Les acides aminés (AA) sont une composante essentielle du régime alimentaire des animaux de ferme, mais la détermination précise des besoins en AA est un défi. Les besoins en AA peuvent être influencés par de nombreux facteurs, notamment la génétique, la santé, l’âge et, comme récemment montrée, la variabilité individuelle. Dans les systèmes classiques d’alimentation des troupeaux par phase (SATP), tous les porcs reçoivent la même ration pendant de longues périodes. De ce fait et afin de s’assurer qu’ils expriment leur plein potentiel de croissance, la plupart des porcs reçoivent plus d’éléments nutritifs qu’ils n’en n’ont besoin, ce qui engendre des effets nuisibles sur l'environnement par l'excrétion d'azote accrue, et sur les coûts de production. Dans les systèmes d’alimentation individuelle de précision (SAIP), les porcs reçoivent une ration ajustée chaque jour en fonction de leurs besoins nutritifs. Dans ce contexte, il est nécessaire de distinguer les exigences de l’AA d’une population de celles des individus. Les rapports optimaux d’AA entre les différents AA essentiels ont été établis pour les systèmes d’alimentation classiques par phase, mais ces rapports pourraient différer selon qu’il s’agit d’un système d’alimentation classique ou d’un système d’alimentation de précision des porcs. L’objectif principal de cette recherche a été de comparer le rapport optimal thréonine: lysine (Thr: Lys) entre le système d’alimentation classique par phase et le système individuel d’alimentation de précision. À l’aide d’une méthodologie de dose-réponse avec cinq ratios Thr: Lys pour des porcs en croissance dans un SATP ou SAIP la composition chimique et la concentration en AA de la carcasse ont été affectées par le ratio Thr: Lys et l’ampleur ainsi que le type de réponse était dépendant du système d’alimentation utilisé. Il a été possible de confirmer l’hypothèse de départ selon laquelle les ratios optimaux des AA utilisés par le SATP ne sont pas adéquats pour établir les besoins des AA dans les systèmes d’alimentation de précision. Dans une seconde étude de dose-réponse avec des rapports Thr: Lys similaires offerts aux porcs en finition, les besoins de Thr:Lys étaient plus élevés que ceux observés précédemment pour les porcs en croissance suggérant que les besoins en AA pour le dépôt de protéine est dépendant de l'âge. Ces deux études suggèrent que les porcs peuvent moduler leur croissance et leur composition corporelle en fonction du niveau d'apport en AA et peuvent répondre différemment à la même quantité d'AA ingérée. Ces études soulignent en outre la faiblesse de l'utilisation d'un profil protéique idéal en considérant des exigences fixes en AA en raison de la composition en AA de la carcasse supposée constante. L'estimation précise des besoins en AA pour les porcs dans un SAIP semble être limitée par l'utilisation de ratios AA fixes, car les porcs ont des exigences en AA différentes. Enfin, une nouvelle approche basée sur une conception composite centrale avec une configuration factorielle visant à estimer indépendamment les besoins pour la Lys et la Thr en temps réel chez les porcs nourris individuellement a été proposée. Une réponse non unique du dépôt de protéines à diverses combinaisons Thr et Lys a été observée en raison des différences dans les exigences en AA entre les porcs. Cet aperçu de la variabilité entre les porcs est utile pour affiner le système d'alimentation de précision en estimant les besoins en AA de manière plus précise et en nourrissant les porcs selon leurs besoins individuels. De plus, cela permettrait de réduire le gaspillage de nutriments chez les porcs avec moins de dépôt protéique. Les résultats présentés dans cette thèse soutiennent l'idée que les changements dans la composition corporelle chez les porcs sont induits par des changements dans les niveaux alimentaires en AA. Par conséquent, la croissance peut être modulée en fonction de la composition corporelle optimale souhaitée par le consommateur. Cette thèse propose un changement de perspective dans la nutrition animale, où l’AA peut être un déclencheur de la réponse métabolique animale avec des exigences en AA dynamiques et distinctes chez les animaux de manière individuelle. / Amino acids (AA) are essential components of diets but accurate determination of AA requirements in farm animals is a challenge. Requirements for AA in pigs can be influenced by several factors, including genetics, health, age, and, as recently shown, also individual variability. In conventional group-phase feeding (GPF) systems, large groups of pigs receive the same feed during extended periods and most pigs receive more nutrients than required to express their growth potential with potential detrimental effects on the environment through increased nitrogen excretion, and on production costs. In individual precision feeding (IPF) systems, pigs are fed diets tailored daily to their individual nutrient requirements. In light of this, it is necessary to distinguish the AA requirements of a population from those of individuals. Optimal essential AA ratios have been established for pigs in conventional GPF systems, but these optimal AA ratios might differ for pigs in IPF systems. The main research objective was to compare the ideal protein profile in pigs using the optimal threonine-to-lysine (Thr:Lys) ratio between conventional GPF and IPF systems. Based on a dose-response approach with five levels Thr:Lys ratios offered to growing pigs in a GPF or IPF system, it was possible to confirm the initial hypothesis that optimal AA ratios differ between feeding systems. Carcass chemical composition and AA concentration was likewise affected by the Thr:Lys ratio, and the magnitude and type of response depended on the feeding system. In a second dose-response study with similar Thr:Lys ratios offered to late finishing pigs, requirements were larger than to those previously observed for growing pigs, suggesting that AA requirements for protein deposition is age dependent. These two studies suggest that individual pigs can modulate their growth and body composition according to the level of AA intake and can respond differently to same amount of ingested AA. These studies further highlighted the weakness of using an ideal protein profile by considering fixed requirements for AA due the assumed constant AA carcass composition. Accurate estimation of AA requirements for pigs in an IPF system seems to be mainly limited by the use of fixed AA ratios as pigs have different AA requirements. Finally, a novel approach to the dose-response approach based on a central composite design with a factorial design aiming at independently estimating real-time requirements for Lys and Thr in individual pigs was proposed. A non-unique response of protein deposition to various Thr and Lys combinations was observed due to the differences in AA requirements among individual pigs. This insight on variability among individual pigs is useful to fine-tune the precision feeding system by estimating AA requirements more accurately, feeding pigs according to their individual requirements, and, ultimately, reduce waste of nutrients in pigs with lower protein deposition. The results presented in this thesis support the idea that changes in body composition in pigs are induced by changes in dietary AA levels. Therefore, growth may be modulated to the optimal body composition desired by the consumer. This thesis proposes a change of perspective in animal nutrition, where AA may be seen as a trigger for animal metabolic response with dynamic and distinctive AA requirements in individual animals. / Os aminoácidos (AA) são componentes essenciais das dietas, mas a determinação exata das exigências de AA em animais de criação é um desafio. Exigências nutricionais de AA em suínos podem ser influenciadas por vários fatores os quais incluem: genética, estado sanitário, idade, e como recentemente demonstrado, a variabilidade individual. Tradicionalmente animais recebem a dieta usando um sistema convencional de alimentação de grupos por fase (AGF). Nesse sistema todos os suínos recebem a mesma ração durante toda uma fase de crescimento e a maioria dos animais recebem mais nutrientes do que o necessário para expressar o seu potencial de crescimento. Isso vai impactar negativamente no meio-ambiente devido a grande excreção de nitrogênio e nos aumentados custos de produção. Em sistemas de alimentação precisão individual (API), os suinos são alimentados com dietas diariamente adaptadas às suas exigências individuais de AA. Neste contexto, é necessário distinguir as exigência de AA de uma população e de indivíduos. O perfil de proteína ideal foi estabelecido para suínos em sistemas convencionais de AGF, mas estas relações ideais de AA podem ser diferentes para suínos em sistemas API. O objetivo principal da pesquisa foi comparar o perfil de proteína ideal em suínos, usando a relação ideal treonina-para-lisina (Thr:Lys) entre sistemas convencionais de AGF e API. Usando a metodologia de dose-resposta com cinco relações Thr:Lys dentre de um sistema AGF ou API, foi possível confirmar a hipótese inicial que perfil de proteína ideal em suínos diferem entre sistemas de alimentação. A composição química e concentração de AA na carcaça também foi afetada pela relação Thr:Lys, e a magnitude e o tipo de resposta foram dependentes do sistema de alimentação usado. Em um segundo estudo de dose-resposta, com relações de Thr:Lys semelhantes as oferecidas anteriormente aos suínos em crescimento foram oferecidas à suínos em terminação. Foi possivel observar que para estes as exigências de Thr eram maiores do que aquelas observadas anteriormente para suínos em crescimento, sugerindo que as exigências de AA para deposição de proteína é idadedependente. Estes dois estudos sugerem que suínos podem modular a sua taxa de crescimento e composição corporal de acordo com o nível de ingestão de AA e podem responder de forma diferente a mesma quantidade de AA ingerido. Estes estudos destacam a fragilidade do uso do conceito perfil de proteína ideal, considerando exigências fixas de AA devido a assunção de que a composição de carcaça tem concentração de AA constante. A determinação exata das exigências de AA para suínos em um sistema API parece ser limitada principalmente pelo uso de relações fixas e constantes de AA, porém suínos têm exigências de AA diferentes entre eles. Finalmente, propõe-se uma nova abordagem baseada num desenho composto central com uma configuração fatorial visando independentemente estimar as exigências de Lys e Thr em tempo real para suínos em um sistema API. Com esta metodologia, observou-se uma resposta de deposição de proteína não-unica para diferent combinações de Thr e Lys, devido às diferenças nas exigências de AA entre suínos. Essa percepção sobre a variabilidade entre individuos é útil para ajustar o modelo de nutrição de precisão aprimorando as estimativas de exigências AA, nurrindo animais de acordo com suas necessidades individuais possibilitando a redução do desperdício de nutrientes especialmente em suínos com baixa deposição de proteína. Os resultados apresentados nesta tese, apoiam a ideia de que alterações na composição corporal em suínos são induzidas por alterações nos níveis dietéticos de AA. Portanto, o crescimento pode ser modulado para a composição de corporal ideal desejada pelo consumidor. Esta tese propõe uma mudança de perspectiva na alimentação animal, onde AA pode ser visto como um gatilho para desencadear uma resposta metabólica animal ao invés da tradicional visão de AA como exigências nutricionais fixas.

Il est de plus en plus reconnu que la neurobiologie de la récompense et du renforcement joue un rôle important dans le développement de l'obésité. Parmi les gènes candidats entourant ces processus, DRD2 est l'un des plus étudié. Récemment, sa mutation la plus connue (TaqIA, rsl800497) a été relocalisée dans le gène adjacent ANKK1. Ce dernier n'ayant pas été directement étudié en lien avec l'obésité, l'objectif de cette étude était de répliquer les résultats précédents sur DRD2 en plus de tester l'association de polymorphismes du gène ANKK1 avec l'obésité. Trois mutations du gène DRD2 et cinq de ANKK1 ont été génotypées chez 946 sujets de l'Étude des familles du Québec. Ces derniers ont été phénotypés pour plusieurs indices d'adiposité, leurs comportements alimentaires ont été mesurés par questionnaire et leur diète par journal alimentaire. Les associations les plus fortes ont été observées avec ANKK1 rsl7115439 et DRD2 rs6277. Chez les femmes, le polymorphisme ANKK1 rsl 7115439 était associé à des valeurs plus élevées d'adiposité alors que chez les hommes, cet allele était associé à une consommation plus élevée de lipides. Le polymorphisme DRD2 rs6277 était également associé à des valeurs d'adiposité plus élevées chez les femmes et à une diète plus riche en gras chez les hommes. Aucune association n'a été observée avec les comportements alimentaires du TFEQ . Ces résultats indiquent que des variations génétiques communes des gènes DRD2 et ANKK1 pourraient être impliquées dans la prédisposition à l'obésité.

Introduction : L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie caractérisée par une augmentation des pressions pulmonaires menant à une défaillance cardiaque droite. Les cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CMLAP) sont exposées à un niveau de stress accru notamment dû à l’inflammation des tissus et du milieu pseudo-hypoxique. Malgré cet environnement hostile, elles arrivent à proliférer et à survivre. Toutefois, cela entraine une augmentation anormale du dommage à l’ADN. Il existe, cependant, un équilibre entre les dommages à l’ADN et les mécanismes de réparation. PIM1, une onco-protéine à l’activité kinase, est surexprimée en HTAP. Elle est impliquée dans plusieurs voies de signalisation cellulaire, telles la survie et la prolifération, mais la voie de réparation du dommage à l’ADN n’a jamais été explorée en HTAP. De plus, l’inhibiteur de PIM1, le SGI-1776, a été testé en essai clinique en cancer, ainsi l’évaluation de son efficacité pour les patients HTAP pourrait rapidement être mise en place. Objectifs : Évaluer le potentiel thérapeutique du SGI-1776 et élucider l’implication de PIM1 dans la réparation du dommage à l’ADN en HTAP. Méthodes/Résultats : Nous démontrons premièrement que les poumons de patients HTAP (n=10) ainsi que les CMLAP-HTAP (n=5) présentent une surexpression de PIM1. Sur ces mêmes tissus et lignées cellulaires, le précurseur de la reconnaissance des dommages à l’ADN (γH2AX) est également augmenté comparativement aux sujets sains. Ce précurseur est essentiel à l’initiation de la réparation à l’ADN et l’inhibition de PIM1 par SGI-1776 (1,3 et 5μM) diminue la capacité de la réponse au dommage à l’ADN via la voie de la jonction des extrémités non-homologues (NHEJ) : le traitement cause une diminution des facteurs du NHEJ comme Ku70, DNA-PKcs et γH2AX (n=4). Par essai comet, nous démontrons que les dommages sont toujours présents et que ceci diminue la prolifération (Ki67 n=3; p<0.05) et augmente l’apoptose (AnnexinV n=3; p<0.05). In vivo, le SGI-1776 diminue les pressions pulmonaires (n=30, 30±2mmHg vs 49±5mmHg) et diminue le remodelage des artères pulmonaires distales (H&E, 45% vs 65%), ce qui est principalement dû à la restauration de la balance entre la prolifération (Ki67 n=25; p<0.05) et l’apoptose (TUNEL n=25; p<0.05) des artères pulmonaires distales. Conclusion : Nous avons démontré pour la première fois l’implication de PIM1 dans la réparation du dommage à l’ADN en HTAP et que l’inhibition de son activité améliore in vitro et in vivo l’HTAP. / RATIONALE: Pulmonary Arterial Hypertension (PAH) is a fatal disease characterized by the narrowing of pulmonary arteries (PA) due to vascular remodeling. It is now established that this phenotype is associated with enhanced pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) proliferation and suppressed apoptosis. This phenotype is sustained in part by the activation of several DNA repair pathways allowing PASMC to survive despite the environmental stresses seen in PAH. PIM1 is an oncoprotein upregulated in PAH and that has been implicated in many pro-survival pathways in cancer, including DNA repair. PIM1 inhibitors, like SGI-1776, are already in clinical trials in cancer and could thus be beneficial to PAH patients. OBJECTIVES: The aim of this study is to demonstrate the implication of PIM1 in the DNA damage response and the beneficial effect of its inhibition by SGI-1776 in human PAH-PASMC and in rat preclinical model of PAH. METHODS/RESULTS: Using western blot we showed in both human PAH lungs (n=10) and PAH-PASMC (n=5) a significant upregulation of PIM1 compared to control donor (n=5). PIM1 upregulation in PAH was associated with a significant activation of DNA damage sensor (γH2AX), which is critical for DNA repair initiation. We showed that PIM1 inhibition using SGI-1776 (1,3, and 5μM) significantly impaired DNA repair capacity in PASMC (n=4) with a significant repression of Ku70, DNA-PKcs, and γH2AX and decreased ATM expression. We showed no diminution of DNA damage with SGI-1776 treatment (Comet Assay, n=3). As expected, the lack of DNA repair in SGI-1776 treated PAH-PASMC lead to a significant reduction in proliferation (Ki67 n=3; p<0.05) and resistance to apoptosis (AnnexinV assay n=3; p<0.05). In vivo, SGI-1776 10mg*kg-1 given 3 times a week, improves significantly (n=30; p<0.05) monocrotaline-induced PH (decreased RVSP, mean PA pressures and vascular remodeling). CONCLUSION: We demonstrated for the first time that PIM1 is implicated in DNA repair signaling in PAH-PASMC and that repressing its activity everses PAH both in vitro and in vivo.

La maladie de Parkinson est une maladie neurologique chronique caractérisée par la dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta. Une deuxième caractéristique neuropathologique de cette maladie est l’accumulation des agrégats intracellulaires appelés les corps de Lewy (CLs). Ces agrégats sont majoritairement formés par une protéine pré-synaptique, α-synucléine (α-syn). Cette accumulation pathologique interfère avec les voies métaboliques vitales des neurones telles que la transmission synaptique et l’activité mitochondriale, ce qui engendre la mort cellulaire. Par conséquence, éliminer les formes toxiques, diminuer l’expression de la forme native et réduire ainsi la probabilité de la formation d’agrégats pourrait être une stratégie thérapeutique d’intérêt pour le traitement de la maladie de Parkinson et d’autres désordres qui y sont reliés. Dans ce contexte, notre équipe a récemment décrit une nouvelle voie d’élimination de l’α-syn qui est catalysée par l’activité enzymatique de la kinase Polo-like kinase 2 (PLK2). Cependant, les mécanismes cellulaires ainsi que l’identité des molécules impliquées sont encore méconnus. Donc, mes travaux se sont concentrés sur l’étude de cette voie et ses différentes étapes qui mènent à enlever l’effet toxique de l’α-syn. Dans ce mémoire nous montrons que, en plus de la PLK2, la PLK3, un autre membre de la famille des PLKs, est capable de phosphoryler l’α-syn au niveau du résidu S129 et induire son élimination. En plus, nous déclarons que cette action exige une interaction physique entre les 2 protéines (α-syn et PLK2) impliquant le domaine N-terminal et qu’une étape de poly-ubiquitination est essentielle pour que ce complexe protéique se dirige vers la voie de dégradation autophagique. Cette action de la PLK2 est observée également sur des formes mutées de l’α-syn tels que α-syn A30P, α-syn A53T et d’une manière plus accentuée sur la forme mutante α-syn E46K. La caractérisation de cette voie d’élimination offre de nouvelles opportunités pour le développement des traitements qui favorisent, d’une façon spécifique et sélective, la dégradation de l’α-syn et par conséquent la réduction des formes toxiques de cette dernière. / Parkinson's disease is a chronic neurological disease characterized by the progressive degeneration of the dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. A second neuropathological feature of this disease is the accumulation of intracellular aggregates called Lewy bodies. These aggregates are formed by a pre-synaptic protein, α-synuclein (α-syn). This pathological accumulation interferes with the vital metabolic pathways of neurons such as synaptic transmission and mitochondrial activity, leading to cell death. Consequently, promoting the elimination of the toxic forms, reducing the expression of the native form and decreasing the probability of aggregate formation could be a therapeutic strategy of interest for the treatment of Parkinson's disease and other related disorders. Recently, we have described a novel α-syn degradation pathway that is catalyzed by the enzymatic activity of Polo-like kinase 2 (PLK2). However, the cellular mechanism and the identity of the molecules involved are still unknown. So, my work has focused on studying this pathway and its various steps that lead to remove the toxic effect of α-syn. In this thesis we show that, in addition to PLK2, PLK3, another member of the PLK family, is able to phosphorylate α-syn at S129 and induce its elimination. In addition, we declare that this action requires a physical interaction between the 2 proteins (α-syn and PLK2) involving the N-terminal domain and that a poly-ubiquitination step is essential for the autophagic degradation of the α-syn and PLK2 complex. This effect of PLK2 is also observed on mutated forms of α-syn such as α-syn A30P, α-syn A53T and is more pronounced in the case of the α-syn E46K mutant. The characterization of this elimination pathway offers new opportunities for the development of treatments that allow, in a specific and selective manner, the degradation of α-syn and thus the reduction of its toxic forms.

La protéine mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin), lorsque dérégulée, favorise le développement tumoral par ses fonctions dans la prolifération et la survie cellulaire. Son activité est contrôlée principalement par les facteurs de sa voie d'activation canonique (PTEN/PI3K/AKT) qui sont souvent mutés dans les cancers. Cependant, certains cancers ne présentent pas d'altérations dans cette voie canonique bien que mTOR soit constitutivement active, suggérant ainsi un mécanisme différent. C'est le cas des gliomes de bas grade dont une grande partie présente des mutations hétérozygotes de l'enzyme Isocitrate déshydrogénase (IDH1 et IDH2) menant à un gain de fonction de celles-ci. En effet, l'α-cétoglutarate (αKG) produite par les formes sauvages sera rapidement transformé en 2-Hydroxyglutarate (2HG) par les formes mutées. De plus, ces gliomes présentent très tôt une activité accrue de mTOR et ce, de façon PTEN indépendante. Un criblage par ARN d'interférence ciblant des enzymes αKG dépendantes a permis l'identification de KDM4A, une lysine déméthylase, comme un nouveau régulateur de mTOR. La régulation de KDM4A sur mTOR n'est pas transcriptionnelle, mais semble due à son interaction avec DEPTOR. En effet, sa stabilité, en absence de KDM4A, est grandement diminuée, ce qui favorise l'activité de mTOR. Ainsi, l'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR s'avère être un nouveau mode de régulation de la protéine mTOR. Nous avons également découvert que DEPTOR peut être phosphorylé sur sa tyrosine 289, ce qui favorise l'activité de mTOR. Cette tyrosine, située près de sérines connues pour réguler la dégradation de DEPTOR, permet une meilleure stabilité de la protéine. De plus, la phosphorylation favorise une réorganisation rapide du cytosquelette d'actine par l'activation de mTORC2. Nous avons par la suite montré qu'elle diminue l'affinité de DEPTOR pour mTOR amenant une activation accrue de cette voie. Un criblage avec différents inhibiteurs de tyrosines kinases de même qu'une analyse par spectrométrie de masse nous a permis d'identifier les kinases SYK (Spleen Tyrosine Kinase) et EPHB2 comme régulateurs de la phosphorylation tyrosine de DEPTOR. En effet, nous avons démontré que la phosphorylation de SYK sur DEPTOR était dépendante de l'activation de SYK par EPHB2. En plus de cette phosphorylation tyrosine, DEPTOR possède également de nombreuses autres modifications post-traductionnelles. En effet, il peut être ubiquitinilé par des chaînes d'ubiquitine de type K48 promouvant sa dégradation par le protéasome, mais également par des chaînes d'ubiquitine K63 dont leur fonction est encore inconnue. L'absence de modification post-traductionnelles sur les 5 dernières lysines de DEPTOR augmente drastiquement la phosphorylation de la tyrosine 289 suggérant que la méthylation ou l'ubiquitination affecte cette modification. Nous avons également trouvé que DEPTOR pouvait être NEDDylée dans sa portion N-terminale au niveau de ses domaines DEP. Une analyse de spectrométrie de masse après des expériences de marquage de proximité par biotinilation a permis d'identifier de multiples enzymes pouvant potentiellement moduler ces modifications. Toutes ces modifications ouvrent la porte à de nouvelles avenues de régulation de l'activité de DEPTOR sur mTOR. L'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR de même que la phosphorylation de la tyrosine 289 de DEPTOR se révèlent comme de nouveaux mécanismes régulant l'activité de mTOR pouvant expliquer l'augmentation de l'activité de mTOR dans les cancers où la voie canonique n'est pas affectée. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles avenues thérapeutiques qui, combinées à celles déjà existantes, permettra d'offrir des traitements prometteurs lorsque cette voie est dérégulée, notamment dans les gliomes de bas grade. / Dysregulated mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin) is a potent tumor growth inducer known to promote cancer cell proliferation and survival. Its activity can be regulated by numerous factors composing the PTEN/PI3K/AKT canonical pathway, which are often mutated in cancer. However, in a subset of cancer showing a constitutively activated mTOR, there is no alteration within the canonical activation pathway, suggesting different activation mechanisms. Low-grade gliomas harbor mutation on Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 (IDH1/2) conferring gain-of-function by the production of 2-Hydroxyglutarate (2HG) from α Ketoglutarate (αKG). This leads to a constitutive mTOR activation in a canonical independent manner. An RNAi screen led us to identify KDM4A, a αKG dependant lysine demethylase as a new regulator of mTOR activity. KDM4A interacts with DEPTOR, an endogenous inhibitor of mTOR and member of both mTOR complex. Depletion or inhibition of KDM4A by 2HG decreases DEPTOR stability and thereby increases mTOR activity. We also discovered a new post-translational modification (PTM) on DEPTOR, corresponding to a single phosphorylation event on tyrosine 289. While this modification increases DEPTOR stability, it also promotes its dissociation from mTORC1&2, leading to a rapid and sustain increase in mTORC1&2 activity. To identify the upstream signaling pathway(s) leading to tyrosine 289 phosphorylation, we performed mass spectrometry analysis, as well as a small drug screen of different tyrosine kinase inhibitors. Using these combined methods, we identify SYK (Spleen tyrosine kinase), whose expression levels correlate with levels of tyrosine 289 phosphorylation. We also found that SYK-induced phosphorylation of DEPTOR was regulated by the EPHB2 receptor. We have shown that DEPTOR harbors many other PTM like ubiquitination conjugated on lysine 48 promoting proteasomal degradation and ubiquitination conjugated on lysine 63 whose function is still unknown. The absence of PTM on the last 5 lysines of DEPTOR drastically increases the phosphorylation of tyrosine 289 suggesting that methylation and/or ubiquitination affect this modification. We also found that DEPTOR can be NEDDylated in its N-terminal part on its DEP domains. Mass spectrometry analysis after proximity biotinilation assays led us to discover multiple enzymes that could potentially modulate all these modifications. This open new insight on DEPTOR regulation and function on mTOR. Our findings uncovered new mechanisms regulating DEPTOR activity, which can explain the increased mTOR activity in cancer with unaffected PTEN/PI3K/AKT regulatory pathways. Better understanding of this mTOR/DEPTOR regulatory pathway could allow the development of a new therapeutic approach to inhibit mTOR associated cancer progression.

Le séquençage intégral du génome de Mycobacterium tuberculosis a permis de mettre en évidence l’existence de onze Sérine/Thréonine Protéine-Kinases (STPKs) chez cette bactérie. Bien que la quasi-totalité des STPKs aient été biochimiquement caractérisées, très peu de substrats endogènes ont pu être identifiés. Par conséquent, le rôle physiologique de ces couples kinase/substrat reste à élucider. Tout d’abord, les études réalisées au cours de ce travail ont concerné la caractérisation biochimique de la protéine-kinase PknL, ainsi que l’identification de ses substrats potentiels, et notamment la protéine Rv2175c. En effet, l’analyse de l’environnement génétique du gène pknL de la kinase a révélé la présence du gène adjacent rv2175c, pouvant ainsi représenter un substrat éventuel de PknL. Les différentes approches mises en oeuvre ont permis d’identifier cinq sites de phosphorylation sur PknL, et de mettre en évidence le caractère essentiel des résidus K48, T173 et T175 dans les mécanismes d’autophosphorylation de PknL et de phosphorylation de Rv2175c, confirmant ainsi Rv2175c comme substrat spécifique de PknL. Par ailleurs, la caractérisation par RMN de la structure de Rv2175c a permis de déterminer la fonction de cette protéine. Rv2175c possède toutes les caractéristiques structurales d’une protéine capable de fixer l’ADN. Des études fonctionnelles ont permis de confirmer la capacité de Rv2175c de fixer l'ADN et ont mis en évidence le mécanisme de régulation via phosphorylation régissant son activité de fixation. Ensuite, nous avons mis en évidence la phosphorylation des protéines chaperonnes mycobactériennes et, plus particulièrement, caractérisé GroEL1. Nous avons démontré que GroEL1 était phosphorylée par PknF, et identifié les résidus T25 et T54 comme étant les sites de phosphorylation de GroEL1. L’ensemble de cette étude nous a donc permis de caractériser de nouveaux substrats de phosphorylation chez M. tuberculosis, de mieux appréhender les interactions kinase/substrat et d’impliquer la phosphorylation dans la régulation de l’activité de ces substrats / Analysis of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis predicted the presence of eleven Serine / Threonine Protein-Kinases (STPKs). Although most kinases have been investigated for their physiological roles, little information is available regarding how STPK-dependent phosphorylation regulates the activity of kinase substrates. As a result, the physiological role of these kinase / substrate couples remains to be clarified. During the course of this work, we first characterized a substrate/kinase pair, PknL/Rv2175c. Moreover, pknL (rv2176) is adjacent to rv2175c, a gene encoding a putative DNA-binding transcriptional regulator. We demonstrated that PknL can recruit and phosphorylate Rv2175c and that phosphorylation of Rv2175c was dependent on a specific phosphorylated residue located within the activation loop of PknL. However, although Rv2175c harbours a DNAbinding domain carrying a helix-turn-helix (HTH) motif, it shares only weak similarity to transcriptional regulatory proteins. Therefore, to provide further evidence for the function of Rv2175c, we have solved the soluble NMR structure of Rv2175c. In addition, we confirmed by gel shift mobility assays that Rv2175c was indeed able to bind DNA. More importantly, we identified Thr9 as the unique phosphorylation site in Rv2175c, and demonstrated that phosphorylation of Rv2175c strongly altered its DNA-binding activity. In addition, although mycobacterial GroEL1 proteins have been extensively studied, no data were available with respect to their potential post-translational modifications. We reported here, for the first time, phosphorylation of the M. tuberculosis GroEL1 chaperone. We demonstrated that M. tb GroEL1 is phosphorylated by PknF at two positions, Thr25 and Thr54. Unexpectedly, Mycobacterium smegmatis GroEL1 is not a substrate of its cognate PknF. This study showed that the phosphorylation profile of conserved proteins is species dependent and provides insights that may explain the numerous biological functions of these important proteins

Le séquençage intégral du génome de Mycobacterium tuberculosis a permis de mettre en évidence l'existence de onze Sérine/Thréonine Protéine-Kinases (STPKs) chez cette bactérie. Bien que la quasi-totalité des STPKs aient été biochimiquement caractérisées, très peu de substrats endogènes ont pu être identifiés. Par conséquent, le rôle physiologique de ces couples kinase/substrat reste à élucider. Tout d'abord, les études réalisées au cours de ce travail ont concerné la caractérisation biochimique de la protéine-kinase PknL, ainsi que l'identification de ses substrats potentiels, et notamment la protéine Rv2175c. En effet, l'analyse de l'environnement génétique du gène pknL de la kinase a révélé la présence du gène adjacent rv2175c, pouvant ainsi représenter un substrat éventuel de PknL. Les différentes approches mises en oeuvre ont permis d'identifier cinq sites de phosphorylation sur PknL, et de mettre en évidence le caractère essentiel des résidus K48, T173 et T175 dans les mécanismes d'autophosphorylation de PknL et de phosphorylation de Rv2175c, confirmant ainsi Rv2175c comme substrat spécifique de PknL. Par ailleurs, la caractérisation par RMN de la structure de Rv2175c a permis de déterminer la fonction de cette protéine. Rv2175c possède toutes les caractéristiques structurales d'une protéine capable de fixer l'ADN. Des études fonctionnelles ont permis de confirmer la capacité de Rv2175c de fixer l'ADN et ont mis en évidence le mécanisme de régulation via phosphorylation régissant son activité de fixation. Ensuite, nous avons mis en évidence la phosphorylation des protéines chaperonnes mycobactériennes et, plus particulièrement, caractérisé GroEL1. Nous avons démontré que GroEL1 était phosphorylée par PknF, et identifié les résidus T25 et T54 comme étant les sites de phosphorylation de GroEL1. L'ensemble de cette étude nous a donc permis de caractériser de nouveaux substrats de phosphorylation chez M. tuberculosis, de mieux appréhender les interactions kinase/substrat et d'impliquer la phosphorylation dans la régulation de l'activité de ces substrats

Le sujet de cette thèse porte sur la synthèse d'inhibiteurs spécifique de la Sérine-Thréonine phosphatase I (PP1). Un criblage de la chimiothèque de l'institut Curie, réalisé par l'équipe du Dr. Popov a permis d'identifier une 3-aryl-1(2H)isoquinolone, qui perturbe la dynamique des microtubules et qui s’est ensuite avéré être un inhibiteur sélectif de PP1. Dans une première partie, nous avons mis au point une nouvelle méthodologie de synthèse de ces composés hétérocycliques par une réaction tandem d’aminocarbonylation-cyclisation pallado catalysée. L’étude d’une seconde voie de synthèse de ces composés a été étudié par réaction d'arylation direct d'une 1(2H)isoquinolone. Dans le but de trouver d’autres hit, ligand de cette phosphatase, nous avons tenté de développer un test de triple hybride chimique, en collaboration avec la société Hybrigenics. Ce test est basé sur l’interaction de notre inhibiteur hit avec la phosphatase PP1. Pour cela, nous avons synthétisé une sonde à partir de la molécule hit initiale. La deuxième partie a trait à un développement de chimie médicinal pour optimiser le hit initial. Des dérivés de très bonne sélectivité pour l’enzyme cible ont été préparés. / This PhD thesis deals with the synthesis of serine threonine phosphatase I (PPI) inhibitors. This project started with the screening of the Institut Curie’s Library carried out by Dr. Popov team. They identified a 3-aryl-1(2H)isoquinolone (hit molecule) which strongly disturbs the microtubules dynamics. In the first part, we designed an original methodology to prepare those heterocycles, though a tandem palladium catalyzed aminocarbonylation/cyclization reaction. Then, we studied the direct arylation reaction to obtain the desired scaffold. In collaboration with Hybrigenics, we synthesize a probe for a triple hybrid system, based on the specific interaction of the hit molecule with its target PPI. Thanks to this system, one could identify new inhibitors of the targeted phosphatase protein. Eventually, a library of isoquinolones derivatives was synthesized. During the invitro tests, some of those molecules proved to be very specific for the serine threonine phosphatase I.

La phosphorylation de protéines correspond à l’addition covalente d’un groupement phosphate (PO4 3-) par une protéine kinase sur un substrat. Cette réaction est réversible : la déphosphorylation est catalysée par des protéines phosphatases. Chez S. aureus, la sérine/thréonine kinase Stk1 phosphoryle des acides aminés sérines et thréonines et a été montrée impliquée dans la régulation de la virulence du pathogène : nous avons approfondi les connaissances sur ce mécanisme en identifiant trois nouveaux substrats et en étudiant les effets de la phosphorylation sur leur activité : - l’enzyme LuxS, responsable de la synthèse de l’AI-2 impliqué dans la communication intra bactérienne, voit son activité enzymatique drastiquement diminuée en étant phosphorylée par Stk1 sur un site thréonine unique (T14) ; - le régulateur CcpA, dont la fixation sur l’ADN module l’expression de nombreux gènes de virulence, est phosphorylée par Stk1 sur deux sites (T18 et T33) et cette phosphorylation diminue l’affinité de la protéine régulatrice CcpA pour l’ADN de ses gènes cibles ; - l’élément réponse du système à deux composants SaeR est phosphorylé sur deux sites thréonines (T87 et T192) de la région impliquée dans l’affinité de SaeR pour l’ADN. Les rôles de la kinase Stk1 sont donc multiples et liés à la régulation de la virulence de S. aureus. Les autres voies mettant en jeu la phosphorylation de protéines bactériennes, comme les systèmes à deux composants ou le système CcpA/HPr, sont couplées à cette phosphorylation par la sérine/thréonine kinase : ces résultats soulignent à la fois la diversité et la complexité de la régulation des mécanismes responsables de la virulence de S. aureus / Protein phosphorylation consists in the catalyzed addition of a phosphate group on a substrate. This reversible reaction is ensured by both kinase and phosphatase proteins. S. aureus is a human prokaryote pathogen and a part of its virulence is known to be regulated by the serine/threonine kinase Stk1, which phosphorylates serine or threonine residues of its substrates. We investigated the mechanisms of this virulence regulation and newly identified three substrates of Stk1: the quorumsensing LuxS protein, the catabolite carbon protein CcpA and the two components system response element SaeR. LuxS is phosphorylated on a unique threonine residue in position 14 and phosphorylation dramatically influences its enzymatic activity on AI-2 production. CcpA phosphorylation on two threonine residues in the DNA-binding region of the protein (T18 and T33) decreases the affinity of the protein for its targeted DNA sequences. Besides, Stk1 also phosphorylates the response element SaeR on two threonine residues (T87 and T192) in the DNAbinding region. Therefore Stk1 kinase plays numerous roles in S. aureus virulence regulation and the complexity of this regulation pattern increases when considering that three of the phosphorylation pathways in prokaryotes are crossed over: the two components system phosphorylation, the HPr/HPrK system and the serine/threonine kinase proteins phosphorylation. These results highlight the need to focus on Stk1 as a key element in the complexity of virulence regulation in S. aureus

La voie de signalisation mTORCl/S6Kl est impliquée dans le développement de la résistance à l'insuline associée à l'obésité en exerçant une boucle de rétro-contrôle négative sur la voie de signalisation PI3K-Akt. Tandis que l'utilisation à court terme de la rapamycine, l'inhibiteur pharmacologique de la voie mTORCl, permet d'inhiber le rétro-contrôle négatif, les effets de l'inhibition chronique de la voie sur le métabolisme ne sont pas connus. L'objectif principal des études présentées dans cette thèse était d'investiguer les effets métaboliques de l'inhibition chronique de la voie de signalisation mTORCl/S6Kl in vitro et in vivo. Dans la première étude, nous avons montré que l'inhibition chronique de mTORCl/S6Kl découple l'activation d'Akt de la PI3K ce qui cause une résistance à l'insuline dans les cellules 3T3-L1. Dans une deuxième étude, nous avons découvert que l'utilisation chronique de la rapamycine in vivo cause une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline de par une augmentation de la gluconéogénèse hépatique en plus d'affecter négativement le métabolisme des lipides. Dans une troisième étude, nous avons démontré que l'inhibition chronique de mTORCl/S6K1 dans les cellules hépatique FAO découple l'activation d'Akt de la PI3K ce qui augmente la production de glucose hépatique. Finalement, dans une quatrième étude, nous avons déterminé que l'inhibition chronique de mTORCl/S6K1 dans les cellules L6 ne permet pas de restaurer le transport du glucose stimulé par l'insuline en présence d'un excès de nutriments. L'ensemble de nos études démontre le rôle important joué par la voie de signalisation mTORCl/S6K1 sur le contrôle du métabolisme du glucose et des lipides et limite l'inhibition chronique de mTOR comme cible thérapeutique pour le traitement du diabète de type 2 et de l'obésité.