Fragestellung: Die Therapie von Knochendefekten kritischer Größe mit kompromittiertem Regenerationspotential, stellt ein schwerwiegendes Problem dar. Die Forschung auf dem Gebiet der Knochenheilung hat sich in jüngster Vergangenheit daher auf die Anwendung mesenchymaler Vorläuferzellen (MSZ) zur Stimulierung des Knochenwachstums konzentriert. In der vorliegenden Studie wurde in humanen MSZ eine Überexpression spezifischer Wachstumsfaktoren induziert mit dem Ziel, deren osteogenes Potential zu steigern. Methodik: MSZ wurden nach etablierten Protokollen expandiert. Durch adenovirale Transfektion wurde eine überexpression von grün fluoreszierendem Protein (GFP, Kontrolle), indian hedgehog (IHH), bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) und IHH in Kombination mit BMP-2 induziert. Die MSZ wurden für 28 Tage mit osteogenem Differenzierungs- und Kontrollmedium kultiviert. Als weitere Kontrolle dienten native MSZ. Es wurden die Auswirkungen der jeweiligen genetischen Veränderungen auf die metabolische Aktivität (Alamar Blau), die Proliferation (Qubit dsDNA BR), die Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase (ALP)(p-Nitrophenylphosphat), die Mineralisierung (Alizarinrot S, Calcium O-Cresolphthalein) sowie auf die Expression charakteristischer Markergene untersucht (qRT-PCR). Ergebnis: In den ersten 72h nach Transfektion konnte eine leichte, im Vergleich zu nativen Zellen nicht signifikante Abnahme der metabolischen Aktivität in allen Gruppen beobachtet werden. Das Proliferationsverhalten transfizierter und nativer MSZ unterschied sich während des Untersuchungszeitraums nicht signifikant. Bei der Analyse der ALP-Aktivität zeigte sich ein typisches Rise-and-Fall Muster. Alle ost Gruppen wiesen sowohl im Assay als auch in der PCR eine signifikant höhere ALP-Aktivität auf. Die Überexpression von BMP-2 und IHH+BMP-2 bewirkte eine signifikant stärkere Mineralisierung an Tag 28. In der PCR zeigte sich für BMP-2 ost und IHH+BMP2 ost ein signifikanter Anstieg der Osteopontin und BMP-2 Expression über die Zeit. Zudem stieg bei allen ost Gruppen die Runx2 Expression bis Tag 21 an. Schlussfolgerung: Die virale Transfektion hatte keinen negativen Einfluss auf die metabolische Aktivität der Zellen oder deren Proliferationsverhalten. Die Überexpression von BMP-2 ohne oder in Kombination mit IHH führte zu einer vermehrten Produktion extrazellulärer Matrix und zu einer gesteigerten Genexpression osteogener Marker. Die virale Transfektion stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, das osteogene Potential von MSZ zu steigern. / Introduction: To stimulate healing of large bone defects research has concentrated on the application of mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: In the present study, we induced the overexpression of the growth factors bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and/or indian hedgehog (IHH) in human MSCs by adenoviral transduction to increase their osteogenic potential. GFP and non-transduced MSCc served as controls. The influence of the respective genetic modification on cell metabolic activity, proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralization in cell culture, and osteogenic marker gene expression was investigated. Results: Transduction had no negative influence on cell metabolic activity or proliferation. ALP activity showed a typical rise-and-fall pattern with a maximal activity at day 14 and 21 after osteogenic induction. Enzyme activity was significantly higher in groups cultured with osteogenic media. The overexpression of BMP-2 and especially IHH+BMP-2 resulted in a significantly higher mineralization after 28 days. This was in line with obtained qRT-PCR analyses, which showed a significant increase in osteopontin and osteocalcin expression for osteogenicly induced BMP-2 and IHH+BMP-2 transduced cells when compared to the other groups. Moreover, an increase in runx2 expression was observed in all osteogenic groups toward day 21. It was again more pronounced for BMP-2 and IHH+BMP-2 transduced cells cultured in osteogenic media. Conclusion: In summary, viral transduction did not negatively influence cell metabolic activity and proliferation. The overexpression of BMP-2 in combination with or without IHH resulted in an increased deposition of mineralized extracellular matrix, and expression of osteogenic marker genes. Viral transduction therefore represents a promising means to increase the osteogenic potential of MSCs and the combination of different transgenes may result in synergistic effects.

Untersuchung der Butyrateffekte auf die Genexpression von Zellkulturen während der Adenom-Karzinom-Sequenz mit Hilfe von Microarrays. Analyse des HDGF-Genclusters. Verwendete Zellkulturen Geki2, HT29 und SW620 / Examination of butyrate effects on genexpression of cellculteres during adenom-carcinom-sequence by use of microarrays. Analysis of hdgf-gencluster. USed cellcultures Geki2, HT29 und SW620.

Die aufgrund des demografischen Wandels steigende Zahl an Patienten mit Knochendefekten, chronischen Wunden und einhergehender Multimorbidität stellt ein großes klinisches und sozioökonomisches Problem dar. Derzeitige etablierte Verfahren zur Behandlung von Knochen- und Hautdefekten weisen zahlreiche Nachteile auf, weshalb die Erforschung innovativer Methoden notwendig ist. Ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der Wundheilungskapazität ist die Funktionalisierung von Biomaterialien mit Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM), die eine Rolle bei der Geweberegeneration spielen. Glykosaminoglykane (GAGs) sind wichtige ECM-Komponenten, von denen bekannt ist, dass sie mit Mediatorproteinen interagieren, wodurch sie deren biologische Aktivität und damit zelluläre Prozesse beeinflussen. Native GAGs, wie Heparansulfat, sind jedoch aufgrund ihrer eingeschränkten Verfügbarkeit, Charge-zu-Charge-Variabilität und ihrer quellenabhängigen biologischen Aktivität nur begrenzt für biomedizinische Anwendungen geeignet. Daher sind chemisch modifizierte Hyaluronsäure (HA)- und Chondroitinsulfat (CS)-Derivate mit definierten Eigenschaften bezüglich des Kohlenhydratrückgrats, sowie des Sulfatierungsgrades und -musters besonders geeignet, um ihre Struktur-Eigenschaftsbeziehung in der Interaktion mit heilungsrelevanten Mediatorproteinen und Zellen zu untersuchen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, mit denen GAGs zelluläre Prozesse direkt oder indirekt durch Bindung von Wachstumsfaktoren beeinflussen. Hierbei sollte vor allem gezeigt werden, wie Kohlenhydratrückgrat, Sulfatierungsgrad und -muster der GAG-Derivate die Interaktion und damit die biologische Aktivität des transformierenden Wachstumsfaktors (TGF)-β1, sowie der angiogenen Mediatoren vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF)165 und basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) beeinflussen. In vorangegangen Studien wurde gezeigt, dass sulfatierte HA- (sHA) und CS-Derivate stark mit Wachstumsfaktoren, wie den knochenmorphogenetischen Proteinen (BMP)-2/-4 und TGF-β1 wechselwirken. Letzterer wies eine beeinträchtigte Bioaktivität in Gegenwart von hochsulfatierter HA (sHA3) auf. Der zugrundeliegende Mechanismus wurde bisher nicht vollständig aufgeklärt und daher in dieser Arbeit untersucht. Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Untersuchungen mit allen Komponenten des TGF-β1:Rezeptor-Komplexes in Anwesenheit von GAGs zeigten, dass die Vorinkubation von TGF-β1 mit sHA-Derivaten die Bindung von TGF-β1, insbesondere an TGF-β Rezeptor (TβR)-I, aber auch an TβR-II, blockierte. In sequentiellen SPR-Experimenten, welche die in vivo-TGF-β1:Rezeptor-Komplexbildung genauer nachahmen, war jedoch die Rekrutierung von TβR-I zum TβR-II/TGF-β1-Komplex signifikant stärker, wenn der Komplex sHA3 enthielt. GAGs üben somit einen dualen Blockierungsmechanismus auf die TGF-β1:Rezeptor-Komplexbildung aus, wobei die Effekte stark von der Reihenfolge der Bindungsereignisse abhängen. Die hier erstmals untersuchte Bioaktivität von TGF-β1 in Verbindung mit sHA auf Rezeptorebene zeigte eine Abnahme der Phosphorylierung für TβR-I und das TβR-I-regulierte Effektorprotein Smad2 in Gegenwart von sHA3, was auf die Bildung eines inaktiven Signalkomplexes hindeutet. Ebenfalls analysiert wurde die Struktur-Eigenschaftsbeziehung von HA- und CS-Derivaten in ihrer Wechselwirkung mit den wichtigsten angiogenen Wachstumsfaktoren: VEGF165 und bFGF. Ziel war es strukturelle Eigenschaften zu identifizieren, die zu einer Interaktion beitragen und die biologischen Konsequenzen von Wachstumsfaktor/GAG-Interaktion zu ermitteln. Beide Wachstumsfaktoren zeigten eine sulfatierungsabhängige Wechselwirkung mit GAG-Derivaten in der SPR-Bindungsanalyse. Anders als bFGF zeigte VEGF165 außerdem eine klare Präferenz für sHA im Vergleich zu CS-Derivaten, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung mit diesem Wachstumsfaktor nicht nur vom Sulfatierungsgrad, sondern auch vom Kohlenhydrat-Rückgrat des GAGs beeinflusst wird. sHA-Tetramere waren ausreichend, um mit VEGF165 und bFGF in SPR-Messungen zu interagieren und zeigten, dass die Position der Sulfatierung eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit beiden angiogenen Wachstumsfaktoren zu spielen scheint, da die Bindungsstärke des sHA-Tetrasaccharids ohne C6-Sulfatierung des N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Vergleich zu einem ausschließlich an der C6-Position sulfatiertem Derivat geringer war. Interessanterweise war die Bindung von tetramerer persulfatierter HA (psHA) im Vergleich zu einem psHA-Hexamer stärker, was darauf hinweist, dass das Tetrasaccharid in der Lage ist, mit zusätzlichen GAG-Bindungsstellen von VEGF165 und bFGF zu interagieren. Die Bindung von VEGF165 und bFGF an ihre jeweiligen Rezeptoren VEGF Rezeptor (VEGFR)-2 und FGF Rezeptor (FGFR) 1 war vermindert, wenn die Wachstumsfaktoren in SPR-Studien mit sulfatierten GAGs vorinkubiert wurden. Auch hier wurde für VEGF165 ein Einfluss des Kohlenhydratrückgrats nachgewiesen, da die Bindung des Wachstumsfaktors an VEGFR-2 durch sHA-Derivate stärker gehemmt wurde als durch CS-Derivate mit vergleichbarem Sulfatierungsgrad. Auch auf die bFGF/FGFR1IIIc-Interaktion hatte die Sulfatierung der C6-Position des GlcNAc von sHA1 einen stärkeren Einfluss als die C4-Sulfatierung des GlcNAc von CS. Im Gegensatz dazu war die Blockierungskapazität von sCS3 und sHA3 jedoch ähnlich. Dies deutet auf einen geringen Einfluss des Kohlenhydratrückgrats, jedoch auf einen großen Einfluss des gesamten Sulfatierungsgrades der GAG-Derivate auf die bFGF-Wechselwirkung mit FGFR1IIIc hin. Tetramere GAGs waren ebenfalls ausreichend, um die VEGF165- und bFGF-Rezeptorbindung zu stören. Mit zunehmendem Sulfatierungsgrad und Länge des Derivats wurde der Blockierungseffekt verstärkt. Die Interaktion von VEGF165 mit sHA3 und die anschließende Blockierung der VEGFR-2-Bindung führte zu einer verminderten Phosphorylierung von VEGFR-2. In einem 3D in vitro-Angiogenese-Assay zeigte sich darüber hinaus eine verminderte VEGF165- bzw. bFGF-vermittelte Sprossung von Endothelzell-Sphäroiden durch hochsulfatierte GAGs. Die Angiogenese wurde jedoch nicht vollständig inhibiert. Interessanterweise induzierten GAG-Derivate unabhängig von den untersuchten angiogenen Wachstumsfaktoren die Sprossung von Endothelzell-Sphäroiden. Es konnte gezeigt werden, dass VEGFR-2 nicht an der proangiogenen Wirkung von sulfatierten GAGs beteiligt ist, während die Blockierung von FGFR1 die proangiogene Wirkung von sCS3 und sHA3 hemmt. GAG-Derivate könnten FGFR1 direkt aktivieren, da in SPR-Experimenten gezeigt wurde, dass sie an den Rezeptor binden. Andererseits könnte der beobachtete Effekt auch auf eine erleichterte Rezeptordimerisierung mit einer anschließenden verstärkten Ligandenbindung oder die Wechselwirkung mit intrazellulären Targets nach GAG-Internalisierung zurückzuführen sein. Dies muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Die Ergebnisse weisen auf die Wichtigkeit der Reihenfolge der Bindungsereignisse hin, da die Bindung von GAG-Derivaten an Wachstumsfaktoren, Rezeptoren oder beide Komponenten zu unterschiedlichen zellulären Konsequenzen hinsichtlich der Signalgebung führt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass GAG-Derivate unterschiedliche molekulare Mechanismen nutzen, um zelluläre Prozesse direkt oder indirekt über die Bindung von Wachstumsfaktoren zu modulieren und tragen zu einem tieferen Verständnis ihrer Wirkungsweise bei. Dies könnte wiederum eine Abstimmung der Biomaterial-zusammensetzung auf patientenspezifische Bedürfnisse ermöglichen. GAG-haltige Bio-materialien sind vielversprechend für eine Verminderung TGF-β1-gesteuerter lokaler Hautfibrose, da sie die Bioaktivität von TGF-β1 reduzieren. In Bezug auf die inhibitorischen Effekte auf die VEGF165- und bFGF-Signaltransduktion könnten GAGs mit übermäßiger Angiogenese, die bei rheumatoider Arthritis und diabetischer Retinopathie auftritt, interferieren. Ob diese in vitro-Ergebnisse zur Steuerung der biologischen Aktivität von TGF-β1, VEGF165 und bFGF oder zur direkten Stimulation der Angiogenese unabhängig von Wachstumsfaktoren genutzt werden können, muss in vivo validiert werden. / Age-related pathologies, like chronic wounds and impaired fracture healing are a consequence of a longer life expectancy in our aging population and are associated with considerable clinical and socioeconomic burdens. To improve the wound healing capacity of patients, the development of new adaptive biomaterials to selectively control and promote bone and skin regeneration is essential. A promising approach for the design of such biomaterials incorporates elements of the extracellular matrix (ECM) that play a role in tissue regeneration. Glycosaminoglycans (GAGs) are major ECM components known to interact with important mediator proteins, thereby influencing their biological activity and subsequently cellular processes. However, native GAGs like heparan sulfate have a limited utility for biomedical applications due to their restricted availability, batch-to-batch variability and source-dependent biological activity. For this reason, chemically modified hyaluronan (HA) and chondroitin sulfate (CS) derivatives with defined properties regarding the carbohydrate backbone, the degree of sulfation and the sulfation pattern are preferable for studying their structure-function relationship in the interaction with mediator proteins and cells relevant to healing processes. The aim of the present study was to investigate how GAGs influence cellular processes - directly or indirectly by binding growth factors – and particularly how the sugar backbone as well as the sulfation degree and pattern of GAG derivatives influence the interaction and thus the biological activity of transforming growth factor (TGF)-β1, and the angiogenic mediators vascular endothelial growth factor (VEGF)165 and basic fibroblast growth factor (bFGF). Sulfated HA (sHA) and CS derivatives were reported to strongly interact with growth factors like bone morphogenetic proteins (BMP)-2/-4 and transforming growth factor (TGF)-β1. The bioactivity of the latter was impaired in the presence of highly sulfated HA (sHA3), the underlying mechanism of which is so far not fully elucidated. In the present thesis the interaction of all components of the TGF-β1:receptor complex with sHA was examined by surface plasmon resonance (SPR), showing that pre-incubation of TGF-β1 with sHA derivatives blocked the binding of TGF-β1 in particular to TGF-β receptor (TβR)-I, but also to TβR-II. In sequential SPR experiments that mimicked the in vivo TGF-β1:receptor complex formation more closely, however, recruitment of TβR-I to the TβR-II/TGF-β1 complex was significantly stronger if the complex contained sHA3. GAGs thus exert a dual blocking effect on TGF-β1:receptor complex formation, with the effects strongly depending on the order of binding events. The bioactivity of TGF-β1 in conjunction with sHA at the receptor level, which was investigated here for the first time, showed a decrease of phosphorylation for TβR-I and the TβR-I-regulated effector protein Smad2 in the presence of sHA3, indicating of the formation of an inactive signaling complex. Also analyzed was the structure-function relationship of HA and CS derivatives in their interaction with the most important angiogenic growth factors, namely vascular endothelial growth factor (VEGF)165 and basic fibroblast growth factor (bFGF). The aim was both to identify structural properties that contribute to an interaction and to determine the biological consequences of growth factor/GAG interaction. Both growth factors showed a sulfation-dependent interaction with GAG derivatives in SPR binding analysis. Unlike bFGF, VEGF165 also showed a clear preference for sHA compared to CS derivatives, indicating that the interaction with this growth factor is not only impacted by the degree of sulfation but also by the carbohydrate backbone of the GAG. sHA tetramers were sufficient to interact with VEGF165 and bFGF in SPR measurements. The position of sulfation appears to play an important role in the interaction with both angiogenic growth factors, as the binding strength of the sHA tetrasaccharide with no C6-sulfation of the N-acetylglucosamine (GlcNAc) was lower compared to a derivative exclusively sulfated at the C6 position. Interestingly, binding of tetrameric persulfated HA (psHA) was stronger compared to hexameric psHA, indicating that the tetrasaccharide is able to bind to additional regions of VEGF165 and bFGF. Binding of VEGF165 and bFGF to their respective receptors VEGF receptor (VEGFR)-2 and FGF receptor (FGFR) 1 decreased if the growth factors were pre-incubated with sulfated GAGs in SPR studies. For VEGF165, an influence of the carbohydrate backbone was visible again, since the inhibition of growth factor binding to VEGFR-2 by sHA derivatives was stronger than for CS derivatives with comparable degree of sulfation. For bFGF/FGFR1IIIc interaction, sulfation of the C6 position in GlcNAc of low-sulfated sHA had a stronger impact compared to the C4 sulfation in GlcNAc of CS, while blocking capacity of sCS3 and sHA3 was similar. This suggests a minor influence of the carbohydrate backbone on bFGF interaction with FGFR1IIIc in the presence of GAG derivatives, but a major influence of the overall degree of sulfation. Tetrameric GAGs were already sufficient to interfere with VEGF165 and bFGF receptor binding, but the blocking effect was enhanced with increasing sulfation and chain length of the derivative. The interaction of VEGF165 with sHA3 and the subsequent blocking of VEGFR-2 binding led to an impaired phosphorylation of VEGFR-2. Furthermore, the induction of endothelial cell spheroid sprouting mediated via VEGF165 or bFGF was diminished by high sulfated GAGs as displayed in a 3D in vitro angiogenesis assay. However, angiogenesis was not completely abolished. Interestingly, GAG derivatives induced the sprouting of endothelial cell spheroids independent of the studied angiogenic growth factors. It could be shown that VEGFR-2 is not involved in the pro-angiogenic action of sulfated GAGs, while FGFR1 appears to play a role as blocking it inhibited the pro-angiogenic effect of sCS3 and sHA3. GAG derivatives might directly activate FGFR1 as they bound to the receptor in SPR experiments, but the observed effect might also be due to facilitated receptor dimerization with a subsequent enhanced ligand binding, or to an interaction with intracellular targets after GAG internalization; this needs to be clarified in further experiments. Findings point to the importance of the order of binding events, as binding of GAG derivatives to growth factors, receptors or both leads to different cellular outcomes regarding signaling. Results of the present thesis show that GAG derivatives employ different molecular mechanisms to modulate cellular processes – both directly or indirectly via growth factor binding - and contribute to a deeper understanding of their mode of action, which might allow to tune the biomaterial composition to patient-specific needs. GAG-containing biomaterials are promising candidates to interfere with TGF-β1-driven local skin fibrosis, as they reduce the bioactivity of TGF-β1. Concerning the inhibitory effects on VEGF165 and bFGF signaling, an application of GAGs to interfere with the excessive angiogenesis, occurring in rheumatoid arthritis and diabetic retinopathy could be of interest. Whether these in vitro findings can be used to control the biological activity of TGF-β1, VEGF165 and bFGF or to directly stimulate angiogenesis independent of growth factors needs to be validated in vivo.

BACKGROUND: Bone remodeling relies on the tightly regulated interplay between bone forming osteoblasts and bone digesting osteoclasts. Several studies have now described the molecular mechanisms by which osteoblasts control osteoclastogenesis and bone degradation. It is currently unclear whether osteoclasts can influence bone rebuilding. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Using in vitro cell systems, we show here that mature osteoclasts, but not their precursors, secrete chemotactic factors recognized by both mature osteoblasts and their precursors. Several growth factors whose expression is upregulated during osteoclastogenesis were identified by DNA microarrays as candidates mediating osteoblast chemotaxis. Our subsequent functional analyses demonstrate that mature osteoclasts, whose platelet-derived growth factor bb (PDGF-bb) expression is reduced by siRNAs, exhibit a reduced capability of attracting osteoblasts. Conversely, osteoblasts whose platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR-beta) expression is reduced by siRNAs exhibit a lower capability of responding to chemotactic factors secreted by osteoclasts. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: We conclude that, in vitro mature osteoclasts control osteoblast chemotaxis via PDGF-bb/PDGFR-beta signaling. This may provide one key mechanism by which osteoclasts control bone formation in vivo.

Die Studien der vorliegenden Habilitationsschrift hatten die Untersuchung der Abhängigkeit diffuser und tumorförmiger Hypervaskularisationen der Plazenta von angiogenen Wachstumsfaktoren zum Ziel. Kernaussagen sind, daß in Chorangiomen eine höhere Expression der Angiopoietine - 1 und - 2 vorliegt, bei morphologisch gleicher Rezeptorausstattung. Keine Differenzen zeigte die Expression von PDGF sowie seinem Rezeptor PDGF-ß. Bei Differenzierung solitärer und multipler Chorangiome (Chorangiomatosen) hinsichtlich klinischer Parameter sowie der Expression der angiogenen Wachstumsfaktoren Angiopoietin-1 und bFGF sowie hinsichtlich der Proliferationsrate konnten Unterschiede zwischen den plazentaren Läsionen deutlich werden. Die Expression der Wachstumsfaktoren war jeweils in Chorangiomatosen kräftiger als in solitären Veränderungen. Das Auftreten von Chorangiomatosen steht offensichtlich in Zusammenhang mit einer verstärkten Expression dieser Wachstumsfaktoren, die damit noch die ohnehin in Chorangiomen - gegenüber ortholog gereiftem Plazentaparenchym - gesteigerte Expression übertrifft. So deutet diese Studie nunmehr verstärkt auf eine Korrelation zwischen der Höhe der Wachstumsfaktorexpression und dem quantitativen Auftreten lokalisierter Angiopathien hin. Zudem ließen sich klinische Korrelationen aufzeigen. So lag das mütterliche Alter beim Auftreten lokalisierter hypervakularisierter Veränderungen deutlich über der bei unauffälligen Plazenten, ein Ergebnis, das vorherige Untersuchungen bestätigte. Geringe Differenzen das maternale Alter betreffend bestanden zwischen Chorangiomen und Chorangiomatosen. Hinsichtlich der Schwangerschaftskomplikationen fanden sich keine Unterschiede zwischen Chorangiomen und Chorangiomatosen. Begleitende Reifungsstörungen fanden sich auch in diesem Studienkollektiv, dahingehend, daß Chorangiome und häufiger noch Chorangiomatosen kombiniert mit diesen Auftreten. Untersuchungen zur Apoptose- und Proliferationsrate in Chorangiomen mit differierendem histologischen Subtyp erbrachten keinen Hinweis auf den Einfluß der Apoptose auf das Wachstum dieser tumorartigen Läsionen. In Chorangiomen zeigte sich im Vergleich zu regelhaft entwickeltem reifem Plazentagewebe eine leicht gesteigerte Proliferationsrate. Auffällig war einzig, daß Chorangiome endotheliomatösen Subtyps die höchste Proliferationsrate aufwiesen. Studien intrauteriner Todesfällen der frühen und mittleren Fetalperiode konnten zeigen, das diffuse Hypervaskularisationen offensichtlich reaktiver Natur sind. Untersuchungen zur Expression angiogener Wachstumsfaktoren zeigten, daß diese exprimiert werden und damit bereits an der Gefäßentwicklung der Plazenta in der Fetalperiode beteiligt sind. Unterschiede hinsichtlich der Expression der Wachstumsfaktoren in Plazenten mit Hypervaskularisationen und Kontrollproben fanden sich jedoch morphologisch nicht. Die gesteigerte Gefäßbildung in der frühen Fetalperiode ist offenbar eine reaktive Anpassung der Zotten auf die Hypoxie. Falldarstellungen zweier weiterer Plazentatumoren, eines inzidentellen Chorangiokarzinoms sowie eines Angiomyxoms der Nabelschnur erbrachten hinsichtlich der Gefäßkomponente in diesen Tumoren keine Abhängigkeit von den untersuchten Wachstumsfaktoren. Eine Studie von 136 Chorangiomen aus 22439 Plazenten ließen aussagefähigen Analysen der Häufigkeit, morphologischer Charakteristika und Korrelationen zwischen Chorangiomen und klinischen Befunden zu. So zeigten sich signifikante Abhängigkeiten zwischen dem Auftreten eines Chorangioms und dem mütterlichen Alter, der gestationsbedingten Hochdrucksymptomatik, der Parität, dem kindlichen Geschlecht und begleitender Reifungsstörungen der Plazenta. Insbesondere die Reifungsstörungen in Kombination zum Auftreten eines Chorangioms waren zuvor nie Gegenstand einer größeren wissenschaftlichen Studie. Einzelne Parameter fanden zwar sporadisch in einzelnen Publikationen mit wenigen Chorangiomen wissenschaftlich Beachtung, doch die dort publizierten Ergebnisse widersprachen sich vielfach. So ist die jetzt vorliegende Untersuchung in ihrer Größe und damit Aussagekraft sehr relevant. / The studies had the investigation of the dependence of vague and tumoric hypervascularisation of the placenta on angiogenic growth factors as a goal. Core statements are that in chorangiomas a higher expression of Angiopoietin-1 and - 2 is present, during morphologically same receptor equipment. The expression of PDGF as well as ist receptor did not show differences PDGF - beta. With differentiation of solitär and multiple chorangiomas (chorangiomatoses) regarding clinical parameters as well as the expression of the angiogenic growth factors Angiopoietin-1 and bFGF as well as regarding the proliferation rate could become clear differences between the placental lesions. The expression of the growth factors was in each case in chorangiomatoses stronger than in single changes. The occurrence of chorangiomatoses stands obviously in connection with a strengthened expression of these growth factors, which exceeds thereby still anyway the expression increased in chorangiomas - opposite ortholog matured placental tissue. Thus this study points now strengthened on a correlation between the height of the expression on growth factors and the quantitative occurrence of located angiopathia. Besides clinical correlations could be pointed out. Thus the maternal age was clearly with the occurrence of located such changes over with inconspicuous placentas, a result, which confirmed previous investigations. Small differences concerning the maternal age existed between chorangiomas and chorangiomatoses. Regarding the pregnancy complications were no differences between chorangiomas and chorangiomatoses. Accompanying maturing disturbances were in such a way also in this study collective, that chorangiomas combines and more frequently still chorangiomatoses with this occurrence. Investigations to the apoptoses and proliferation rate in chorangiomas with differing histological subtyp did not furnish a reference to the influence of the apoptoses on the growth of these tumor-like lesions. To chorangiomas an easily increased proliferation rate pointed itself compared with regularly developed ripe placental tissue. Remarkably it was only that chorangiomas with endotheliomatos subtyp the highest proliferation rate exhibited. Studies of intrauterin deaths of the early and middle fetal periode could show, which are vague hypervascularisation of obviously reactive nature. Investigations to the expression of angiogenic growth factors showed the fact that these are exprime and so that in the container development of the placenta in the fetal periode is involved already. Differences regarding the expression of the growth factors in plazentas with hypervascularisationen and inspection samples were not however morphologically. The increased container formation in the early fetal periode is obviously a reactive adjustment of the villous trees on the hypoxia. Drop representations of two further placenta tumors, a incidentially chorangiocarcinoma as well as a angiomyxoma of the umbilical cord did not furnish dependence on the examined growth factors regarding the container component in these tumors. Expressive analyses of the frequency, morphologic characteristics and correlations between chorangiomas and clinical findings permitted a study of 136 chorangiomas from 22439 plazentas. Thus significant dependence between the occurrence of a chorangioma and the maternal age, the gestational high pressure symptomatology, the parity, the childlike sex showed up and accompanying maturing disturbances of the placenta.

Der Effekt des Cagedesigns, von Carrier-Systemen und Wachstumsfaktoren auf die intervertebrale Spondylodese am Tiermodell der Schafshalswirbelsäule wurde in einer anatomisch-biomechanischen, einer rein biomechanischen und sechs tierexperimentellen Teilstudien untersucht. Cages weisen eine designspezifische in vitro Primärstabilität auf. Jedoch besteht kein direkter Zusammenhang zwischen der in vitro Primärstabilität und der in vivo Sekundärstabilität der Implantate. Daher sind rein biomechanische in vitro Untersuchungen nicht dazu geeignet das Einheilungsverhalten eines Cages zu prognostizieren. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen auch, dass die Auflagefläche für das Sinterungsverhalten eines Cages in vivo nur von untergeordneter Bedeutung ist. Hingegen sind das "stress-shielding" und die Volumen-bezogene-Steifigkeit eines Cages für das Einheilungsverhalten des Implantates in vivo entscheidend. In den vorliegenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die biodegradierbare PDLLA-Beschichtung intervertebraler Implantate eine sichere, einfache und effektive Applikation von Wachstumsfaktoren im Intervertebralraum gewährleistet. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der PDLLA-Carrier dem Kollagen-Carrier in seiner Effektivität signifikant überlegen ist. Nebenwirkungen der PDLLA-Beschichtung konnten in diesen Untersuchungen nicht ermittelt werden. Die Applikation einer geeigneten Dosis von IGF-I und TGF-(1 mittels PDLLA-beschichtetem Cage ist in der Lage, die intervertebrale Spondylodese signifikant zu stimulieren. Des weiteren konnte demonstriert werden, dass die verwendeten Wachstumsfaktoren IGF-I und TGF-(1 eine signifikante Verbesserung der intervertebralen Fusionsergebnisse im Vergleich zu autologem Knochenmaterial ermöglichen und gleichzeitig die Entnahme dieses Knochenmaterials überflüssig machen. Die Applikation von IGF-I und TGF-(1 mittels PDLLA-Carrier zeigte außerdem im Vergleich zum bisherigen Standard BMP-2 appliziert mittels Kollagen-Carrier signifikant bessere Fusionsergebnisse. Lokale oder systemische Nebenwirkungen konnten in den bisherigen Untersuchungen für die verwendeten Wachstumsfaktorendosen nicht ermittelt werden. Weiterführende Untersuchungen müssen belegen, ob die kombinierte lokale Applikation von IGF-I und TGF-(1 mittels PDLLA-beschichtetem Cage auch beim Menschen zu einer signifikanten Verbesserung der Ergebnisse der zervikalen Spondylodese führen können. / Anatomical, biomechanical and animal experimental studies were carried out to determine the effect of cage design, carrier systems and growth factors on interbody fusion in a sheep cervical spine model. Primary stability of cages was influenced by the implant design. However, there was no direct correlation between primary and secondary stability of cages. The dimension of the endplate-implant-contact area had no significant influence on subsidence of cages. Yet, stress-shielding and volume-related-stiffness significantly influenced bone matrix formation inside the cage. Biodegradable PDLLA-coating of cages allowed a safe, simple and effective intervertebral application of growth factors. The PDLLA-carrier was more effective than the collagen sponge carrier. No side effects were associated with the use of the PDLLA-carrier. An adequate dose of IGF-I and TGF-(1 applied by a PDLLA-coated interbody fusion cage stimulated interbody bone matrix formation. In comparison to autologous bone grafts the local application of IGF-I and TGF-(1 demonstrated significantly better fusion results and eliminated donor site morbidity. Further, in comparison to the golden standard BMP-2 applied by a collagen sponge carrier the combined application of IGF-I and TGF-(1 by a PDLLA-carrier significantly increased fusion results. No local or systemic side effects were associated with the use of the growth factors. Further studies have to determine, if the local combined application of IGF-I and TGF-(1 by a PDLLA-coated interbody cage increases fusion results in the human cervical spine.

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zum Einfluss der Wachstumsfaktoren IGF-I, EGF und dem Zytokin IL-6 auf den Androgenrezeptor-Signalweg zeigten in verschiedenen Prostatakarzinom-zelllinien schon nach zwei Stunden eine deutliche Degradation des Androgenrezeptor-Proteins. Die ausschließlich auf Protein-Ebene stattfindende, Wachstumsfaktor-induzierte negative Regulation des Androgenrezeptors konnte durch einen schnellen Androgeneffekt wieder aufgehoben werden. Mittels Luziferase-Reportergen-Assays wurde kein Einfluss der Wachstums-faktorwirkung auf die transkriptionelle Aktivität des Androgenrezeptors nachgewiesen. Darüber hinaus konnte eine signifikant reprimierende Wirkung durch IGF-I und EGF in Kombination mit geringen Mengen DHT beobachtet werden. Weitere Resultate dieser Arbeit deuten auf einen, durch den PI3-Kinase-Signalweg vermittelten, proteasomalen Abbauprozess des Rezeptors hin. Da die Suppression der downstream gelegenen Proteinkinase Akt keine Veränderung hinsichtlich der Degradation aufwies, konzentrierte sich die weiterführende Arbeit auf eine mögliche direkte Regulation des Androgen-rezeptors durch die PI3-Kinase. Unter Verwendung von rekombinanten GST-Fusionsproteinen konnte in Interaktionsstudien unter in vitro Bedingungen eine Phosphotyrosin-unabhängige Bindung zwischen der C-SH2-Domäne der p85-Untereinheit der PI3-Kinase und dem N- und C-Terminus des Androgenrezeptors nachgewiesen werden. Durch die nähere Charakterisierung dieser Bindungsbereiche mit Hilfe von Peptidarrays und anschließenden Alanin-Substitutionen war es möglich, für den N-Terminus 18, für den C-Terminus des Androgenrezeptors 6 und für die p85-C-SH2-Domäne der PI3-Kinase 11 Aminosäuren zu identifizieren. Die durch gezielte Punktmutagenese an diesen Aminosäurepositionen hergestellten Androgenrezeptor-Einzel- und -Mehrfachmutanten wiesen in Bindungsstudien dennoch Interaktion zur PI3-Kinase auf. Eine von Anderson und Kollegen postulierte Phosphotyrosin-unabhängige Bindung der SH2-Domänen der p85-Untereinheit der PI3-Kinase durch sogenannte „basic-X-basic“-Motive wurde ebenfalls in Interaktionstests zwischen der PI3-Kinase und dem Androgenrezeptor überprüft. Aufgrund der Tatsache, dass einige der identifizierten Aminosäuren auf dem Androgenrezeptor Teil eines „basic-X-basic“-Bindungsmotives sind, wurden Kombinationsmutanten generiert, die sowohl im N-Terminus als auch im C﷓Terminus des Androgenrezeptors ein bzw. zwei zerstörte „basic-X-basic“-Motive enthielten. Untersuchungen zum Bindungsverhalten dieser Mutanten zeigten zwar weiterhin Interaktion zur p85-C-SH2-Domäne der PI3-Kinase, jedoch der durch Western-blot-Analyse überprüfte IGF-I-induzierte Degradationseffekt des Androgenrezeptor-Proteins konnte mit zwei der verwendeten Androgenrezeptor-Kombinationsmutanten nicht mehr beobachtet werden.

BACKGROUND: Bone remodeling relies on the tightly regulated interplay between bone forming osteoblasts and bone digesting osteoclasts. Several studies have now described the molecular mechanisms by which osteoblasts control osteoclastogenesis and bone degradation. It is currently unclear whether osteoclasts can influence bone rebuilding. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Using in vitro cell systems, we show here that mature osteoclasts, but not their precursors, secrete chemotactic factors recognized by both mature osteoblasts and their precursors. Several growth factors whose expression is upregulated during osteoclastogenesis were identified by DNA microarrays as candidates mediating osteoblast chemotaxis. Our subsequent functional analyses demonstrate that mature osteoclasts, whose platelet-derived growth factor bb (PDGF-bb) expression is reduced by siRNAs, exhibit a reduced capability of attracting osteoblasts. Conversely, osteoblasts whose platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR-beta) expression is reduced by siRNAs exhibit a lower capability of responding to chemotactic factors secreted by osteoclasts. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: We conclude that, in vitro mature osteoclasts control osteoblast chemotaxis via PDGF-bb/PDGFR-beta signaling. This may provide one key mechanism by which osteoclasts control bone formation in vivo.

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zum Einfluss der Wachstumsfaktoren IGF-I, EGF und dem Zytokin IL-6 auf den Androgenrezeptor-Signalweg zeigten in verschiedenen Prostatakarzinom-zelllinien schon nach zwei Stunden eine deutliche Degradation des Androgenrezeptor-Proteins. Die ausschließlich auf Protein-Ebene stattfindende, Wachstumsfaktor-induzierte negative Regulation des Androgenrezeptors konnte durch einen schnellen Androgeneffekt wieder aufgehoben werden. Mittels Luziferase-Reportergen-Assays wurde kein Einfluss der Wachstums-faktorwirkung auf die transkriptionelle Aktivität des Androgenrezeptors nachgewiesen. Darüber hinaus konnte eine signifikant reprimierende Wirkung durch IGF-I und EGF in Kombination mit geringen Mengen DHT beobachtet werden. Weitere Resultate dieser Arbeit deuten auf einen, durch den PI3-Kinase-Signalweg vermittelten, proteasomalen Abbauprozess des Rezeptors hin. Da die Suppression der downstream gelegenen Proteinkinase Akt keine Veränderung hinsichtlich der Degradation aufwies, konzentrierte sich die weiterführende Arbeit auf eine mögliche direkte Regulation des Androgen-rezeptors durch die PI3-Kinase. Unter Verwendung von rekombinanten GST-Fusionsproteinen konnte in Interaktionsstudien unter in vitro Bedingungen eine Phosphotyrosin-unabhängige Bindung zwischen der C-SH2-Domäne der p85-Untereinheit der PI3-Kinase und dem N- und C-Terminus des Androgenrezeptors nachgewiesen werden. Durch die nähere Charakterisierung dieser Bindungsbereiche mit Hilfe von Peptidarrays und anschließenden Alanin-Substitutionen war es möglich, für den N-Terminus 18, für den C-Terminus des Androgenrezeptors 6 und für die p85-C-SH2-Domäne der PI3-Kinase 11 Aminosäuren zu identifizieren. Die durch gezielte Punktmutagenese an diesen Aminosäurepositionen hergestellten Androgenrezeptor-Einzel- und -Mehrfachmutanten wiesen in Bindungsstudien dennoch Interaktion zur PI3-Kinase auf. Eine von Anderson und Kollegen postulierte Phosphotyrosin-unabhängige Bindung der SH2-Domänen der p85-Untereinheit der PI3-Kinase durch sogenannte „basic-X-basic“-Motive wurde ebenfalls in Interaktionstests zwischen der PI3-Kinase und dem Androgenrezeptor überprüft. Aufgrund der Tatsache, dass einige der identifizierten Aminosäuren auf dem Androgenrezeptor Teil eines „basic-X-basic“-Bindungsmotives sind, wurden Kombinationsmutanten generiert, die sowohl im N-Terminus als auch im C﷓Terminus des Androgenrezeptors ein bzw. zwei zerstörte „basic-X-basic“-Motive enthielten. Untersuchungen zum Bindungsverhalten dieser Mutanten zeigten zwar weiterhin Interaktion zur p85-C-SH2-Domäne der PI3-Kinase, jedoch der durch Western-blot-Analyse überprüfte IGF-I-induzierte Degradationseffekt des Androgenrezeptor-Proteins konnte mit zwei der verwendeten Androgenrezeptor-Kombinationsmutanten nicht mehr beobachtet werden.

Im Verlauf der Knochenbildung und Frakturheilung kommt es zu einem Zusammenwirken verschiedener Zell- und Gewebearten. Die beteiligten Zellen unterliegen dabei der Regulation von Wachstumsfaktoren (WF), Zytokinen und Hormonen, die den regelhaften Ablauf kontrollieren und steuernd in Proliferation und Differenzierung von Zellen und deren Matrixsynthese eingreifen. Neben einer optimalen Osteosynthese zur Frakturstabilisation stellt die biologische Beeinflussung der Knochenheilung ein großes Forschungsfeld dar. In Vorarbeiten wurde ein Applikationssystem entwickelt, das mittels einer biodegradierbaren Polymerbeschichtung auf Osteosynthesematerialien die lokale Applikation von WF in biologisch aktiver Form ermöglicht. In vivo wurde an Ratten- und Schweinemodellen erfolgreich die Stimulation der Knochenheilung durch lokal applizierte Wachstumsfaktoren IGF-I, TGF-ß1 und BMP-2 gezeigt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung zellulärer Prozesse während der beeinflussten und unbeeinflussten Knochenheilung sowie des Effektes der lokalen Applikation von Wachstumsfaktoren von beschichteten Osteosyntheseplatten. Anhand histologischer und immunhistochemischer Untersuchungen, der in situ Hybridisierung an Knochenschnitten und der ELISA-Methode konnte ein früherer Reifungsbeginn des Kallus durch die Wachstumsfaktorenapplikation gezeigt werden, ohne dass es zu Veränderungen der physiologischen Gewebszusammensetzung und der endogenen Wachstumsfaktoren-Expression kam. Durch Zellkulturstudien an primären Osteoblasten und Osteoklasten wurde an isolierten Zelltypen die Wirkung der applizierten WF untersucht und ihr Effekt auf die Zelltypen dargestellt. Die Bildung ektoper Ossifikation im Weichgewebe durch die Wachstumsfaktoren wurde im Schafsmodell ausgeschlossen. Dies stellt einen wichtigen Sicherheitsaspekt beim Einsatz von Wachstumsfaktoren zur Stimulation der Knochenheilung dar. Die lokale Applikation der Wachstumsfaktoren von einer Plattenosteosynthese zur Osteotomiestabilsierung im Rattenmodell zeigte eine signifikante Verbesserung der biomechanischen Stabilität und der Kallusheilung 42 Tage nach Osteotomie Die aus diesen Studien gewonnenen Erkenntnisse liefern Aufschluss zur Weiterentwicklung biologischer Einflussmöglichkeiten auf den Knochenstoffwechsel und die Rolle von WF während der Frakturheilung. / In the process of bone formation and healing, different cell- and tissue types are formed. The cells involved are regulated by growth factors (GF), cytokines and hormones, which control the healing and affect the proliferation and differentiation of cells and their matrix synthesis. Besides the use of the optimal osteosynthesis for fracture stabilization, the biological influence of the bone healing represents a large research field. In previous work an application system for local application of GF in biologically active form was developed. In vivo studies revealed a stimulating effect of locally applied IGF-I and TGF-ß1 in a rat and a pig model. Goal of this work was the investigation of cellular processes during the influenced and uninfluenced bone healing. A further aim was the transfer of the local application method to further stabilization systems (plate osteosynthesis). On the basis of the histology, the immunohistology, in situ hybridizing and ELISA methods an earlier beginning of maturing of the callus by the growth factors could be shown, without changes of the physiological callus composition and the endogenous growth factors expression. In further cell culture studies on primary osteoblasts and osteoclasts the effect of the applied growth factors was examined and their effect on the cell types analyzed. The avoidance of ectopic ossification, an important safety aspect with the use of growth factors to stimulate bone healing, was investigated in a sheep model. It was also possible to proof the efficacy of locally applied growth factors delivered extramedullary from plates. The results of these studies provide further explanations for the action of the used growth factors and are necessary for the ongoing development of the application of growth factors for a clinical use.