As mitocôndrias desempenham um papel fundamental na sobrevivência e morte celular. Alterações do DNA mitocondrial (DNAmt) - como, por exemplo, amplificação, mutação homoplásmica, deleção e depleção -, bem como suas implicações clínico-patológicas, tem sido analisadas em inúmeras neoplasias humanas. No intuito de se pesquisar alterações mitocondriais associadas à tumorigênese, o presente trabalho teve como objetivos analisar a expressão de genes implicados no metabolismo energético e envolvidos na replicação e transcrição mitocondriais, quantificar o número de organelas mitocondriais e de cópias de DNAmt e analisar a expressão dos genes em astrocitomas de diferentes graus de malignidade (23 OMS grau I, 26 grau II, 18 grau III e 84 grau IV ou GBM) em relação ao tecido cerebral não tumoral (22 amostras). As expressões relativas dos genes selecionados, bem como as quantificações relativa e absoluta do DNA mitocondrial, foram realizadas por PCR em tempo real. O aumento de expressão relativa de genes-chave da via glicolítica, alterações nos níveis de expressão dos genes do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e hipoexpressão de genes da fosforilação oxidativa detectados corroboraram o efeito Warburg. Foi demonstrado que a redução do número de cópias do DNAmt está associada com o grau de malignidade dos astrocitomas difusamente infiltrativos, sendo GBM o mais depletado e independente do número de organelas. As médias observadas para tecido não tumoral, astrocitoma grau I, grau II, grau III e GBM foram, respectivamente, 1,28, 0,26, 0,45, 0,42 e 0,17. Níveis aumentados de expressão relativa dos genes dos fatores de transcrição mitocondriais A (TFAM), B1 (TFB1M), B2 (TFB2M) e da subunidade catalítica da polimerase mitocondrial (POLG) foram detectados em todos os graus de astrocitomas, exceto TFB2M em astrocitoma grau II. Embora exista forte correlação entre os fatores de transcrição mitocondriais, somente os níveis de expressão de POLG se correlacionaram inversamente com o número de cópias de DNAmt. A expressão elevada de TFAM está associada a uma maior sobrevida no grupo de pacientes com GBM, interpretada como compensatório. As hiperexpressões de TFAM e POLG estão relacionadas a um melhor prognóstico em pacientes com GBM. Embora nossos achados da disfunção do metabolismo intermediário e depleção do DNAmt em astrocitomas corroborem a literatura, ainda não está bem esclarecida sua implicação na iniciação e manutenção da transformação maligna. Investigações futuras são necessárias para o esclarecimento destas questões. / Mitochondria has a key role in cell survival and death. Mitochondrial DNA (mtDNA) alterations, for example, amplification, homoplasmic mutation, deletion and depletion, and their clinical and pathological implications have been analyzed in human malignancies. In order to search for mitochondrial alterations associated to tumorigenesis, this study aimed to analyze the expression levels of genes involved in energetic metabolism, and in mitochondrial replication and transcription, to quantify the number of mitochondrial organelle and mtDNA copy number in astrocytomas of different grades of malignancy (23 WHO grade I, 26 grade II, 18 grade III and 84 grade IV or GBM) related to non-neoplastic brain tissue (22 samples). The relative expression level of the selected genes as well as the relative and absolute quantification of mtDNA were performed by real-time PCR. Relative expression increase of glycolytic pathway key genes, change of citric acid cycle genes and hipoexpression of oxidative phosphorylation genes were detected, and confirmed the presence of Warburg effect. The reduced mtDNA copy number was associated to the grade of malignancy of diffusely infiltrating astrocytoma, being GBM the most depleted, and not related to parallel decrease in the number of organelle. The mean mtDNA copy number for non neoplastic tissue, astrocytoma grade I, grade II, grade III and GBM were respectively 1.28, 0.26, 0.45, 0.42 and 0.17. The increased relative gene expression of mitochondrial transcription factor A (TFAM), B1 (TFB1M), B2 (TFB2M) and the catalytic subunit of mitochondrial polymerase (POLG) were observed in all grades of astrocytoma, except TFB2M in grade II astrocytoma. Although a strong correlation was observed among the mitochondrial transcription factors, only the expression level of POLG correlated inversely to the mtDNA copy number. The overexpression of TFAM was associated with long-term survival in the GBM patients and interpreted as compensatory. TFAM and POLG overexpressions were related to better prognosis in GBM patients. Although our findings concerning the impairment of intermediary metabolism and depletion of mtDNA in astrocytomas confirmed previous reports, their role in initiation or maintenance of malignant transformation were not fully understood. Further investigations are needed to clarify these issues.

O fator de transcrição mitocondrial A (TFAM) pertence ao grupo das proteínas de alta mobilidade, apresentando um importante papel para a replicação, transcrição e estrutura/organização do DNA mitocondrial (DNAmt). O DNAmt está organizado em um complexo nucleoprotéico, chamado de nucleóide, do qual TFAM é o principal componente protéico, empacotando o DNAmt de forma análoga às histonas no DNA nuclear. Em analogia ao DNA nuclear, foi sugerido que esse empacotamento pode proteger o DNAmt do ataque de espécies oxidantes, enquanto que, por outro lado, poderia também impedir o acesso das enzimas de reparo. Este trabalho visou esclarecer qual o papel de TFAM na proteção do DNAmt e entender como TFAM influencia o reparo do DNAmt. Nossos resultados indicaram que o empacotamento do DNAmt por TFAM pode proteger o DNA da formação de lesões em condições de estresse oxidativo. Células com redução na expressão de TFAM apresentaram taxas alteradas de proliferação e uma menor viabilidade celular após o tratamento com o fotossensibilizador azul de metileno, indicando que TFAM pode contribuir para a manutenção da integridade funcional da mitocondria. A velocidade do reparo do DNAmt, em células Kd-TFAM, foi aparentemente maior, o que indicou a importância da modulação da interação de TFAM com o DNAmt para um reparo rápido e eficiente das lesões oxidadas. Portanto, TFAM desempenha um papel importante para a estabilidade genômica mitocondrial, protegendo o DNAmt dos efeitos deletérios das lesões oxidadas no estresse oxidativo, e também modulando a velocidade do reparo do DNAmt, provavelmente através de modificações/interações que permitam que as enzimas de reparo acessem as lesões no DNAmt. / The mitochondrial transcription factor A (TFAM) belongs to the high mobility group box proteins, and is essencial for replication, transcription and structure/organization of the mitochondrial DNA (mtDNA).The mtDNA is organized in a nucleoproteic complex called the nucleoid, where TFAMis the main protein component,packaging mtDNA in a manner similar to histones in the nuclear DNA. In analogy to the histone role in nuclear DNA, it was suggested that mtDNA packaging by TFAM could protect the mtDNA against oxidized lesions. On the other hand, it could also prevent the access of repair enzymes. This study aimed to understand whether TFAM plays a role in mtDNA stability through these opposing effects of protecting from damage and preventing repair. Our results indicated that TFAM protects the mtDNA against lesion formation upon oxidative stress. Cells with reduced expression of TFAM showed altered proliferation and lower cellular viability after treatment with the photoactivated dye methylene blue, indicating an important role for TFAM in maintaining mitochondrial function and cell survival. MtDNA repair rate was apparently higherin Kd-TFAM cells, which indicated the importance of modulating the interaction of TFAM with mtDNA for a quick and efficient repair of oxidized lesions. Therefore, TFAM plays an important role in maintaining mitochondrial genomic stability by protecting the mtDNA of the deleterious effects of oxidized lesions in oxidative stress, also modulating mtDNA repair, likely through modifications/interactions that modulate its DNA binding activity and access to lesions in mtDNA by DNA repair enzymes.

As mitocôndrias desempenham um papel fundamental na sobrevivência e morte celular. Alterações do DNA mitocondrial (DNAmt) - como, por exemplo, amplificação, mutação homoplásmica, deleção e depleção -, bem como suas implicações clínico-patológicas, tem sido analisadas em inúmeras neoplasias humanas. No intuito de se pesquisar alterações mitocondriais associadas à tumorigênese, o presente trabalho teve como objetivos analisar a expressão de genes implicados no metabolismo energético e envolvidos na replicação e transcrição mitocondriais, quantificar o número de organelas mitocondriais e de cópias de DNAmt e analisar a expressão dos genes em astrocitomas de diferentes graus de malignidade (23 OMS grau I, 26 grau II, 18 grau III e 84 grau IV ou GBM) em relação ao tecido cerebral não tumoral (22 amostras). As expressões relativas dos genes selecionados, bem como as quantificações relativa e absoluta do DNA mitocondrial, foram realizadas por PCR em tempo real. O aumento de expressão relativa de genes-chave da via glicolítica, alterações nos níveis de expressão dos genes do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e hipoexpressão de genes da fosforilação oxidativa detectados corroboraram o efeito Warburg. Foi demonstrado que a redução do número de cópias do DNAmt está associada com o grau de malignidade dos astrocitomas difusamente infiltrativos, sendo GBM o mais depletado e independente do número de organelas. As médias observadas para tecido não tumoral, astrocitoma grau I, grau II, grau III e GBM foram, respectivamente, 1,28, 0,26, 0,45, 0,42 e 0,17. Níveis aumentados de expressão relativa dos genes dos fatores de transcrição mitocondriais A (TFAM), B1 (TFB1M), B2 (TFB2M) e da subunidade catalítica da polimerase mitocondrial (POLG) foram detectados em todos os graus de astrocitomas, exceto TFB2M em astrocitoma grau II. Embora exista forte correlação entre os fatores de transcrição mitocondriais, somente os níveis de expressão de POLG se correlacionaram inversamente com o número de cópias de DNAmt. A expressão elevada de TFAM está associada a uma maior sobrevida no grupo de pacientes com GBM, interpretada como compensatório. As hiperexpressões de TFAM e POLG estão relacionadas a um melhor prognóstico em pacientes com GBM. Embora nossos achados da disfunção do metabolismo intermediário e depleção do DNAmt em astrocitomas corroborem a literatura, ainda não está bem esclarecida sua implicação na iniciação e manutenção da transformação maligna. Investigações futuras são necessárias para o esclarecimento destas questões. / Mitochondria has a key role in cell survival and death. Mitochondrial DNA (mtDNA) alterations, for example, amplification, homoplasmic mutation, deletion and depletion, and their clinical and pathological implications have been analyzed in human malignancies. In order to search for mitochondrial alterations associated to tumorigenesis, this study aimed to analyze the expression levels of genes involved in energetic metabolism, and in mitochondrial replication and transcription, to quantify the number of mitochondrial organelle and mtDNA copy number in astrocytomas of different grades of malignancy (23 WHO grade I, 26 grade II, 18 grade III and 84 grade IV or GBM) related to non-neoplastic brain tissue (22 samples). The relative expression level of the selected genes as well as the relative and absolute quantification of mtDNA were performed by real-time PCR. Relative expression increase of glycolytic pathway key genes, change of citric acid cycle genes and hipoexpression of oxidative phosphorylation genes were detected, and confirmed the presence of Warburg effect. The reduced mtDNA copy number was associated to the grade of malignancy of diffusely infiltrating astrocytoma, being GBM the most depleted, and not related to parallel decrease in the number of organelle. The mean mtDNA copy number for non neoplastic tissue, astrocytoma grade I, grade II, grade III and GBM were respectively 1.28, 0.26, 0.45, 0.42 and 0.17. The increased relative gene expression of mitochondrial transcription factor A (TFAM), B1 (TFB1M), B2 (TFB2M) and the catalytic subunit of mitochondrial polymerase (POLG) were observed in all grades of astrocytoma, except TFB2M in grade II astrocytoma. Although a strong correlation was observed among the mitochondrial transcription factors, only the expression level of POLG correlated inversely to the mtDNA copy number. The overexpression of TFAM was associated with long-term survival in the GBM patients and interpreted as compensatory. TFAM and POLG overexpressions were related to better prognosis in GBM patients. Although our findings concerning the impairment of intermediary metabolism and depletion of mtDNA in astrocytomas confirmed previous reports, their role in initiation or maintenance of malignant transformation were not fully understood. Further investigations are needed to clarify these issues.

Le facteur de transcription Staf et son orthologue humain ZNF143 sont impliqués dans l'activation de la transcription de gènes d'ARN non codants transcrits par l'ARN polymérase II et III et dans celle de 7 gènes de protéines. L'objectif de ma thèse était de caractériser de nouveaux gènes cibles de ce facteur chez l'homme. Par une approche bioinformatique couplée à des expériences de ChIP, nous avons montré qu'environ 10% des promoteurs de gènes de protéines humaines fixent hStaf/ZNF143. Ceci suggère que le site de liaison de hStaf/ZNF143 (SBS) est l'un des plus abondants dans les génomes de mammifères. En parallèle, nous avons étudié les promoteurs des gènes TFAM, BUB1B et SCARNA2 dans lesquels nous avons identifié des éléments conservés dont des sites SBS. Nous avons montré l'importance de ces éléments dans la transcription. Ces résultats mettent en évidence que Staf régule l'activité de gènes impliqués dans des processus cellulaires divers via des promoteurs à architectures variées.