em modelo murino experimental de colite aguda. Foram avaliados os seguintes parâmetros: atividade clínica da doença, aspecto macroscópico e histopatológico do cólon, dosagem de citocinas inflamatórias, taxas de apoptose e parâmetros de estresse oxidativo. Os resultados obtidos no trabalho mostraram que o transplante celular intravenoso melhorou a severidade clínica de colite, como perda de peso, diarreia e presença de sangue nas fezes. Na avaliação histológica, observou-se a diminuição da inflamação colônica através da redução de perda de criptas e de infiltração de células inflamatórias. Ainda, os fatores secretados pelas MSCs parecem poder reduzir os níveis de IL-6 e aumentar os níveis de IL-10 e IL-4 do soro. Um aumento de células apoptóticas foi observado nos animais tratados com MSCs por via intravenosa, sugerindo que as MSCs induzem morte celular em células T resistentes à apoptose. Além disso, a terapia intravenosa foi capaz de aumentar os níveis de glutationa reduzida, um importante antioxidante natural, revertendo o dano causado pelo estresse oxidativo no cólon. Em conjunto, nossos resultados demonstram que a melhor via para a terapia celular na colite ulcerativa foi a intravenosa e que o tratamento proposto foi eficaz no que se refere à redução da inflamação do cólon. / Mesenchymal stem cell (MSC) therapy is an alternative for the treatment of inflammatory bowel disease (IBD). Currently, therapeutic methods consist primarily on the use of drugs which aim to produce and maintain state of ulcerative colitis remission and often present side effects. Considering the ability to modulate the immune system cells and regenerate injuried tissues, MSCs can be considered an alternative for treating IBD, such as ulcerative colitis. Moreover, there is many research investigating the homing of exogenous MSCs infused through different routes in response to an inflammatory insult, and has demonstrated the migration capacity of these cells into the affected tissues. The first stage of this study consisted in the characterization and development of acute animal model of ulcerative. For this, different molecular weights and concentrations of Dextran Sulfate Sodium (DSS) reagent were tested in order to verify the best method for disease induction. After determining the appropriate animal model, that uses 2% DSS (36000-50000 Da), the cell therapy experiment was initiated. In an attempt to understand how MSCs can influence intestinal inflammation, the study evaluated the effect of MSCs transplantation using two different infusion routes, intraperitoneal and intravenous, in an acute colitis murine model. The following parameters were evaluated: clinical disease activity, colon macroscopic and histological analysis, serum inflammatory cytokine, determination apoptosis rates and oxidative stress parameters. Results show that MSC intravenous transplantation has improved the clinical severity of colitis, such as weight loss, diarrhea, and blood stool. Histological evaluation demonstrated a decreased colonic inflammation by reducing colonic crypt loss and infiltration of inflammatory cells. Also, MSCs secreted factors which seem to reduce levels of IL-6 and increase levels of IL-10 and IL-4 in the serum. In addition, an increase of apoptotic cells was observed in animals treated with intravenous MSCs, suggesting that MSCs induce cell death in T cells resistant to apoptosis. Furthermore, intravenous therapy was able to increase the levels of reduced glutathione, an important natural antioxidant, reversing the damage caused by oxidative stress in the colon. Taken together, our results demonstrate that the best route for cell therapy in ulcerative colitis was intravenous and the proposed treatment was effective with regards to reducing colon inflammation.