Tetraploid cells, which typically arise from errors in mitosis, are genomically unstable and promote tumorigenesis. Recent evidence suggests that ~40% of tumors undergo a tetraploid intermediate during their evolution, with ~20% of all solid tumors maintaining a tetraploid karyotype. Consequently, tumor suppression mechanisms have evolved to limit the proliferation of tetraploid cells. However, it remains unclear how tetraploid cells are able to overcome these tumor suppression mechanisms to initiate tumorigenesis. To address this unresolved question, we developed and validated a genome-wide screening assay to comprehensively identify miRNAs whose overexpression promotes tetraploid cell proliferation. We then profiled those miRNAs to mechanistically define how each miRNA functions to overcome tetraploid induced arrest. Our results demonstrate that miRNAs can promote proliferation via multiple mechanisms, including inhibition of the p53 tumor suppressor pathway, hyperactivation of growth factor signaling, and inactivation of the Hippo tumor suppressor pathway. Additionally, we investigated mechanisms that facilitate tumorigenesis from proliferating tetraploid cells. It is well established that tetraploid cell proliferation promotes both numerical and structural chromosome abnormalities, although the precise mechanisms underlying these phenomena remain incompletely understood. Chromosome missegregation can lead to the formation of micronuclei separate from the primary nucleus, a result of either lagging or polar chromosomes. Micronuclei have been shown to rupture during interphase, leading to massive amounts of DNA damage and chromothripsis, resulting in extensive DNA breaks and rearrangements. We followed micronuclei formed from both lagging and polar chromosomes to determine whether all micronuclei are equally prone to nuclear envelope rupture. Our results show that polar micronuclei have nuclear envelopes that are significantly more stable than the nuclear envelopes of micronuclei formed from lagging chromosomes. Furthermore, micronuclei have been shown to be deficient at nuclear import of proteins. Kinetochore assembly, vital for proper chromosome segregation, is dependent upon the nuclear import of many proteins. We sought to establish whether micronuclei have defects in kinetochore assembly since without functional kinetochores, chromosomes cannot bind to the mitotic spindle. We found that chromosomes in micronuclei fail to assemble kinetochores efficiently, and thus promote additional chromosome missegregation. Overall, this dissertation identifies multiple mechanisms that facilitate tumorigenesis from tetraploid intermediates.

The correct number of chromosomes is important for the maintenance of healthy cells and organisms. Maintenance of a correct chromosome number depends on the accurate distribution of chromosomes to the daughter cells during cell division, and errors in chromosome segregation result in abnormal chromosome numbers, or aneuploidy. Aneuploidy is typically associated with deleterious effects on organismal and cellular fitness; however, aneuploidy has also been associated with enhanced cellular growth in certain contexts, such as cancer. Another type of deviation from the normal chromosome number can occur when entire sets of chromosomes are added to the normal (diploid) chromosome number, resulting in polyploidy. Whereas polyploidy is found in certain normal tissues and organisms, tetraploidy (four sets of chromosomes) is associated with a number of precancerous lesions and is believed to promote aneuploidy and tumorigenesis. While it is clear that chromosome mis-segregation causes aneuploidy, the effect of aneuploidy on chromosome segregation is less clear. Similarly, it is unclear whether and how tetraploidy may affect chromosome segregation. The work described here shows that aneuploidy can cause chromosome mis-segregation and induces chromosome-specific phenotypic effects. In contrast, tetraploidy does not per se induce chromosome mis-segregation, but enables the accumulation of aneuploidy thanks to a "genetic buffer" effect that allows tetraploid cells to tolerate aneuploidy better than diploid cells. / Ph. D.

La tétraploïdie – cellule contenant le double du génome d’une cellule diploïde – est considérée comme un état métastable, à l’origine de l’aneuploïdie des cancers. Présentes dans les lésions précancéreuses, les cellules tétraploïdes sont associées à la progression tumorale. Etant donné le rôle clé de la tétraploïdie au cours de l’oncogenèse, le développement d’agents pharmacologiques éliminant spécifiquement les cellules tétraploïdes pourrait permettre de prévenir et limiter l’évolution vers un état cancéreux. Afin d'identifier des composés délétères pour les cellules tétraploïdes, nous avons développé une méthode de criblage basée sur la vidéomicroscopie à fluorescence automatisée. La chimiothèque de l'Institute of Chemistry and Cell Biology (ICCB) a été criblée, et nous avons mis en évidence plusieurs hits aux effets cytostatiques et/ou cytotoxiques préférentiels pour les cellules tétraploïdes. En raison de ses propriétés chimiopréventives, le resvératrol est le premier composé dont nous avons choisi de poursuivre la caractérisation. Sa sélectivité pour les cellules tétraploïdes a été confirmée sur différents types cellulaires, stables ou en cours de polyploïdisation. L’étude du mécanisme d’action anti-tétraploïde du resvératrol a permis d’identifier le senseur de la charge énergétique 5’-adenosine monophosphate-activated kinase (AMPK), comme une cible moléculaire responsable de la mort sélective des cellules tétraploïdes. Une série d’agents pharmacologiques activant directement ou indirectement AMPK – parmi lesquels l’aspirine et son métabolite le salicylate, dont l’action chimiopréventive a été établie par plusieurs études épidémiologiques et essais cliniques – a montré une toxicité préférentielle pour les cellules tétraploïdes. De la même manière que le resvératrol, ces agents éliminent les cellules tétraploïdes stables et limitent la polyploïdisation. Finalement, l’effet anti-tétraploïde du resvératrol et de l’aspirine a été évalué in vivo. L’administration orale de ces deux composés aux doses décrites comme chimiopréventives, réduit le développement des cellules épithéliales tétraploïdes et aneuploïdes des cryptes intestinales des souris ApcMin/+, le modèle murin de la polypose adénomateuse familiale. Collectivement les résultats de cette étude suggèrent que l’action chimiopréventive du resvératrol et de l’aspirine est associée à l’élimination des cellules tétraploïdes précurseur de tumeurs. / Tetraploidy – cells that contain twice the normal amount of chromosomes – is a metastable state leading to aneuploidy in cancer. Tetraploid cells have been observed in precancerous lesions and constitute a step toward tumor progression. Given the importance of tetraploidization for oncogenesis, developing drugs that selectively target tetraploid cells should prevent cancer.To discover compounds toxic to tetraploid cells, we developed an assay-system based on automatic fluorescence videomicroscopy. We screened the Institute of Chemistry and Cell Biology (ICCB) chemical library and identified several hits exerting a selective cytostatic and/or cytotoxic effect on tetraploid cells. Due to its well known chemopreventive properties, resveratrol was the first compound we further characterized. Its selectivity for tetraploid cells was confirmed on various stable or polyploidizing cancer cell lines, as well as primary epithelial cells. The mechanism accounting for the preferential killing of tetraploid cells involves the 5’-adenosine monophosphate-activated kinase (AMPK) signaling pathway. A series of additional agents that stimulate AMPK – including aspirin and salicylate whose chemopreventive action have been established by several epidemiological studies and clinical trials – display a selective toxicity toward tetraploid cells. Similar to resveratrol, these drugs eliminate stable tetraploid cells and reduce polyploidization. Finally, we validated the anti-tetraploid effect of resveratrol and aspirin in vivo. Oral treatment with either of these two compounds at chemopreventive doses, repressed the accumulation of tetraploid and subsequently aneuploid intestinal epithelial cells from the crypts of the ApcMin/+ mouse model of familial adenomatous polyposis.Collectively, our results suggest that the chemopreventive action of resveratrol and aspirin involves the elimination of tetraploid cancer cell precursors.

Melanoma, the most lethal form of skin cancer, arises from altered cells in the melanocyte lineage, but the mechanisms by which these cells progress to melanoma are unknown. To understand the early cellular events that contribute to melanoma formation, we examined melanocytes in melanoma-prone zebrafish strains expressing BRAFV600E, the most common oncogenic form of the BRAF kinase that is mutated in nearly 50% of human melanomas. We found that, unlike wild-type melanocytes, melanocytes in transgenic BRAFV600Eanimals were binucleate and tetraploid. Furthermore, melanocytes in p53-deficient transgenic BRAFV600Eanimals exhibited 8N and greater DNA content, suggesting bypass of a p53-dependent arrest that stops cell cycle progression of tetraploid melanocytes. These data implicate tetraploids generated by increased BRAF pathway activity as contributors to melanoma initiation. Previous studies have used artificial means of generating tetraploids, raising the question of how these cells arise during actual tumor development. To gain insight into the mechanism by which BRAFV600E generates binucleate, tetraploid cells, we established an in vitro model by which such cells are generated following BRAFV600E expression. We demonstrate thatBRAFV600E-generated tetraploids arise via cytokinesis failure during mitosis due to reduced activity of the small GTPase RhoA. We also establish that oncogene-induced centrosome amplification in the G1/S phase of the cell cycle and subsequent increase in the activity of the small GTPase Rac1, partially contribute to this phenotype. These data are of significance as recent studies have shown that aneuploid progeny of tetraploid cells can be intermediates in tumor development, and deep sequencing data suggest that at least one third of melanomas and other solid tumors have undergone a whole genome doubling event during their progression. Taken together, our melanoma-prone zebrafish model and in vitro data suggest a role for BRAFV600E-inducedtetraploidy in the genesis of melanomas. To our knowledge, this is the first in vivo model showing spontaneous rise of tetraploid cells that can give rise to tumors. This novel role of the BRAF oncogene may contribute to tumorigenesis in a broader context.

Essentiel au maintien d’un organisme sain, la division cellulaire est un processus biologique composée de deux phases : la mitose et la cytokinèse. Au cours de la mitose, un fuseau mitotique bipolaire est assemblé et les chromosomes s’alignent au niveau de la plaque métaphasique par l’attachement des kinétochores aux microtubules du fuseau. Une fois les chromosomes alignés, les chromatides soeurs sont séparées par les microtubules pendant l'anaphase et sont ségréguées entre les cellules filles. La cytokinèse est initiée peu après le début de l'anaphase, marquant ainsi la fin de la division cellulaire en séparant le cytoplasme en deux nouvelles cellules filles. Une exécution précise de la mitose et de la cytokinèse est essentielle pour le maintien de l'intégrité du génome. L'échec de l'un de ces processus affecte la fidélité génétique. Les erreurs de ségrégation des chromosomes durant la mitose peuvent entraîner un gain ou une perte de chromosomes entiers, appelé aneuploïdie. Tandis que l'échec de la cytokinèse conduit à la formation d'une cellule binucléée avec un génome entièrement dupliqué, appelé tétraploïdie. Dans les cellules somatiques, la tétraploïdie peut conduire à l'arrêt du cycle cellulaire, à la mort cellulaire, ou provoquer une instabilité chromosomique (CIN), favorisant ainsi la prolifération de cellules avec un potentiel tumorigène. Par conséquent, il est essentiel de bien comprendre la régulation et les causes potentielles de l’échec de la cytokinèse en particulier dans le contexte des systèmes multicellulaires comme l’embryon. En effet, dans ces systèmes, la réduction progressives de la taille des cellules coïncident avec les principaux évènements du développement. De plus, la binucléation est fréquemment observée dans les cliniques de fertilité chez les embryons humains. Cependant, l’impact de la binucléation sur les divisions préimplantatoires demeure inexpliqué à ce jour. Afin de déterminer les conséquences de la tétraploïdie, nous avons utilisé l'embryon de souris pour modèle et réalisé des expériences d'immunofluorescence à haute résolution et une imagerie sur cellules vivantes. Nous avons découvert que la tétraploïdie chez les embryons de souris provoque une CIN et l'aneuploïdie par un mécanisme différent de celui des cellules somatiques. Dans les cellules somatiques, la formation des fuseaux multipolaires causée par des centrosomes surnuméraires est le principal mécanisme conduisant à la tétraploïdie et ainsi, à une CIN. En revanche, chez les embryons de souris, qui ne possèdent pas de centrosomes, la tétraploïdie ne conduit pas à la formation des fuseaux multipolaires. Les embryons tétraploïdes de souris développent une CIN en raison d’une réduction du renouvellement des microtubules et d’une altération de l’activité de correction d’erreurs dans l’attachement des kinétochores aux microtubules. Ainsi, une mauvaise correction de l’attachement des kinétochores aux microtubules entraîne des niveaux élevés d'erreurs de ségrégation chromosomique. Dans le cadre d'une étude de suivi, nous avons ensuite utilisé des différentes expériences d'imageries sur des cellules vivantes et d'immunofluorescences. Celles-ci furent couplées à des micromanipulations de la taille des cellules, des techniques modifiant l'adhésion cellulaire et des approches de knock-down des protéines pour étudier les mécanismes de régulation de la cytokinèse. Les expériences d'imageries sur cellules vivantes et les micromanipulations du volume cytoplasmique ont démontré que la taille des cellules détermine la vitesse de constriction de l'anneau contractile, c'est-à-dire que la vitesse de constriction devient progressivement plus lente à mesure que la taille des cellules diminue. Cependant, ce phénomène n'a lieu que lorsque les embryons atteignent le stade de 16 cellules ce qui suggère qu'une limite supérieure de vitesse de constriction peut exister pour restreindre l’augmentation de cette vitesse quand les cellules sont trop grandes. La taille des cellules étant un déterminant de la progression de la cytokinèse, nos expériences de knock-down des protéines ont, de plus, démontré que la formation de la polarité cellulaire a un impact négatif sur l'assemblage et la constriction de l'anneau contractile dans les cellules externes au stade de morula. Plus précisément, nous avons constaté que la polarité limite le recrutement des composants de la cytokinèse spécifiquement d'un côté de l'anneau contractile, provoquant ainsi un déséquilibre de l’ingression du sillon de clivage et réduisant la vitesse de constriction dans les cellules externes. Nous spéculons que la polarité cellulaire agit comme un obstacle à la progression de la cytokinèse, rendant ainsi les cellules externes plus sensibles à un échec de la cytokinèse. Ces études ont démontré un nouveau mécanisme par lequel la tétraploïdie conduit à l’instabilité chromosomique et à l’aneuploïdie chez les embryons. Ainsi un défaut de la dynamique de correction de l’attachement des kinétochores aux microtubules entraîne une mauvaise ségrégation des chromosomes indépendamment à la formation des fuseaux multipolaires. Ce travail a mis en évidence un rôle inhibiteur de la polarité apicale inattendu sur la machinerie cytokinétique. Cette inhibition pourrait fournir une explication mécanistique de l’incidence élevée de la binucléation dans le trophectoderme. Dans l'ensemble, ces résultats contribuent à notre compréhension du contrôle spatio-temporel de la cytokinèse au cours du développement embryonnaire et fournissent de nouvelles informations mécanistiques sur les origines et les conséquences biologiques de la tétraploïdie chez les embryons préimplantatoires. Les résultats présentés dans cette thèse ont des implications cliniques importantes, puisqu’ils fournissent des preuves définitives que la tétraploïdie générée par un échec de la cytokinèse est délétère pour le développement embryonnaire. Ces travaux mettent ainsi en lumière que la binucléation est un critère de sélection embryonnaire important à considérer lors des traitements de fertilité. / Cell division is comprised of mitosis and cytokinesis and is an essential biological process for the maintenance of healthy organisms. During mitosis, a bipolar spindle is assembled, and the chromosomes are aligned at the metaphase plate via the attachment of kinetochores to spindle microtubules. Once chromosome alignment is achieved, the sister chromatids are pulled apart by the microtubules during anaphase and segregated into the nascent daughter cells. Cytokinesis is initiated after anaphase onset and marks the completion of cell division by partitioning the cytoplasm of the dividing cell into two new daughter cells. Successful and timely completion of both mitosis and cytokinesis is key for the maintenance of genome integrity, and failure in either one of these processes affects genetic fidelity. Whereas chromosome segregation errors in mitosis can lead to whole chromosome gains or losses, termed aneuploidy, cytokinesis failure leads to the formation of a binucleated cell with an entirely duplicated genome, termed tetraploidy. In somatic cells, tetraploidy can either lead to cell cycle arrest and death or cause chromosomal instability (CIN), thereby promoting the proliferation of cells with high tumorigenic potential. Therefore, understanding cytokinesis regulation and the potential causes of cytokinesis failure is key, especially in the context of multicellular embryonic systems, wherein progressive cell size reductions coincide with developmental transitions. Moreover, binucleation is frequently observed in human embryos in fertility clinics, and whether binucleation impacts early divisions remains elusive. To elucidate the consequences of tetraploidy, we used the mouse embryo as a model and employed high-resolution immunofluorescence and live-cell imaging experiments. We found that tetraploidy in mouse embryos causes CIN and aneuploidy by a mechanism distinct from that of somatic cells. Whereas in somatic cells multipolar spindle formation caused by supernumerary centrosomes is the major mechanism by which tetraploidy leads to CIN, in mouse embryos - which are acentriolar – tetraploidy does not lead to multipolar spindle formation. Instead, mouse tetraploid embryos develop CIN due to reduced microtubule turnover and impaired error correction activity, which prevents the timely resolution of kinetochore-microtubule mis-attachments, thereby leading to high levels of chromosome segregation errors. As a follow-up study, we next employed live imaging and immunofluorescence experiments, coupled with micromanipulations of cell size, cell adhesion and protein knockdown approaches to investigate the regulatory mechanisms of cytokinesis. Live imaging experiments and micromanipulations of cytoplasmic volume demonstrated that cell size determines the speed of contractile ring constriction i.e., constriction speed becomes progressively slower as the cells decrease in size. However, this phenomenon takes place only when embryos reach the 16-cell stage, suggesting that an upper limit of constriction speed may exist to restrict the scalability of ring constriction to cell size. In addition to cell size being a powerful determinant of cytokinesis progression, our loss-of-function experiments revealed that the emergence of cell polarity negatively impacts contractile ring assembly and constriction in outer cells at the morula stage. More specifically, we found that polarity limits the recruitment of cytokinesis components specifically to one side of the contractile ring, thereby causing unbalanced furrow ingression and reducing constriction speed in outer cells. We speculate that cell polarity may act as an obstacle for cytokinesis progression and render outer cells to be more susceptible to cytokinesis failure. These studies have revealed a novel mechanism by which tetraploidy leads to chromosomal instability and aneuploidy in embryos, wherein defective kinetochore-microtubule dynamics cause chromosome mis-segregation in a manner independent of multipolar spindle formation. In addition, this work unravelled an unexpected inhibitory role of apical polarity on the cytokinetic machinery that might provide a mechanistic explanation for the high incidences of binucleation in the outer layer of blastocysts. Altogether, these findings contribute to our understanding of the spatiotemporal control of cytokinesis during embryonic development and provide new mechanistic insights into the origins and biological consequences of tetraploidy in preimplantation embryos. The results presented in this thesis have substantial clinical implications, as they provide definitive evidence that tetraploidy generated by cytokinesis failure is deleterious to embryonic development, therefore underlining binucleation as an important embryo selection criterion to be considered during fertility treatments.