Tierärztl. Hochsch., Diss., 2003--Hannover.

Ibrutinib serves as an efficient second-line therapy in relapsed/refractory mantle cell lymphoma. However, resistance to the BTK inhibitor results in a poor prognosis for patients. Since the mechanisms leading to resistance in initially responding tumor cells are poorly understood, this work aimed to decipher acquired features in ibrutinib-surviving cells of a sensitive mantle cell lymphoma cell line and evaluate these potential therapeutic targets in ibrutinib-treated mantle cell lymphoma. Time-resolved single-cell RNA sequencing was performed to track the transcriptomic evolution of REC-1 cells across 6 and 48 hours of treatment. Single-cell analysis uncovered a subpopulation of REC-1 with potentially greater aggressiveness and survival advantage by benefiting from interaction with the tumor microenvironment. Upregulation of B-cell receptor genes, elevated surface antigen expression of CD52 and metabolic rewiring to higher dependence on oxidative phosphorylation were identified as further potential resistance features of ibrutinib-surviving cells. RNA sequencing after prolonged incubation corroborated the increase in CD52 and oxidative phosphorylation as dominant characteristics of the cells surviving the 4-day treatment, highlighting their potential as therapeutic targets in combination with ibrutinib treatment. Concomitant use of ibrutinib and the oxidative phosphorylation inhibitor IACS-010759 increased toxicity compared to ibrutinib monotherapy due to higher apoptosis and greater inhibition of proliferation. For anti-CD52 therapy, a consecutive approach with ibrutinib pretreatment followed by incubation of surviving cells with a CD52 monoclonal antibody and human serum yielded a synergistic effect, as ibrutinib-surviving mantle cell lymphoma cells were rapidly depleted by complement-dependent cytotoxicity. Regarding the effects on primary tumor cells from mantle cell lymphoma patients, ibrutinib induced upregulation of CD52 in some cases, and increased toxicity of anti-CD52 therapy was observed in ibrutinib-sensitive patient samples after pretreatment with the BTK inhibitor. The likely favorable in vivo efficacy of an anti-CD52 therapy might therefore be restricted to a subgroup of mantle cell lymphoma patients, also in view of the associated side effects. Given the need for new therapeutic options in mantle cell lymphoma to overcome resistance to ibrutinib, this work highlights the potentially beneficial use of an oxidative phosphorylation inhibitor as add-on therapy. In addition, the findings suggest to further assess the value of anti-CD52 therapy as consolidation to ibrutinib in ibrutinib-sensitive patients with elevated CD52 surface levels on tumor cells to target resistant clones and minimize risk of minimal residual disease and relapse. / Ibrutinib dient als wirkungsvolle Zweitlinientherapie beim rezidivierten/refraktären Mantelzell-Lymphom. Jedoch führt eine Resistenz gegen den BTK-Inhibitor zu einer schlechten Prognose für die Patienten. Da die Mechanismen, die zur Resistenz in initial ansprechenden Tumorzellen führen, nur unzureichend bekannt sind, hatte diese Arbeit zum Ziel, erworbene Eigenschaften in Ibrutinib-überlebenden Zellen einer sensitiven Mantelzell-Lymphom Zelllinie aufzudecken und darauf basierende therapeutische Ansätze im Ibrutinib-behandelten Mantelzell-Lymphom zu evaluieren. Eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die Entwicklung des Transkriptoms der REC-1 Zellen über eine Behandlung von 6 und 48 Stunden zu verfolgen. Die Einzelzellanalyse offenbarte eine Subpopulation der REC-1 Zelllinie, die möglicherweise eine größere Aggressivität und einen Überlebensvorteil aufwies, da sie von der Interaktion mit dem Tumormikromilieu profitieren könnte. Die Hochregulation von B-Zell Rezeptor Genen, erhöhte Oberflächenantigenexpression von CD52 und eine Umstellung des Metabolismus auf eine stärkere Abhängigkeit von der oxidativen Phosphorylierung wurden als weitere mögliche Resistenzeigenschaften der Ibrutinib-überlebenden Zellen identifiziert. Eine RNA-Sequenzierung nach längerer Inkubation bestätigte den Anstieg von CD52 und oxidativer Phosphorylierung als dominante Merkmale der Zellen, die die 4-tägige Behandlung überlebten, was ihr Potential als therapeutische Ansatzpunkte in Kombination mit einer Ibrutinib Therapie hervorhob. Die gleichzeitige Anwendung von Ibrutinib und dem Inhibitor der oxidativen Phosphorylierung, IACS-010759, erhöhte die Toxizität im Vergleich zur Ibrutinib-Monotherapie aufgrund einer gesteigerten Apoptose und einer stärkeren Hemmung der Proliferation. Bei der Anti-CD52-Therapie erzielte der konsekutive Ansatz mit Ibrutinib-Vorbehandlung und anschließender Inkubation der überlebenden Zellen mit einem monoklonalen CD52-Antikörper und humanem Serum einen synergistischen Effekt, da die unter Ibrutinib überlebenden Zellen schnell durch die komplementabhängige Zytotoxizität eliminiert wurden. Hinsichtlich der Auswirkungen auf primäre Tumorzellen von Mantelzell-Lymphom-Patienten führte Ibrutinib in manchen Fällen zu einer Hochregulierung von CD52, und in Ibrutinib-empfindlichen Patientenproben wurde nach Vorbehandlung mit dem BTK-Inhibitor eine erhöhte Toxizität der Anti-CD52-Therapie beobachtet. Die wahrscheinlich günstige In-vivo-Wirkung einer Anti-CD52-Therapie könnte daher auf eine Subgruppe von Mantelzell-Lymphom Patienten beschränkt sein, auch im Hinblick auf die damit verbundenen Nebenwirkungen. Angesichts des Bedarfs an neuen therapeutischen Optionen beim Mantelzell-Lymphom zur Überwindung der Ibrutinib-Resistenz unterstreicht diese Arbeit den potentiell vorteilhaften Einsatz eines Inhibitors der oxidativen Phosphorylierung als Zusatztherapie. Darüber hinaus legen die Ergebnisse nahe, den Nutzen einer Anti-CD52-Therapie als Konsolidierung zu Ibrutinib bei Ibrutinib-empfindlichen Patienten mit erhöhter CD52 Oberflächenexpression auf Tumorzellen näher zu untersuchen, um resistente Klone zu beseitigen und das Risiko einer minimalen Resterkrankung und eines Rückfalls zu minimieren.

Zum Nachweis einer interindividuellen Variabilität bei der Therapie mit Clopidogrel wurden in dieser Promotionsarbeit Patienten mit ausreichender Therapiedauer auf eine verbleibende Aktivierbarkeit der Thrombozyten untersucht. Hierfür wurde eine auf Phosphorylierung des Proteins VASP basierender Assay, der mittlerweile auch kommerziell verfügbar ist, eingesetzt. Dieser auf einer durchflusszytometrische Analyse beruhende Test zeigte bei 10 % der untersuchten Patienten eine Restaktivierbarkeit der Thrombozyten trotz ausreichender Thienopyridin-Einnahme. Die statistische Analyse erbrachte den Nachweis von zwei Untergruppen: Eine Untergruppe zeigte trotz Clopidogrel-Therapie eine fast normale Aktivierbarkeit der Thrombozyten („non-responder“), die andere zeigt eine teilweise Thrombozytenfunktionshemmung („low-responder“). In der statistischen Analyse wurde eine deutliche Signifikanz der Ergebnisse mittels Students-t-Test festgestellt. Aus zufällig ausgewählten Proben der „non-responder“ und der adäquat reagierenden Patienten konnte eine Veränderung intrazelluläre Signalwege nicht nachgewiesen werden. Nach Veröffentlichung der Gensequenz für den P2Y12 Rezeptor erfolgte die entsprechende Genanalyse bei diesen Patienten. Es konnten 2 stumme Polymophismen nachgewiesen werden, diese jedoch sowohl in der Gruppe der Responder als auch bei Low-/Non-Respondern. Somit wurde in dieser Promotionsarbeit das mittlerweile von verschiedenen Arbeitsgruppen diskutierte, bei etwa 10 % der Patienten auftretende Therapieversagen von Thienopyridinen bestätigt. Eine Genveränderung oder Änderungen intrazellulärer Signalwege konnte als molekulare Ursache nicht gezeigt werden. / To detect interindividual varabilities during clopidogrel treatment we investigated patients with sufficient treatment duration for remaining activation of platelets. For detection we used an VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) based assay, which is commercially available. This assay works with flow cell detection system (FACS) and showed in 10 % of all investigated patients remaining platelet activatiation even though thienopyridine treatment was sufficint. The statistic analysis showed two sub-groups of remaining platelet acitivity: one consisted of patients with completely regular platelet acitivity (non-responder), the other showed partial remaining acitivity (low-responder). The statistic analysis using a student-t-test proved a solid significance of the results. Randomly chosen probes out of the non-responder sub-group and the regular reacting patients showed no changes in intra-cellular pathways. The in 2000 newly published gene-sequence of the P2Y12 receptor was utilized to look for mutations/variations. Two silent polymorphism were detected in both (low- and non-responder) sub-groups. In this thesis we added to the increasingly published number of articles reporting a 10 % non-responding to thienopyridine treatment. For this variation no gene sequence alternation or change in intracellular pathway singalling were found responsible.

Zugl.: Hannover, Tierärztliche Hochsch., Diss., 2009

Background: A highly desmoplasmic microenvironment, the mutational landscape, and intra-tumoral heterogeneity contribute to the therapy resistance in pancreatic ductal adenocarcino-ma (PDAC). Due to higher precision, proton beam therapy is regarded beneficial compared to standard photon radiotherapy, although the role of radiotherapy is still ambiguous in PDAC. Cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) via integrins is well-known to mediate radi-ochemoresistance in various tumor entities. In PDAC, β1 integrins are associated with tumor progression. However, their role in radiochemoresistance is yet to be unraveled. Consequently, a comparative evaluation of cell survival and therapy sensitization after inhibition of β1 integ-rins or other survival-promoting protein kinases combined with either photon or proton irradia-tion and the underlying molecular mechanisms was carried out in this work. Materials and Methods: The expression of β1 integrins in PDAC and the correlation with pa-tient survival were assessed using publicly available patient data. The effect of β1 integrin inhi-bition by inhibitory antibodies or depletion on PDAC cell survival upon photon and proton irra-diation was explored using the tumoroid formation assay in three therapy-naïve and one radio-resistant PDAC cell lines grown in more physiological 3D laminin-rich ECM. Protein expression and cellular localization of β1 integrins were analyzed applying Western blot and immunofluo-rescence in the cell line panel. Basal molecular differences and those upon β1 integrin inhibi-tion were determined by a broad-spectrum kinome profiling in therapy-naïve and radioresistant 3D PDAC cultures. A potential interrelation of specific kinases with β1 integrin signaling in re-sponse to radiation was investigated in a single and double knockdown screen. The effects of photon and proton irradiation on PDAC cell survival of five 3D cultured PDAC cell lines were comparatively assessed using the 3D tumoroid formation assay. Molecular alterations upon both radiation types were identified by a broad-spectrum phosphoproteome analysis and Western blot. The exploitation of uniquely altered molecules and other signal transduction and DNA repair molecules for specific sensitization to photon and proton radiation was evaluated using specific biologicals in 3D cultured PDAC cell lines. Results: β1 integrins are overexpressed in PDAC compared to the normal pancreas, and the expression correlates with poorer patient survival. β1 integrin expression and localization var-ied cell line-dependently in the PDAC cell line panel. β1 integrin inhibition elicited an increase in radiosensitivity in all analyzed therapy-naïve and radioresistant 3D PDAC cultures, although less prominent in the latter. In line, the extent of kinase deregulation induced by AIIB2 was lower in the radioresistant 3D PDAC cultures. Double targeting of specific kinases with β1 in-tegrins further increased the radiosensitization in the therapy-naïve 3D PDAC cell cultures, whereas in the radioresistant counterpart, the effect was weak. Further, Erk2, PKD1, and CK1δ were revealed as potential interactors in the β1 integrin-mediated response to radiation. Proton irradiation showed a higher efficacy in the reduction of PDAC cell survival than photon irradia-tion. On the molecular level, irradiation with protons induced more phosphoproteomic altera-tions than photon radiation. Targeting of molecules uniquely altered upon irradiation failed to sensitize 3D PDAC cultures radiation type-specifically. However, a similar degree of radiosen-sitization for proton and photon irradiation in 3D PDAC cultures was observed upon targeting signal transduction and DNA repair proteins. Targeting non-homologous end joining (NHEJ)-specific proteins increased cellular radiosensitivity exceedingly for both radiation types in all 3D PDAC cell cultures. Conclusion: This work revealed a fundamental role of β1 integrins in intrinsic and acquired radioresistance of PDAC. However, to substantially overcome acquired radioresistance, further investigation is needed. Furthermore, a similar efficacy of proton and photon irradiation when combined with targeted therapies was demonstrated. These results suggest that multitargeting approaches based on targeting of β1 integrins or NHEJ-specific molecules combined with pho-ton or proton irradiation may turn out particularly promising. The strong radiosensitizing poten-tial of targeting these molecules may enable a more frequent use of radiotherapy for PDAC patient treatment. / Hintergrund: Ein stark desmoplasmatisches Mikromilieu, das Mutationsprofil und die intra-tumorale Heterogenität tragen zur Therapieresistenz des Pankreaskarzinoms bei. Aufgrund der höheren Präzision wird die Protonentherapie als vorteilhaft gegenüber der Standard Pho-tonentherapie angesehen, obwohl ihre Wirksamkeit im Pankreaskarzinom noch ungewiss ist. Es ist bekannt, dass die zelluläre Adhäsion an die extrazelluläre Matrix (EZM) über Integrine die Radiochemoresistenz in verschiedenen Tumorentitäten vermittelt. Hierbei stehen β1 In-tegrine in Zusammenhang mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Welche Rolle die β1 Integri-ne in der Radiochemoresistenz im Pankreaskarzinom spielen ist jedoch noch nicht bekannt. In dieser Arbeit wurde daher eine vergleichende Analyse des Zellüberlebens und der Therapie-empfindlichkeit nach Hemmung von β1 Integrinen oder anderen überlebensfördernden Pro-teinkinasen in Kombination mit Photonen- oder Protonenbestrahlung sowie der zugrundelie-genden molekularen Mechanismen durchgeführt. Material und Methoden: Die Expression von β1 Integrinen im Pankreaskarzinom und die Kor-relation mit dem Patientenüberleben wurden mittels öffentlich verfügbarer Patientendaten be-stimmt. Die Wirkung der β1-Integrin-Hemmung durch inhibitorische Antikörper oder mittels knockdown auf das Überleben von Pankreaskarzinomzellen bei Bestrahlung mit Photonen und Protonen wurde durch den Tumoroidbildungsassay in drei therapienaiven und einer strahlen-resistenten Pankreaskarzinomzelllinien untersucht. Diese wurden in physiologischer, 3D Lami-nin-reicher EZM kultiviert. Die Proteinexpression und die zelluläre Lokalisation von β1 Integri-nen wurden in allen Zelllinien mittels Western Blot und Immunfluoreszenz analysiert. Basale molekulare Unterschiede und solche nach Hemmung von β1 Integrinen wurden durch eine Breitspektrum-Kinomanalyse in therapienaiven und strahlenresistenten 3D-Pankreaskarzinomkulturen bestimmt. Eine mögliche Wechselbeziehung spezifischer Kinasen mit der β1 Integrin-vermittelten Strahlenantwort wurde in einem Einzel- und Doppel-knockdown Screen untersucht. Die Effekte der Bestrahlung mit Photonen und Protonen auf das Überleben von Pankreaskarzinomzellen wurden vergleichend anhand des Tumoroidbildungsassays in fünf 3D-kultivierten Pankreaskarzinomzelllinien bewertet. Durch beide Strahlungstypen indu-zierte molekulare Veränderungen wurden durch eine Breitspektrum-Phosphoproteomanalyse und mittels Western Blot identifiziert. Die Nutzung einzigartig veränderter Moleküle sowie an-derer Signaltransduktions- und DNA-Reparaturmoleküle zur spezifischen Sensibilisierung für Photonen- und Protonenstrahlung wurde untersucht. Dies erfolgte durch eine gezielte Hem-mung dieser Moleküle durch spezifische Biologika in 3D-kultivierten Pankreaskarzinomzellli-nien. Ergebnisse: β1 Integrine sind im Pankreaskarzinom im Vergleich zum gesunden Pankreas überexprimiert und ihre Expression korreliert negativ mit dem Patientenüberleben. Die Expres-sion und Lokalisierung der β1 Integrine variierte zelllinienabhängig in den Pankreaskarzinom-zelllinien. Die Hemmung der β1 Integrine führte zu einer Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit in allen analysierten therapienaiven und strahlenresistenten 3D kultivierten Pankreaskarzinom-zelllinien, auch wenn diese in den letzteren weniger stark ausfiel. Auch der Grad der durch die Hemmung induzierten Deregulierung von Kinasen in den strahlenresistenten 3D Pankreaskar-zinomzellkulturen war geringer. Der gleichzeitige knockdown spezifischer Kinasen mit β1 In-tegrinen potenzierte die Strahlenempfindlichkeit in den therapienaiven 3D Pankreaskarzinom-zellkulturen, während diese im strahlenresistenten Pendant nur wenig beeinflusst wurde. Fer-ner wurden Erk2, PKD1 und CK1δ als potenziell beteiligte Kinasen in der durch β1 Integrine vermittelten Strahlenantwort entdeckt. Die Bestrahlung mit Protonen zeigte eine höhere Wirk-samkeit bei der Verringerung des Pankreaskarzinomzellüberlebens als die Photonenbestrah-lung. Auf molekularer Ebene induzierte die Protonenbestrahlung mehr Veränderungen im Phosphoproteom als die Photonenbestrahlung. Die gezielte Hemmung von einzigartig verän-derten Molekülen sensibilisierte die 3D Pankreaskarzinomzellkulturen nicht Strahlungsart-spezifisch. Jedoch konnte eine ähnliche Effizienz der beiden Strahlungstypen nach Hemmung gewisser Signaltransduktions- und DNA-Reparaturproteine in 3D Pankreaskarzinomzellkultu-ren gezeigt werden. Die zelluläre Strahlenempfindlichkeit gegenüber beiden Strahlungsarten wurde hierbei besonders durch die Hemmung spezifischer Proteine des non-homologous end joining (NHEJ) in allen 3D Pankreaskarzinomzellkulturen erhöht. Schlussfolgerung: Diese Arbeit konnte eine wesentliche Rolle von β1 Integrinen bei der intrinsischen und erworbenen Strahlenresistenz im Pankreaskarzinom ermitteln. Um die Strah-lenresistenz jedoch gänzlich zu überwinden, sind weitere Untersuchungen erforderlich. Des Weiteren wurde eine ähnliche Wirksamkeit von Protonen- und Photonenbestrahlung in Kombi-nation mit gezielten Therapien gezeigt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Multi-Targeting-Ansätze, die auf der Hemmung von β1 Integrinen oder NHEJ-spezifischen Molekülen in Kom-bination mit Photonen- oder Protonenbestrahlung basieren, ausgesprochen vielversprechend sein können. Angesichts des enormen Potentials zur Steigerung der Strahlenempfindlichkeit durch die Hemmung dieser Moleküle könnte eine häufigere Anwendung der Strahlentherapie bei Pankreaskarzinompatienten ermöglicht werden.

Im Bereich der medikamentösen antidepressiven Therapie ist die Bedeutung von erblichen Polymorphismen arzneistoffmetabolisierender Enzyme bereits in vielen Studien untersucht und gezeigt worden. Die meisten Antidepressiva werden über polymorphe Cytochrom-P450-Enzyme verstoffwechselt. Diese Arbeit befasst sich mit der Fragestellung, ob die Häufigkeitsverteilung der CYP2D6-, CYP2C19- und CYP2C9-Allele in der an Depression erkrankten Studienpopulation sich von der in der Normalbevölkerung unterscheidet und ob Veränderungen in der Pharmakokinetik, wie sie durch Cytochrom-P450-Polymorphismen verursacht werden, unter normalen klinischen Bedingungen Auswirkungen auf die Wirksamkeit der antidepressiven Therapie, die Nebenwirkungsrate und den Verlauf der Erkrankung haben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 334 Patienten auf die häufigsten CYP2D6-Allele (*3,*4,*5,*6 und Duplikation) und CYP2C19- und CYP2C9-Allele *2 und *3 mittels Genotypisierung untersucht. Die Bestimmung der seltener auftretender CYP2D6-Allele (*8,*9,*10,*17,*2 und *41) erfolgte zusätzlich bei 200 Patienten. Die entsprechenden klinischen Fragebögen mit Angaben zur Anamnese, Schwere der Erkrankung, Therapieverlauf und Nebenwirkungsprofil wurden von 233 Patienten in Abhängigkeit des CYP2D6- und CYP2C19-Genotyps ausgewertet. Für die Beurteilung des Langzeittherapieverlaufs standen jedoch deutlich weniger Patientendaten zur Verfügung, so dass die Ergebnisse zum Teil nur für den CYPD6-Genotyp ausgewertet werden konnten. Die genetischen Analysen ergaben, dass die Häufigkeitsverteilung der CYP2D6-, CYP2C19- und CYP2C9-Polymorphismen in der untersuchten Studienpopulation keine signifikante Änderung im Vergleich zur Normalbevölkerung aufwies. Während der Einfluss der CYP2D6-Genotypen auf pharmakokinetische Parameter eindeutig nachgewiesen ist, konnten die Ergebnisse dieser Arbeit weitestgehend keinen Zusammenhang zwischen der Schwere der Depression, der Therapieresponse, der Häufigkeit und Schwere der Nebenwirkungen und dem CYP2D6- und CYP2C19-Genotyp herstellen. / The importance of genetic polymorphisms of drug metablizing enzymes have been already investigated und proved in many studies before. Most of antidepressants are metabolized by cytochrome P450 enzymes. The aim of this study was to determine if there is a difference in the distribution of CYP2D6-, CYP2C19- and CYP2C9-allels in inpatients with major depression in comparison to the healthy population and if changes in the pharmacokinatic, created by cytochrome P450 polymorphisms, can be have effects on the efficacy of antidepressant therapy, rate of intolerable side effects and development of the depression. We examined 334 patients by genotyping for the most important CYP2D6-allels (*3,*4,*6,*5 und duplication) and the CYP2C19- and CYP2C9-allels *2 and *3. Further 200 patients were tested for the more infrequent CYP2D6-allels (*8,*9,*10,*17,*2 and *41). The corresponding clinical questionnaires containing informations about the anamnesis, severity of the desease, therapeutic outcome and intolerable side effects have been evaluated of 233 patients in dependence of the CYP2D6- and CYP2C19-genotype. There were significant less clinical datas for the evaluation of long term therapy response be available, so that the results could be partially only analysed for the CYP2D6-genotype. The genetic analysis detected that the distribution of the CYP2D6-, CYP2C19- and CYP2C9-polymorphismen in the study population didn´t reached significant changes in comparison to the healthy population. While the influence of CYP2D6-genotypes on pharmacokinatic parameters is clear demonstrated, the results of this study mainly couldn´t establish a relation between the severity of depression, therapeutic response, frequency and severity of side effects and the CYP2D6 and CYP2C19-genotype.