La phosphorylation de protéines correspond à l’addition covalente d’un groupement phosphate (PO4 3-) par une protéine kinase sur un substrat. Cette réaction est réversible : la déphosphorylation est catalysée par des protéines phosphatases. Chez S. aureus, la sérine/thréonine kinase Stk1 phosphoryle des acides aminés sérines et thréonines et a été montrée impliquée dans la régulation de la virulence du pathogène : nous avons approfondi les connaissances sur ce mécanisme en identifiant trois nouveaux substrats et en étudiant les effets de la phosphorylation sur leur activité : - l’enzyme LuxS, responsable de la synthèse de l’AI-2 impliqué dans la communication intra bactérienne, voit son activité enzymatique drastiquement diminuée en étant phosphorylée par Stk1 sur un site thréonine unique (T14) ; - le régulateur CcpA, dont la fixation sur l’ADN module l’expression de nombreux gènes de virulence, est phosphorylée par Stk1 sur deux sites (T18 et T33) et cette phosphorylation diminue l’affinité de la protéine régulatrice CcpA pour l’ADN de ses gènes cibles ; - l’élément réponse du système à deux composants SaeR est phosphorylé sur deux sites thréonines (T87 et T192) de la région impliquée dans l’affinité de SaeR pour l’ADN. Les rôles de la kinase Stk1 sont donc multiples et liés à la régulation de la virulence de S. aureus. Les autres voies mettant en jeu la phosphorylation de protéines bactériennes, comme les systèmes à deux composants ou le système CcpA/HPr, sont couplées à cette phosphorylation par la sérine/thréonine kinase : ces résultats soulignent à la fois la diversité et la complexité de la régulation des mécanismes responsables de la virulence de S. aureus / Protein phosphorylation consists in the catalyzed addition of a phosphate group on a substrate. This reversible reaction is ensured by both kinase and phosphatase proteins. S. aureus is a human prokaryote pathogen and a part of its virulence is known to be regulated by the serine/threonine kinase Stk1, which phosphorylates serine or threonine residues of its substrates. We investigated the mechanisms of this virulence regulation and newly identified three substrates of Stk1: the quorumsensing LuxS protein, the catabolite carbon protein CcpA and the two components system response element SaeR. LuxS is phosphorylated on a unique threonine residue in position 14 and phosphorylation dramatically influences its enzymatic activity on AI-2 production. CcpA phosphorylation on two threonine residues in the DNA-binding region of the protein (T18 and T33) decreases the affinity of the protein for its targeted DNA sequences. Besides, Stk1 also phosphorylates the response element SaeR on two threonine residues (T87 and T192) in the DNAbinding region. Therefore Stk1 kinase plays numerous roles in S. aureus virulence regulation and the complexity of this regulation pattern increases when considering that three of the phosphorylation pathways in prokaryotes are crossed over: the two components system phosphorylation, the HPr/HPrK system and the serine/threonine kinase proteins phosphorylation. These results highlight the need to focus on Stk1 as a key element in the complexity of virulence regulation in S. aureus

Les réactions de phosphorylation / déphosphorylation chez les bactéries régulent plusieurs fonctions cellulaires telles que croissance, différenciation, pathogénie, résistance aux antibiotiques, réponse au stress, formation des biofilms ainsi que plusieurs processus impliqués dans le métabolisme secondaire. Cependant, les signaux qui déclenchent la cascade de signalisation par phosphorylation/déphosphorylation intracellulaire restent encore peu connus. Staphylococcus aureus est une bactérie à Gram-positif pathogène pour l‟homme. Elle est l‟une des principales causes des infections nosocomiales et ce pathogène opportuniste est capable de provoquer de multiples infections allant du furoncle à la septicémie. Nos études se sont basées sur la caractérisation aux niveaux structural et fonctionnel de deux protéines de cette bactérie : une sérine/thréonine kinase nommée Stk1 ainsi que l‟un de ses substrats, la triose phosphate isomérase. Stk1 a déjà été identifiée comme responsable de la phosphorylation de plusieurs enzymes impliquées dans le métabolisme central de la bactérie ainsi que dans les phénomènes de virulence et de résistance à l‟antibiotique phosphomycine. Cependant, à ce jour, aucune caractérisation structurale n‟a été conduite sur cette kinase. Nous avons ainsi mené une étude cristallographique de plusieurs domaines de cette protéine et nous présentons, plus particulièrement, la structure de trois domaines extracellulaires dits « PASTA », ainsi qu‟un modèle tridimensionnel de la protéine entière. Les domaines PASTA sont spécifiques des Ser/Thr kinases et des Penicillin-Binding Proteins et sont impliqués dans la synthèse du peptidoglycane. Par conséquent, la connaissance de la structure de ces domaines chez Stk1 pourrait servir de base à la conception rationnelle de nouveaux inhibiteurs à visée thérapeutique. Enfin, nous avons démontré que l‟activité de l‟un des substrats de Stk1, la triose phosphate isomérase, était régulée par phosphorylation / déphosphorylation, et nous avons décrit le mécanisme qui contrôle son activation/inactivation réversible. / The phosphorylation /dephosphorylation reactions in bacteria regulate various cellular functions such as growth, differentiation, pathogenicity, antibiotic resistance, stress response, biofilm formation as well as several processes involved in secondary metabolism. However, detailed understanding of their complete signaling pathways induced by phosphorylation/dephosphorylation is still unclear. Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium and a human pathogen. It is one of the primary causes of nosocomial infections and this opportunist pathogen is able to cause multiple infections ranging from furuncle to septicemia. This study is focused on the structural and functional characterizations of two proteins from this bacterium: the serine/threonine kinase Stk1 and one of its substrates, the triose phosphate isomerase. Stk1 has been previously identified as responsible for the phosphorylation of several enzymes involved in the central metabolism of this bacterium as well as virulence and resistance to the antibiotic phosphomycin. However, no structural characterization has been done to date. We have performed a crystallographic study of several domains of this protein. We now present the structure of three extracellular domains designated “PASTA” in addition to the 3D molecular model of the entire protein. PASTA domains are specific to bacterial Ser/Thr kinases and to Penicillin-Binding Proteins which are involved in the peptidoglycan synthesis. Thus, the structural knowledge of PASTA domains from Stk1 could be of particular interest in the rational drug-design of new inhibitors with therapeutic aims. Finally, we have demonstrated that triose phosphate isomerase activity is regulated by phosphorylation/dephosphorylation and we have described the reversible activation/inactivation mechanism.

La neurodégénérescence fait partie intégrante de la maladie de Huntington (MH) dont les premiers symptômes moteurs et cognitifs apparaissent vers l’âge de 30 à 40 ans. Cette maladie incurable est causée par une mutation dans le gène codant pour la protéine huntingtin (htt). L’activation de la caspase-6 (casp6) est observée au stade présymptomatique chez l’humain et les modèles murins MH faisant de la casp6 un joueur majeur dans la neurodégénérescence précoce associé à la MH. De plus, le clivage de htt mutant par la casp6 produit un fragment N-terminal neurotoxique essentielle au développement de la MH. Des résultats préliminaires ont permis de révéler l’interaction et le clivage des protéines proapoptotiques Serine/Threonine Kinase 3 (STK3), Death-Domain Associated Protein (DAXX) par la casp6. Des effets proapoptotiques sont associés à leurs fragments et leur production par les caspases pourrait influencer la neurodégénérescence observée dans diverses maladies neurodégénératives et dans le vieillissement normal. Nos résultats dans les souris C57Bl/6 démontrent que l’expression de DAXX varie fortement avec l’âge selon l’organe analysé. Ses divers fragments ne suivent pas la même tendance d’un organe à l’autre suggérant des fonctions différentielles à travers l’organisme et une importante régulation de ses fonctions par des modifications post-traductionnelles. Chez les modèles murins de la MH, les souris YAC128, nous avons constaté une augmentation des fragments à 65 et 70 kDa dans le cortex et une diminution de DAXX entier et du fragment à 70 kDa dans le cervelet soulignant la possibilité de fonctions spécifiques selon les régions cérébrales. Nous avons aussi démontré pour la première fois le clivage de STK3 par la caspase-7 et la production différentielle de fragments par les caspase-3, 6 et 7. L’expression protéique de STK3 augmente globalement à travers l’organisme avec l’âge et dans le cervelet des souris YAC128. Par contre, une diminution de l’expression de STK3 est observée dans le cortex des individus atteints de la MH et des souris YAC128. Finalement, par l’induction de différents stress cellulaires, nous avons constaté la présence d’un mécanisme adaptatif des neurones modèles de la MH impliquant STK3. En conclusion, l’expression de DAXX et STK3 varie avec l’âge à travers l’organisme et est altérée dans la maladie de Huntington. Plus particulièrement, STK3semble être impliqué dans un mécanisme protégeant les neurones de la mort cellulaire dans la MH.

La bactérie pathogène, Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque), produit une sérinethréonine-kinase membranaire, StkP, et une tyrosine-kinase, CpsD, qui sont respectivement des régulateurs importants de la division cellulaire et de la synthèse de la capsule polysaccharidique. Ces observations ont été directement la base de mon projet de thèse. Au cours de mon étude, j'ai participé à la mise en évidence du mécanisme par lequel CpsD coordonne la synthèse de la capsule polysaccharidique avec le cycle cellulaire du pneumocoque, en contrôlant via son autophosphorylation la mobilité de la protéine ParB de la ségrégation du chromosome. Pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire sous jacent, j'ai caractérisé un nouveau partenaire de CpsD et de ParB appelé RocS. J'ai montré que cette protéine est indispensable pour la ségrégation du chromosome. J'ai ensuite identifié que CpsD et RocS constituent un nouveau mécanisme de protection du nucléoïde, qui était jusque-là inconnu chez le pneumocoque. D'autre part, j'ai contribué à la caractérisation du rôle des sousdomaines PASTA du domaine extracellulaire de StkP dans la régulation de l'épaisseur de la paroi cellulaire septale ainsi que dans le degré d'activation de StkP. Plus particulièrement j'ai mis en évidence que le quatrième sous-domaine PASTA de StkP contrôle la fonction de l'hydrolase de la paroi cellulaire LytB, qui est nécessaire pour les étapes finales de la division cellulaire. Mon travail suggère donc l'existence de réseaux de régulation interconnectés du cycle cellulaire du pneumocoque impliquant ces deux protéine-kinases / The pathogenic bacterium, Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus), produces a membrane serine threonine kinase, StkP, and a tyrosine kinase, CpsD, which are important regulators of cell division and polysaccharide capsule synthesis, respectively. These observations were directly at the basis of my thesis project. During my thesis, I participated in the identification of the mechanism by which CpsD coordinates the synthesis of the polysaccharide capsule with the cell cycle of the pneumococcus. Indeed, CpsD autophosphorylation controls the mobility of the chromosome partioning protein ParB protein of the chromosome segregation. To better understand the underlying molecular mechanism, I characterized a new CpsD and ParB partner that we called RocS. I showed that this protein is required for chromosome segregation. I also identified that CpsD and RocS form an atypical nucloied occlusion system, which was previously unknown in pneumococcus. On the other hand, I have contributed to the characterization of the role of the PASTA sub-domains of the StkP extracellular domain in the regulation of the septal cell wall thickness as well as in the degree of activation of StkP. More specifically I showed that the fourth PASTA sub domain of StkP controls the function of the cell wall hydrolase LytB, which is required for the final steps of cell division. My work therefore suggests the existence of interconnected regulation networks of the pneumococcal cell cycle and involving these two protein kinases

Bacillus subtilis est la bactérie modèle des bactéries Gram-positif à bas pourcentage en GC et possède un intérêt marqué en biotechnologie. Par ailleurs, la phosphorylation des protéines est un mécanisme de régulation essentiel chez les bactéries qui reste encore largement à explorer. B. subtilis possède plusieurs ser/thr kinases potentielles (PrkA, YbdM, YabT et PrkC, qui a été déjà largement caractérisée), mais très peu de substrats de ces kinases ont été mis en évidence. Récemment, des études phosphoprotéomiques ont permis d’identifier de nombreux peptides phosphorylés sur des sérines ou des thréonines chez B. subtilis, incluant: a) deux régulateurs globaux de la phase de transition, DegS et AbrB et b) RecA, qui joue un rôle essentiel dans la réparation des cassures double-brin de l’ADN et la recombinaison. Des tests de phosphorylation in vitro nous ont permis d’identifier les ser/thr kinases capables de phosphoryler DegS, RecA et AbrB. La phosphorylation de DegS sur son résidu sérine 76 par la kinase YbdM influence, in vitro et in vivo, son activité kinase vis à vis de son substrat DegU. L’expression chez B. subtilis d’un allèle codant la protéine DegS-S76D (la sérine étant remplacée par un aspartate phosphomimétique) perturbe l’ensemble des processi cellulaires régulés par le système à deux composants DegS/DegU. Ces résultats suggèrent un lien entre la phosphorylation de DegS sur sa sérine 78 et le niveau de phosphorylation de son substrat DegU, cette modification post-traductionnelle représentant un degré supplémentaire de régulation pour ce système à deux composants. Au cours du démarrage de la sporulation, B. subtilis exprime une ser/thr kinase atypique, YabT, qui localise au septum et est activée grâce à la liaison de séquences ADN non spécifiques. YabT activée phosphoryle RecA sur sa sérine 2, ce qui induit la formation de foci RecA. Dans une souche exprimant une protéine RecA non phosphorylable (RecA-S2A) ou inactivée pour yabT, la formation de spores en présence de lésions de l’ADN est diminuée. Ces résultats suggèrent une homologie fonctionnelle au cours du développement entre la phosphorylation de RecA chez B. subtilis et la phosphorylation de son homologue eukaryote Rad51, qui permet leur recrutement sur des lésions de l’ADN. Nous proposons donc que la phosphorylation de RecA serve de signal pour promouvoir la formation de foci au cours de la sporulation. In vitro, le régulateur transcriptionnel AbrB est phosphorylé par les kinases YabT, YbdM et PrkC, L’utilisation de protéines mutées AbrB-S86A (non phosphorylable) et AbrB-S86D (forme phosphomimétique) nous a permis de montrer que la phosphorylation d’AbrB diminue son affinité pour l’ADN cible. L’expression chez B. subtilis des protéines AbrB-S86A et –S86D perturbe des phénomènes mis en place au cours de la phase stationnaire comme la production d’exoprotéases, la compétence et la sporulation via la dérégulation des gènes et opérons AbrB-dépendants correspondants. Nous proposons donc que la phosphorylation d’AbrB par les Hanks-kinases constitue un mécanisme de contrôle supplémentaire nécessaire à l’inactivation de ce régulateur transcriptionnel, qui peut être activateur ou répresseur, pendant la phase de transition. / Bacillus subtilis is the model organism for low GC Gram-positive bacteria and is of great biotechnological interest. Protein phosphorylation is an important regulatory mechanism in bacteria and it has not been extensively studied yet. Recent site-specific phosphoproteomic studies identified a large number of novel serine/threonine phosphorylation sites in B. subtilis, including a) two transition phase global gene regulators DegS and AbrB and b) RecA, that plays a major role in double-strand break repair and DNA recombination. .B. subtilis disposes of several putative Ser/Thr kinases like PrkA, YbdM, YabT and a characterizd kinase PrkC, but very few physiological substrates for these have been defined so far. In vitro phosphorylation assays were used to identify which of these kinases were able to phosphorylate DegS, RecA and AbrB. DegS phosphorylation on serine 76 by the kinase YbdM influenced its activity towards DegU both in vitro and in vivo, and expression of DegS S76D( on replacing serine to aspartate) in B. subtilis perturbed cellular processes regulated by the DegS/DegU two component system. This suggests a link between DegS phosphorylation at serine 76 and the level of DegU phosphorylation, establishing this post-translational modification as an additional trigger for this two-component system. At the onset of sporulation, B. subtilis expresses an unusual serine/threonine kinase YabT, which exhibits a septal localization and is activated by non-sequence-specific DNA binding. Activated YabT phosphorylates RecA at the residue serine 2, which in turn promotes the formation of RecA foci at the onset of spore development. On the other hand, non-phosphorylatable RecA or inactivated YabT lead to reduced spore formation in the presence of DNA lesions . This suggests a functional similarity between B. subtilis developmental stage dependent RecA phosphorylation and its eukaryal homologous Rad51 phosphorylation, which leads to its recruitment to the lesion sites. We therefore proposed that RecA phosphorylation serves as an additional signal mechanism that promotes focus formation during spore development. AbrB is phosphorylated by YabT, YbdM and PrkC in vitro and AbrB phosphorylation leads to reduced affinity for its target DNA and abolished binding cooperativity in vitro and in vivo. Expression of the phosphomimetic AbrB-S86D or of the non-phosphorylatable AbrB-S86A mutant protein in B. subtilis disturbed some stationary phase phenomena such as exoprotease production, competence and the onset of sporulation, probably by deregulation of AbrB-target genes and operons. We therefore, proposed that AbrB phosphorylation as an additional regulatory mechanism needed to switch off this ambiactive gene regulator during the transition phase.