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Connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) is axiomatically necessary for proper skeletal development and function. We need not look further than the studies that have been done to date utilizing mice genetically engineered to lack CTGF production. These CTGF null or knockout (KO) mice fail to form a normal murine skeleton and instead yield one littered with bony dysmorphisms, including incompetent craniofacial development, kinked limb bones, and misshapen ribs that are not conducive to proper respiratory function. As a result, the global lack of CTGF is incompatible with postnatal life. A closer look at several sites demonstrated defects in physiologic processes necessary for bone formation - angiogenesis, chondrogenesis, and osteogenesis. Therefore, the dogma in the CCN protein field to date has been that systemic ablation of CTGF production in vivo results in global defects in bone development. We believe this dogma is an oversimplification of the role of CTGF on skeletal development. Our initial impetus leading us to this belief was the gross identification of the specific skeletal sites malformed in CTGF KO mice, in particular the bones of the limbs. While in the lower limb of CTGF KO mice the tibiae and fibulae are misshapen, the adjacent femora and digits are phenotypically normal. The same is true for the upper limb, in which the radii and ulnae are phenotypically abnormal while the humeri and digits are normal. Therefore, we believe that the role of CTGF in skeletogenesis is site-specific such that its loss affects local skeletal patterning and/or mechanobiological cues resulting in the unique phenotype seen in CTGF KO mice. The research of this dissertation constitutes a comprehensive skeletal analysis of CTGF KO mice and in so doing we determined the extent and location of skeletal abnormalities. We found skeletal site-specific changes in growth plate organization, bone microarchitecture and shape and gene expression levels in CTGF KO compared to wild-type (WT) mice. Growth plate malformations included reduced proliferation zone and increased hypertrophic zone lengths. Appendicular skeletal sites demonstrated decreased metaphyseal trabecular bone, while having increased mid-diaphyseal bone and osteogenic expression markers. Axial skeletal analysis showed decreased bone in caudal vertebral bodies, mandibles, and parietal bones in CTGF KO mice, with decreased expression of osteogenic markers. Analysis of skull phenotypes demonstrated global and regional differences in CTGF KO skull shape resulting from allometric (size-based) and non-allometric shape changes. Localized differences in skull morphology included increased skull width and decreased skull length. We further continued the skeletal characterization of CTGF KO bones with an analysis of bone cell ultrastructure and matrix composition. These studies demonstrated that, while CTGF is not necessary for complete morphologic maturation of bone cells, global ablation results in ultrastructural features not commonly seen in WT bones. Our findings include drastically dilated rough endoplasmic reticulum (RER) in osteoblasts of the tibial diaphyseal region, comprising the phenotypic kink in CTGF KO mice and ultrastructural dysmorphologies of CTGF KO osteoclasts including multi-layered, membranous inclusions, decreased vacuolization and ruffled border extents, and disproportionately large clear zones. Lastly, FT-IR analysis demonstrated heterogeneity in CTGF KO bone composition. The results of this dissertation have revealed a more complex role for CTGF in osteogenesis and have identified potential mechanisms and future research directions to fully understand this intricate story. / Cell Biology

Hyaluronan (HA) ist ein nicht sulfatiertes Glykosaminoglykan, welches in der dermalen Extrazellularmatrix eine große Rolle als wasserspeicherndes Molekül spielt. Nach aktuellem Forschungsstand wird dem HA auch eine entscheidende Bedeutung u.a. in der Zellkommunikation und der Gewebehomöostase zugesprochen. Auswirkungen eines deutlich verminderten HA-Gehalts auf die Dermis im Ruhezustand wurden bisher wenig beleuchtet. Klinisch führen die Applikation von Glucocorticoiden und Exposition mit ultraviolettem Licht zu diesem Zustand. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine Teiluntersuchung der Folgen nach HA-Suppression auf die ECM der ruhenden Dermis und ihrer Zellen. Wir analysierten ebendiese am Mausmodell auf mRNA-, Protein- und mikroskopischer Ebene. Wir nahmen an, dass durch HA-Reduktion eine Reorganisation der ECM mit Induktion anderer ECM-Komponenten zur Kompensation des HA-Verlusts stattfindet. Mithilfe eines konditionalen Knockout-(KO)-Modells der murinen HA-Synthase Has2 konnten wir eine suffiziente HA-Reduktion im murinen in vivo-Gewebe erreichen. Histologisch wiesen wir bei diesen Mäusen eine erhöhte Ablagerung an Kollagenen verglichen mit Kontrolltieren nach. In vivo-Genexpressionsanalysen zeigten eine signifikant erhöhte Induktion der Kollagene Typ I und III, den häufigsten Kollagentypen der Dermis. Auf Proteinebene wurde zudem ein erhöhter Gehalt der Kollagen-spezifischen Aminosäure Hydroxyprolin nachgewiesen. Diese Resultate unterstützten die Hypothese der ECM-Reorganisation. Im nächsten Schritt untersuchten wir an Fibroblasten (Fb) und gewebeständigen M2-Makrophagen (Mφ) in vitro eine konkrete Zellkommunikation, die für die Kollagenvermehrung in vivo ursächlich sein könnte. Beide Zellarten kommen in vivo in hoher Zahl in der ruhenden Dermis vor. Fb produzieren den Großteil der ECM, insb. Kollagene und andere fibrilläre Proteine. Aus der Literatur ist bekannt, dass gewebeständige Mφ sowohl mit HA als auch mit Fb komplex interagieren. Zudem sezernieren M2-Mφ zahlreiche profibrotische Zytokine und Wachstumsfaktoren (insb. TGF-β1), welche Einfluss auf den Differenzierungszustand und die Kollagensynthese bei Fb nehmen. Wir stellten die Hypothese auf, dass M2-Mφ im veränderten Microenvironment bei vermindertem HA die Fb hinsichtlich Differenzierungszustand und Matrixsynthese beeinflussen. Aufgrund verringerter Effektivität des Has2-KO im Arbeitsverlauf wurde das HA-Suppressionsmodell für die in vitro-Versuche umgestellt. Die HA-Suppression erfolgte nun mithilfe des etablierten 4- Methylumbelliferon (4MU), welches auf die Zellkulturen appliziert wurde. 4MU wirkt via Depletion eines HA-Vorläuferbausteins suffizient bei Fb. In eigenen Untersuchungen an Fb- und Mφ-Monokulturen in vitro verifizierten wir Effizienz, Reversibilität und Nicht-Toxizität der 4MU-Wirkung auf die Zellen unserer Population erfolgreich. Darauf aufbauend legten wir in vitro-Ko-Kulturen mit murinen Fb und M2-Mφ an. Der residente M2-Status der Mφ wurde durch vorherige IL-4-Applikation über mehrere Tage erreicht. 4MU-beeinflusste Ko-Kulturen wurden gegen nicht beeinflusste Ko-Kulturen verglichen. Zudem variierten wir die Kultivierungsdauer (48 h; 72 h) und das Zellzahlverhältnis der Ko-Kulturen: Eine Ko-Kulturkondition umfasste zehn Anteile Fb und einen Anteil Mφ (10:1-Ko-Kultur); die andere Kondition umfasste einen Anteil Fb und zehn Anteile Mφ (1:10-Ko-Kultur). Nach Ko-Kultivierung trennten wir Fb und Mφ mittels Magnetismus-basierter Separation anhand der CD11b-Oberflächenpräsentation in CD11b-positive Fraktion (murine Mφ) und CD11b-negative Fraktion (murine Fb). Die Reinheit der Separation wurde mittels Durchflusszytometrie verifiziert. Anschließend analysierten wir in Mφ die Expression von Genen, welche die Schlüsselkomponenten eines profibrotischen Signalwegs mit folgender Sekretion von TGF-β1 darstellen (Tlr2, Tlr4, Myd88, Tgfb1). Zudem wurde der bedeutendste HA-Transmembranrezeptor CD44 auf mRNA- und Zelloberflächenebene untersucht. Hinsichtlich der Fb analysierten wir die Genexpression der Kollagene Typ I und III (Col1a1, Col3a1), des fibrillären Matrixproteins ED-A-FN1, sowie verschiedener Gene, die mit dem verstärkten Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren (Tgfb1, Tgfbr1, Ccn2, Cox2). Durch Genexpressionsanalyse des Myofibroblastenmarkers αSMA wurde ein möglicher Differenzierungsprozess der Fb durch Wirkung von TGF-β1 untersucht. In Mφ- und Fb-Monokulturen, die als Kontrollen angelegt wurden, konnte im Wesentlichen keine signifikante Wirkung des 4MU auf die untersuchten Gene festgestellt werden. Mögliche Unterschiede auf mRNA-Ebene innerhalb ko-kultivierter Zellen wurden dadurch aussagekräftig. Durch Fb-Monokulturen, welche mit TGF-β1 im Überschuss versetzt wurden, verifizierten wir die Stimulierbarkeit unserer Fb-Population. Die genannten Gene sollten nach TGF-β1-Gabe in Fb vermehrt induziert werden; hier zeigten sich mehrheitlich adäquate Resultate. Wir konnten in Mφ aus 4MU-behandelten Ko-Kulturen eine tendenziell erhöhte Genexpression der Toll-like-Rezeptoren (Tlr2, Tlr4) sowie des Tlr-assoziierten Myd88 feststellen. Zudem wurde mithilfe einer durchflusszytometrischen Analyse gezeigt, dass Mφ nach 4MU-Applikation insgesamt weniger CD44 auf der Zelloberfläche präsentieren. Dies ist ein Indiz dafür, dass Mφ ihre extrazelluläre Umgebung wahrnehmen und ihre Rezeptorexpression ab-hängig vom HA-Gehalt verändern. In ko-kultivierten Fb wurde nach 4MU-Applikation eine signifikant verstärkte Genexpression der Kollagene Typ I und III gemessen; dieses Ergebnis war konkludent zu den erläuterten in vivo-Daten. Ebenfalls wurde bei Untersuchungen des Myofibroblastenmarkers αSMA sowie von Genen, die mit dem Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren, eine höhere Geninduktion bei HA-supprimierter Kultur nachgewiesen. Diese Daten aus ko-kultivierten Fb liefern Hinweise dafür, dass nach HA-Suppression durch Anwesenheit von Mφ eine Zellkommunikation mit profibrotischem Effekt bei Fb ablaufen könnte. Tendenziell schwache Unterschiede zwischen 4MU-behandelten und 4MU-unbehandelten Ko-Kulturen sind vor dem Hintergrund einer mäßigen 4MU-Wirkung zu sehen: Nach ELISA-Messung fiel die HA-Suppression in den Ko-Kulturen schwächer aus als in vorherigen Mono-kultur-Versuchen und Vergleichsstudien. Als Gründe für diese schwächere HA-Reduktion sind Interaktionen mit dem Medium und ko-kultivierenden Mφ zu vermuten – die 4MU-Wirkung auf Immunzellen und ko-kultivierende Zellen in vitro ist in der Literatur nur unzureichend untersucht. Zudem sind einige Sekundär-Effekte von 4MU bekannt, die sich auf die Proliferation der Fb, die Synthese und Aktivierung verschiedener ECM-Komponenten neben dem HA sowie auf den allgemeinen Zellmetabolismus auswirken. Diese Effekte könnten potenziell Einfluss auf unsere Resultate nehmen. Insgesamt konnten wir Hinweise dafür gewinnen, dass HA-Suppression direkte Folgen für den Umbau der ECM hat. Ebenfalls konnten wir Hinweise dafür sammeln, dass unter HA-Suppression eine profibrogene Zellkommunikation zwischen Mφ und Fb besteht. Diese Kommunikation resultierte bei Fb in erhöhter Transkription von Komponenten des TGF-β1-Signalwegs, von Kollagenen und Markern eines profibrotischen Differenzierungsstatus. Da sich diese erhöhten Genexpressionen zumeist erst nach 72 h zeigten, wäre eine Betrachtung der Ko-Kulturen mit längeren Kultivierungszeiten sinnvoll. Ebenso könnten eine Genexpressionsanalyse zusätzlicher profibrotischer Zytokine und Mediatoren, die von Mφ sezerniert werden (bspw. IL-6) sowie ein TGF-β1-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen angeschlossen werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt neue Ergebnisse bezüglich des Forschungsfeldes zu vermindertem HA-Gehalt. Hinsichtlich des zuvor wenig charakterisierten Has2-KO-Modells konnte eine signifikante Vermehrung von Kollagenen bei HA-Suppression beschrieben wer-den. Ebenso wurde erstmals in vitro eine spezifische Rolle von vermindertem HA innerhalb der mannigfaltigen Beziehungen zwischen Fb und M2-Mφ untersucht. Hierbei konnten wir Indizien für einen Mφ-vermittelten Signalweg bei HA-Verminderung gewinnen. Diese Arbeit bildet somit eine Grundlage für sich anschließende in vivo- und in vitro-Studien zum Komplex der HA-Suppression in der Haut.:INHALTSVERZEICHNIS I ABBILDUNGSVERZEICHNIS V TABELLENVERZEICHNIS VII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX 1. EINLEITUNG 1 1.1. Funktion und Aufbau der menschlichen Haut 1 1.2. Zelluläre und Extrazelluläre Bestandteile der Dermis 3 1.2.1. Allgemeine Zelluläre Bestandteile 3 1.2.2. Myofibroblasten – Funktion und Charakterisierung 5 1.2.3. Extrazelluläre Matrix (ECM) 6 1.3. Hyaluronan als zentraler Bestandteil der ECM 8 1.3.1. Aufbau, biochemische Eigenschaften, Funktionen und Vorkommen 8 1.3.2. Metabolismus 10 1.3.3. Rezeptoren und Signalwege 11 1.4. Ziel der Dissertation 14 2. MATERIALIEN 17 2.1. Mausstämme 17 2.2. Puffer, Lösungen und Medien 17 2.3. Chemikalien, Enzyme und Reagenzien 18 2.4. DNA-Primer 20 2.5. Kits 21 2.6. Antikörper für Durchflusszytometrie 21 2.7. Geräte 22 2.8. Verbrauchsmaterialien 24 2.9. Software 25 3. METHODEN 27 3.1. Arbeiten am Tiermodell 27 3.2. Induzierbarer Has2-KO in Versuchstieren 27 3.2.1. Das Cre/loxP-System 27 3.2.2. Induktion des Has2-KO in vivo 29 3.3. In vitro-Versuche 30 3.3.1. Zellkulturen 30 3.3.2. Isolation muriner Fb und Kulturerhalt 30 3.3.3. Trypsinieren und definiertes Aussäen der Fb 31 3.3.4. Isolation muriner Mφ und Kulturerhalt 31 3.3.5. Durchführung der Ko-Kultur-Versuche 32 3.4. Molekularbiologische Untersuchungen 33 3.4.1. RNA-Isolation aus Zellkulturen 33 3.4.2. RNA-Isolation aus Hautgewebe 33 3.4.3. RNA-Konzentrationsbestimmung und Analyse der Reinheit 34 3.4.4. cDNA-Synthese durch reverse Transkription 34 3.4.5. Herstellung von Standard-Plasmiden für RT-PCR 35 3.4.6. Quantitative RT-PCR 37 3.4.7. HA-ELISA 39 3.4.8. Hydroxyprolin-Assay 40 3.5. Analyse spezifischer Zellpopulationen 41 3.5.1. Separation von CD11b-positiven Zellen aus Ko-Kulturen 41 3.5.2. Durchflusszytometrie 42 3.6. Histologische Analysen 44 3.6.1. Anfertigen von Paraffinschnitten sowie Entparaffinierung 44 3.6.2. Histochemische Masson-Trichrom-Färbung 45 3.7. Statistische Methoden 46 4. ERGEBNISSE 47 4.1. Histologische Analyse des Has2-KO-Phänotyps in ruhender Haut 47 4.2. mRNA-Analyse am Has2-KO-Modell in vivo 48 4.3. Proteinanalysen am Has2-KO-Modell in vivo 49 4.4. Umstellung der HA-Suppression auf 4MU-Modell 50 4.4.1. Pharmakologische Unterdrückung der HA-Synthese durch 4MU sowie Evaluierung der Dosis 51 4.4.2. Untersuchungen zu Effizienz und Reversibilität der 4MU-Wirkung 52 4.4.2.1. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 96 h 53 4.4.2.2. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 15 Tage 54 4.4.2.3. Kultivierung von murinen Mφ mit 4MU 56 4.5. Fb-Mφ-Kokultur-Versuche 59 4.5.1. Etablierung des Ko-Kultur-Settings 59 4.5.2. HA-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen 62 4.5.3. Genexpressionsanalysen in Mφ aus Ko-Kulturen 63 4.5.3.1. Analyse von Tlr2 63 4.5.3.2. Analyse von Tlr4 65 4.5.3.3. Analyse von Myd88 66 4.5.3.4. Analyse von Tgfb1 67 4.5.3.5. Analyse von Cd44 69 4.5.4. Genexpressionsanalysen in Fb aus Ko-Kulturen 71 4.5.4.1. Analyse von αSMA 71 4.5.4.2. Analyse von Col1a1 73 4.5.4.3. Analyse von Col3a1 75 4.5.4.4. Analyse von ED-A-FN1 76 4.5.4.5. Analyse von Tgfbr1 78 4.5.4.6. Analyse von Ccn2 79 4.5.4.7. Analyse von Cox2 81 4.5.4.8. Analyse von Tgfb1 82 4.5.5. Zusammenfassung der Genexpressionsanalysen aus Ko-Kulturen 84 4.5.6. Durchflusszytometrische Untersuchungen 85 4.5.6.1. Evaluierung der Reinheit von Fb- und Mφ-Separation 85 4.5.6.2. Analyse von CD44 auf der Zellmembran von Mφ 86 5. DISKUSSION 89 5.1. Grundlage der Arbeitsidee 89 5.2. Betrachtung der in vivo-Ergebnisse (Has2-KO) 90 5.3. Effizienz und Einflüsse der verwendeten HA-Suppressionsmodelle 94 5.4. Betrachtung der in vitro-Ergebnisse (4MU-Applikation) 97 5.5. Fazit und Ausblick auf zusätzliche in vitro-Untersuchungen 106 6. ZUSAMMENFASSUNG 109 LITERATURVERZEICHNIS 115 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT i ANERKENNUNG DER PROMOTIONSORDNUNG iii LEBENSLAUF v DANKSAGUNG vii

La paroi vasculaire est composée de cellules endothéliales, de cellules musculaires lisses vasculaires et de fibroblastes qui sont entourés d’un réseau structuré et complexe de protéines, la matrice extracellulaire. Les interactions réciproques entre la matrice et les cellules sont nécessaires à la croissance, au développement et au remodelage. Or, différents contextes pathologiques entraînent la perturbation de ces interactions et sont la cause de différentes maladies. Au cours du vieillissement, la matrice extracellulaire des grosses artères élastiques est modifiée. Ainsi, les lamelles élastiques de la paroi vasculaire se fragmentent ou sont dégradées, en plus de calcifier. De même, l’accumulation de protéines plus rigides, comme le collagène, entraîne le développement de la fibrose. Ces modulations vont mener à l’augmentation de la rigidité artérielle et au développement de l’hypertension systolique isolée. En utilisant un modèle animal de calcification basé sur l’inhibition d’une protéine anti-calcifiante, la matrix Gla protein, avec la warfarine, nous avons étudié la séquence des événements impliqués dans le développement de l’hypertension systolique isolée. Nous avons observé l’activation précoce et transitoire de MMP-9, puis du TGF-ß, précédant la modulation phénotypique des cellules musculaires lisses vasculaires, la calcification et les changements hémodynamiques. L’inhibition des métalloprotéinases et du TGF-ß a permis de prévenir la calcification vasculaire. Nous avons également étudié le rôle joué par une enzyme de la matrice extracellulaire, la transglutaminase 2, dans le développement de la calcification associée à l’hypertension systolique isolée. À l’aide d’un nouvel inhibiteur de cette enzyme, qui a permis de prévenir la calcification, nous avons établi que la transglutaminase était un élément clé dans le processus pathologique. Ces travaux ont permis de démontré l’intérêt de nouvelles avenues thérapeutiques ciblant directement la matrice extracellulaire, particulièrement la MMP-9, le TGF-ß et la transglutaminase 2, dans la pathologie de l’hypertension systolique isolée. / Within the vascular wall, endothelial cells, vascular smooth muscle cells and fibroblasts are surrounded by a complex and structured network of secreted macromolecules and proteins, the extracellular matrix. Reciprocal interactions between matrix and cells are essential to growth, development and remodeling. However, in pathological situations, the alteration of these interactions can lead to the development of different disease states. With aging, the extracellular matrix of large elastic arteries undergoes several modifications. The elastic lamellae are fragmented or degraded and calcify, whereas more rigid proteins, such as collagen, accumulate and cause fibrosis. These alterations are associated with the stiffening of arteries, which results in the development of isolated systolic hypertension. In order to study the sequence of events occuring in the development of this pathology, we used an animal model of calcification based on the inhibition of a matrix Gla protein, which physiologically prevents calcification, with warfarin. We observed an acute and transient activation of MMP-9 and TGF-ß, which preceded the phenotypic modulation of vascular smooth muscle cells, calcification and changes to hemodynamic parameters. Moreover, the inhibition of MMPs and TGF-ß prevented vascular calcification. We also studied the role of an extracellular matrix enzyme, transglutaminase 2, in the development of vascular calcification associated with isolated systolic hypertension. Using a novel inhibitor of this enzyme, we established a key role for transglutaminase 2 in this pathological process. This thesis demonstrates the relevance of directly targeting the extracellular matrix, particularly MMP-9, TGF-ß and transglutaminase 2, as a novel therapeutic avenue in the treatment of isolated systolic hypertension.

Wachstumsfaktoren sind wichtige Steuerelemente des Knochenzellmetabolismus. Im Verlauf der Frakturheilung kommt es zur Ausschüttung von zahlreichen Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Botenstoffen im und um den Bereich des Frakturspalts, die systemisch oder lokal, endokrin, parakrin oder autokrin wirksam werden können. Für verschiedene Wachstumsfaktoren konnten in zahlreichen Studien osteoinduktive und die Frakturheilung positiv beeinflussende Wirkungen nachgewiesen werden. In vitro und in vivo Studien belegen, dass einige dieser Faktoren wie Insulin-like growth factor-I (IGF-I), Transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) und Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) einen stimulierenden Effekt auf osteo- und chondrogene Zellen aufweisen und somit die Knochenheilung stimulieren. Der genaue Wirkmechanismus dieses positiven Effektes der Wachstumsfaktoren und ihre Interaktion im Verlauf der Frakturheilung ist nicht bekannt. Die lokale Applikation der Faktoren für einen therapeutischen Einsatz bei der Frakturheilung stellte bisher jedoch ein Problem dar. Mit der entwickelten biodegradierbaren Poly(D,L-Laktid)-Beschichtung von Implantaten können eingearbeitete Wachstumsfaktoren kontrolliert und lokal direkt an der Fraktur freigesetzt werden. Das beschichtete Implantat dient dabei der Stabilisation der Fraktur und gleichzeitig als Wirkstoffträger. Die Beschichtung weist eine hohe mechanische Stabilität auf. Die eingearbeiteten Wachstumsfaktoren behalten ihre biologische Aktivität in der Beschichtung und werden kontrolliert lokal freigesetzt. Um den Effekt lokal applizierter Wachstumsfaktoren auf die Frakturheilung zu untersuchen, wurde ein standardisiertes geschlossenes Frakturmodell entwickelt, das der klinischen Situation möglichst nahe ist und reproduzierbar durchgeführt werden kann. Untersucht wurde der Effekt der Wachstumsfaktoren IGF-I, TGF-beta1 und BMP-2 und des Trägermaterials PDLLA sowie lokale und systemische unerwünschte Wirkungen. Die Ergebnisse zeigten einen signifikant grösseren stimulierenden Effekt von IGF-I auf die Frakturheilung im Vergleich zur TGF-beta1 Applikation. Die kombinierte Gabe beider Faktoren ergab einen signifikant grösseren Effekt auf die torsionale Stabilität und die Kallusreifung im Vergleich zur Einzelapplikation. Beide Faktoren scheinen einen synergistischen Effekt auf die Frakturheilung zu haben. Die lokale Applikation von BMP-2 beschleunigte ebenso, wie die lokale Freisetzung von IGF-I und TGF-beta1 die Frakturheilung signifikant. Deutliche Unterschiede zwischen IGF-I / TGF-beta1 und BMP-2 konnten nicht festgestellt werden.Allerdings zeigte sich bei der Verwendung von BMP-2 auch ausserhalb der Frakturzone eine grössere Mineralisation der Kortikalis, die bei IGF-I / TGF-beta1 nicht zu beobachten ist. Auch im Grosstiermodell bestätigte sich die Wirksamkeit dieser bioaktiven Oberflächen-beschichtung auf die Osteotomieheilung. Die PDLLA-Beschichtung alleine, ohne eingearbeitete Wachstumsfaktoren, zeigte bereits einen positiven Effekt auf die Frakturheilung. Die Untersuchungen belegen, dass die lokale Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus einer biodegradierbaren PDLLA-Beschichtung von Implantaten die Frakturheilung signifikant beschleunigt, wobei keine unerwünschten lokalen oder systemischen Wirkungen beobachtet werden konnten. Bei dem Vergleich lokaler (durch Wachstumsfaktoren) mit systemischer Stimulationsmöglichkeit (durch Wachstumshormon) der Frakturheilung lässt sich zusammenfassend feststellen, dass die kombinierte Anwendung beider Stimulationsmöglichkeiten zu keiner weiteren Steigerung der Heilungsvorgänge führte. Weitere Untersuchungen wurden hinsichtlich der genauen Rolle und Interaktion der Wachstumsfaktoren durchgeführt. Vor allem die Frühphase scheint hierbei eine entscheidende Rolle bei der Frakturheilung einzunehmen. Es zeigte sich hierbei eine deutliche Stimulation der Osteoblastendifferenzierung mit einer Erhöhung der Kollagen-1 Produktion in vitro sowie eine Steigerung der Proliferationsrate und Angiogenese mit einem schnelleren Ablauf der Phasen der Frakturheilung in vivo durch lokal appliziertes IGF-I und TGF-beta1. Weitere Anwendungen der entwickelten Beschichtungstechnologie stellen die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren von beschichteten PDLLA-Cages bei der intervertebralen Spondylodese sowie die lokale Applikation von Antibiotika aus einer PDLLA-Beschichtung von Implantaten zur Prophylaxe der Implantat-assoziierten Osteomyelitis dar.Basierend auf diesen Ergebnissen steht der Einsatz PDLLA-Gentamicin beschichteter intramedullärer Tibianägel kurz vor der klinischen Anwendung.Eine Zulassung durch die entsprechenden Behörden ist erfolgt.Die klinische Anwendung Wachstumsfaktoren-beschichteter Implantate ist bereits in der Vorbereitung. / Growth factors are important regulators of bone metabolism. During fracture healing many growth factors or cytokines were locally released at the facture site. In several studies, different growth factors demonstrated osteoinductive and fracture stimulating properties. In vitro and in vivo studies showed a stimulating effect of Insulin-like growth factor-I (IGF-I), Transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) and Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) on osteo- and chondrogenetic cells. The exact effectiveness and the interaction of these growth factors during fracture healing is not known so far. Further, the local application of these factors for therapeutically use in fracture treatment is still a problem. The developed biodegradable poly(D,L-lactide)-coating of implants allows the local and controlled release of incorporated growth factors directly at the fracture site. The coated implant serves on the one hand for fracture stabilization and on the other hand as a drug delivery system. The coating has a high mechanical stability. The incorporated growths factors remain biologically active in the coating and were released in a sustained and controlled manner. To investigate the effect of locally released growth factors IGF-I, TGF-beta1 and BMP-2 and the carrier PDLLA on fracture healing, standardised closed fracture models were developed with a close relationship to clinical situation. Further, possible local and systemic side effects were analysed. The results demonstrated a significantly higher stimulating effect of IGF-I on fracture healing compared to TGF-beta1. The combined application of both growth factors showed a synergistic effect on the mechanical stability and callus remodeling compared to single treatment. The local release of BMP-2 also enhanced fracture healing significantly - comparable to combination of IGF-I and TGF-beta1. However, a higher rate of mineralisation was measurable outside the fracture region using BMP-2 in a rat fracture model. Using a large animal model on pigs with a 1 mm osteotomy gap, the effectiveness of locally released growths factors could be confirmed. Further, the PDLLA-coating without any incorporated growth factors demonstrated a significantly effect on healing processes in both models. These investigations showed, that the local release of growth factors from PDLLA coated implants significantly stimulate fracture healing without any local or systemic side effects. Comparing systemic with local stimulation techniques, we found an improvement of fracture healing by systemic administration of growth hormone and local application of IGF-I and TGF-beta1. However, the combined use of both simulation techniques did not lead to a further increase of healing processes. Investigations on the effectiveness and the interaction of growth factors during fracture healing demonstrated an dramatic effect in the early phases of healing processes. The growth factors stimulate the differentiation of osteoblasts with a higher production of collagen I in vitro and increase osteogenesis and vascularisation of the fracture callus in vivo. Further applications of the coating technology are the use of PDLLA and growth factor coated cages for the stimulation of intervertebral fusion and the use of PDLLA and Gentamicin coated implants in order to prevent implant associated infections. The clinical use of antibiotic and growth factor coated implants are in preparation.

Introdução: Os lasers fracionados não ablativos são efetivamente utilizados no rejuvenescimento da pele. As novas tecnologias a laser permitem uma remodelação dérmica seletiva, sem ablação da epiderme. Objetivo: Avaliar a eficácia do laser Erbium Glass (Sellas Evo) fracionado não ablativo 1550nm no rejuvenescimento facial através do estudo da quantificação histomorfométrica de fibras colágenas e elásticas, a expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) por imuno-histoquímica , a análise das fases do ciclo celular, o potencial elétrico da membrana mitocondrial, a expressão de interleucina-1 (IL-1), o marcador celular endotelial CD34, o receptor do fator transformador de crescimento beta (TGF-beta), atividade da caspase-3 por citometria de fluxo e as alterações ultraestruturais na pele por microscopia eletrônica de varredura, 4 meses após o tratamento com laser. Materiais e Métodos: Quinze indivíduos (média de 56,4 anos, fototipo II-IV), com fotoenvelhecimento cutâneo na face fizeram 3 tratamentos com laser Erbium Glass fracionado não ablativo 1550nm usando uma fluência de 70 mJ e uma densidade de 100 cm2. Foram avaliados biópsias na região pré-auricular em 15 pacientes no início e 4 semanas após o tratamento final. Os níveis de expressão dos receptores e a atividade do potencial elétrico mitocondrial foram analisados na suspensão de células da derme obtida a partir da digestão por colagenase. A avaliação clínica e fotográfica foi analisada quatro semanas após o final do tratamento. Resultados: Após 4 meses do início do tratamento foi observada melhora clínica moderada, com uma média de satisfação de 8,8, as fibras de colágeno aumentaram em 6,68%, as fibras elásticas mostraram uma diminuição de 12,85%, o ICAM-1 aumentou 4,47% significativamente na área dos vasos. Houve aumento significativo dos níveis de expressão do receptor de IL-1 e TGF-beta após o tratamento com laser Erbium Glass. As respostas proliferativas e a ausência de apoptose dependente da caspase-3 foram observadas nas suspensões de células após o tratamento. Conclusão: Rejuvenescimento facial com laser Erbium Glass fracionado não ablativo 1550nm demonstrou melhora visível no fotoenvelhecimento, assim como, aumento significativo da expressão de IL-1 e receptores de TGF-beta, que estão envolvidos na remodelação e indução da proliferação de componentes da matriz extracelular da pele. O grau de satisfação foi alto especialmente em relação à textura, rugas e discromias / Background: Non-ablative fractional lasers have been effectively used in skin rejuvenation. The new laser technologies allow selective dermal remodeling without ablation of the epidermal surface. Objectives: to evaluate the efficacy of the 1550nm Erbium Glass Laser (Sellas Evo) for facial rejuvenation through study of the histomorphometric quantification of colagen and elastic fibers; the expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) by immnohistochemistry; and analysis of the cell cycle phases, the electrical potential of the mitochondrial membrane and the expression of interleukin 1 (IL-1), the endothelial cell marker CD34 and transforming growth factor beta (TGF-beta) receptors, caspase-3 activity by flow cytometry and the ultrastructural changes in the skin by scanning electron microscopy 4 months after the laser treatment. Materials and methods: fifteen subjects (mean age 56,4 skin typoes II-IV) with photodamage on the face and wrinkles had 3 treatments with the 1550 nm Erbium Glass Laser using a fluence of 70 mJ and a density of 100 cm2. Pre-auricular biopsies from 15 subjects were evaluated at baseline and 4 weeks after the final treatment. Receptor expression levels and the presence of potentially functional mitochondria were analyzed in a cell suspension obtained from collagenase digestion of the skin. Data from the photo assessments and the subjects\' self-assessed improvements were analyzed 4 weeks after the final treatment.Results: Four months after the last treatmenbt application, clinical improvement was observed, with an average satgisfation score of 8.8, corresponding to moderate improvement. After 4 months of treatment, collagen fibers had increased up to 6.68%, while the average proportion of collagen fibers in the dermis, the elastic fibers, showed a 12.85% decrease of ICAM-1 and a mean increase in vessel area of 4.47%.Significantly enhanced IL-1 and TGF-beta receptor expression levels were identified after Erbium Glass Laser treatment. Proliferative responses and non-apoptosis-dependent caspase-3 activity were both observed in the cell suspensions after dermal treatment. Conclusion: Non-ablative rejuvenation with the 1550 mn Erbium Glass Laser was of the IL-1 and TGF-beta receptors, that are involved in remodeling and induced proliferation components in the extracellular matrix of skin fibers. The subjects were highly satisfied, especially regarding texture, rhytids and dyschromia

<p>Transforming growth factor-β (TGF-β) is a member of a large superfamily of cytokines which participate in many different types of cellular processes, such as growth inhibition, cell migration, differentiation, cell adhesion, wound healing and immunosuppression. Alterations of TGF-β superfamily signalling results in several different disorders, including bone disease, vascular disease and cancer. The TGF-β signalling pathways involve several different proteins, such as the Smad proteins, which upon receptor activation are translocated to the nucleus, where they affect transcriptional responses. </p><p>The actin cytoskeleton is an organised network of filaments with a highly dynamic structure, which is under a continuous reconstruction to control the morphology, survival, growth and motility of eukaryotic cells. The members of the family of small GTP-binding proteins have been shown to be important regulators of the actin cytoskeleton.</p><p>TGF-β was found to induce short term as well as long term actin reorganisation in prostate cancer cells. The short term response included membrane ruffling, and required signalling by the small GTPases Cdc42 and Rho as well as, the involvement of the mitogen-activated protein kinases p38 (p38 MAPK). The long term response included formation of stress fibers and required a cooperation between Smad and Rho GTPase signalling pathways involving the Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1 (ROCK1). </p><p>The TGF-β-induced activation of Cdc42 was, furthermore, shown to require the inhibitory Smad7 and p38 MAP kinase, via a PI3K-dependent pathway. Mixed lineage kinase 3 (MLK3), a mediator downstream of Cdc42, was necessary for the Cdc42-dependent actin filament reorganisation.</p><p>Apoptosis is an important and carefully regulated process in human development and disease, which allows the multicellular organisms to remove cells that are in excess or potentially dangerous. TGF-β family members can induce apoptosis in many different cell types, in the presence or absence of other growth factors. Smad7 had previously been shown to be necessary for TGF-β-induced apoptosis of epithelial cells. We could show that Smad7 is required for TGF-β-induced activation of the TGF-β activated kinase 1 (TAK1)-mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3)-p38 MAPK pathway, which subsequently leads to apoptosis in prostate cancer cells.</p><p>Members of the lymphoid enhancer factor-1/T-cell factor (LEF1/TCF) family of transcription factors have, together with β-catenin, been shown to be nuclear effectors in the Wnt-signalling pathway. We investigated a possible cross-talk between the TGF-β and Wnt signalling pathways. We found that TGF-β, in a Smad7-dependent manner induced a nuclear accumulation of β-catenin and enhanced the transcriptional activity of β-catenin and the induction of the downstream target gene <i>c-myc</i>. Since β-catenin and c-Myc has been shown to promote apoptosis, our results suggests the possibility that β-catenin contributes to TGF-β-induced apoptosis</p>

Transforming growth factor-β (TGF-β) is a member of a large superfamily of cytokines which participate in many different types of cellular processes, such as growth inhibition, cell migration, differentiation, cell adhesion, wound healing and immunosuppression. Alterations of TGF-β superfamily signalling results in several different disorders, including bone disease, vascular disease and cancer. The TGF-β signalling pathways involve several different proteins, such as the Smad proteins, which upon receptor activation are translocated to the nucleus, where they affect transcriptional responses. The actin cytoskeleton is an organised network of filaments with a highly dynamic structure, which is under a continuous reconstruction to control the morphology, survival, growth and motility of eukaryotic cells. The members of the family of small GTP-binding proteins have been shown to be important regulators of the actin cytoskeleton. TGF-β was found to induce short term as well as long term actin reorganisation in prostate cancer cells. The short term response included membrane ruffling, and required signalling by the small GTPases Cdc42 and Rho as well as, the involvement of the mitogen-activated protein kinases p38 (p38 MAPK). The long term response included formation of stress fibers and required a cooperation between Smad and Rho GTPase signalling pathways involving the Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1 (ROCK1). The TGF-β-induced activation of Cdc42 was, furthermore, shown to require the inhibitory Smad7 and p38 MAP kinase, via a PI3K-dependent pathway. Mixed lineage kinase 3 (MLK3), a mediator downstream of Cdc42, was necessary for the Cdc42-dependent actin filament reorganisation. Apoptosis is an important and carefully regulated process in human development and disease, which allows the multicellular organisms to remove cells that are in excess or potentially dangerous. TGF-β family members can induce apoptosis in many different cell types, in the presence or absence of other growth factors. Smad7 had previously been shown to be necessary for TGF-β-induced apoptosis of epithelial cells. We could show that Smad7 is required for TGF-β-induced activation of the TGF-β activated kinase 1 (TAK1)-mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3)-p38 MAPK pathway, which subsequently leads to apoptosis in prostate cancer cells. Members of the lymphoid enhancer factor-1/T-cell factor (LEF1/TCF) family of transcription factors have, together with β-catenin, been shown to be nuclear effectors in the Wnt-signalling pathway. We investigated a possible cross-talk between the TGF-β and Wnt signalling pathways. We found that TGF-β, in a Smad7-dependent manner induced a nuclear accumulation of β-catenin and enhanced the transcriptional activity of β-catenin and the induction of the downstream target gene c-myc. Since β-catenin and c-Myc has been shown to promote apoptosis, our results suggests the possibility that β-catenin contributes to TGF-β-induced apoptosis