Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur. / Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La prévalence de Streptococcus suis, notamment du sérotype 2, à l’échelle mondiale pose de grands problèmes à l’industrie porcine ainsi qu’à la santé publique. La compréhension des mécanismes immunitaires permettant alors de lutter contre cette bactérie devient un atout majeur dans le développement des vaccins. S. suis dispose cependant d’un puissant arsenal pour contrer ces mécanismes. Enveloppé d’une capsule polysaccharidique (CPS), cette bactérie résiste à la phagocytose, à moins que certaines cellules soient en mesure de produire des anticorps opsonisants. Par chance, au sein de la rate, en périphérie du follicule, une zone nommée la « zone marginale » regroupe des lymphocytes B spécialisés dans la réponse aux bactéries encapsulées et aux antigènes polysaccharidiques. Ceci sans l’intervention des lymphocytes T auxiliaires, contrairement aux lymphocytes B se trouvant à l’intérieur du follicule, qui interviennent dans une réponse plus dirigée contre des antigènes protéiques. L’objectif général de ce mémoire est donc l’étude de la réponse anticorps dite « extrafolliculaire » que les LB-MZ sont suspectés d’orchestrer lors d’une infection à S. suis. En premier lieu nous avons déterminé la cinétique de différentiation en plasmocytes des LB-MZ (LB-MZ) lors de l’infection par S. suis. Puis nous avons étudié la fonctionnalité et le type d’anticorps produits par ces LB-MZ. Les présents travaux ont démontré toute l’importance des LB-MZ dans l’élimination de la bactérie ou dans le ralentissement de sa dissémination systémique durant les premiers stades de l’infection, notamment grâce à un environnement propice à la différenciation en plasmocytes. Les principaux anticorps produits à cet effet étaient de classe IgM et dirigés contre des antigènes de la CPS. Nos résultats éclairent un peu plus la voie, et permettent d’imaginer des options pour le développement des vaccins qui activeraient spécifiquement cette réponse extrafolliculaire efficace. / The worldwide prevalence of Streptococcus suis, particularly serotype 2, poses major problems for the pig industry and public health. Understanding the immune mechanisms involved in combating this bacterium is becoming a major asset in the development of vaccines. However, S. suis has a powerful arsenal at its disposal to counter these mechanisms. Enveloped in a polysaccharide capsule (CPS), this bacterium resists phagocytosis unless certain cells can produce opsonising antibodies. Fortunately, within the spleen, at the periphery of the follicle, a zone known as the "marginal zone" contains B lymphocytes specialised in responding to encapsulated bacteria and polysaccharide antigens. This is without the intervention of T helper lymphocytes, unlike the B lymphocytes inside the follicle, which are involved in a response more directed against protein antigens. The general objective of this thesis is therefore to study the so-called 'extrafollicular' antibody response that LB-MZ are thought to orchestrate during S. suis infection. We first determined the kinetics of LB-MZ differentiation into plasma cells during S. suis infection. We then studied the functionality and type of antibodies produced by these LB-MZs. This work has demonstrated the importance of LB-MZ in eliminating the bacterium or slowing down its systemic dissemination during the early stages of infection, thanks to an environment conducive to differentiation into plasma cells. The main antibodies produced for this purpose were IgM class antibodies directed against CPS antigens. Our results shed a little more light on the pathway, and allow us to imagine options for the development of vaccines that would specifically activate this effective extrafollicular response.

Streptococcus suis est un pathogène porcin et un agent de zoonose en émergence causant des maladies invasives graves. Lorsque la bactérie envahit l’hôte et se retrouve dans le sang, des neutrophiles se mobilisent rapidement pour tenter d’éliminer la menace grâce à de nombreux mécanismes anti-microbiens. Ces cellules sont régulées par le granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) produit lors de l’infection. Il pourrait être un acteur clé du contrôle de l’infection par S. suis mais rien n’est connu sur la production et le rôle du G-CSF dans les infections à S. suis. De plus, le recrutement et l’activation des neutrophiles demeurent peu documentés. L’hypothèse de ce projet est que S. suis induit la production du G-CSF par les cellules de l’immunité innée suite à l’infection, et que le facteur module le recrutement et l’activation des neutrophiles. Cependant, S. suis limite l’activation des cellules immunitaires et se soustrait à l’élimination par les neutrophiles grâce à ses facteurs de virulence. Le 1er objectif consistait à caractériser le recrutement et l’activation des neutrophiles en réponse à S. suis dans un modèle d’infection murin (souris C57BL/6). Nous avons démontré que S. suis cause une mobilisation rapide des neutrophiles de la moelle osseuse vers le sang et la rate. Dans le sang, les neutrophiles présentent un phénotype activé. En parallèle, l’infection cause une élévation spectaculaire du G-CSF systémique, selon un patron similaire à celui des neutrophiles, suggérant un rôle du facteur dans la mobilisation de ces cellules. Le 2e objectif visait à comprendre les mécanismes moléculaires de production de G-CSF. Nous avons donc quantifié le G-CSF produit par différentes cellules immunitaires primaires de souris et démontré que les cellules dendritiques et les macrophages produisent du G-CSF en réponse à S. suis. Les cellules reconnaissent la bactérie par l’intermédiaire de leur Toll-like receptor (TLR) 2 et de récepteurs intracellulaires, ce qui engage des voies de signalisation clés pour la production de médiateurs pro-inflammatoires. Le 3e objectif consistait à élucider le rôle du G-CSF dans le recrutement et l’activation des neutrophiles lors de l’infection par S. suis, et les conséquences sur la pathogenèse. Dans unmodèle d’infection murin, nous avons démontré que le G-CSF cause la sortie des neutrophiles de la moelle osseuse vers le sang, sans que cela augmente l’élimination de la bactérie et la réponse inflammatoire. In vitro, S. suis active peu les neutrophiles porcins, et le G-CSF ne permet pas d’augmenter leurs fonctions. Le 4e objectif avait pour but de déterminer si certains facteurs bactériens de S. suis modulent la production de G-CSF et l’activation des neutrophiles. En utilisant des mutants et des composants bactériens purifiés, nous avons démontré que pour produire le G-CSF, les cellules dendritiques et les macrophages murins reconnaissent les lipoprotéines de S. suis. Cependant, celles-ci sont partiellement masquées par la capsule qui entoure la bactérie, limitant la production de la cytokine. De la même manière, la capsule gêne l’activation optimale des neutrophiles porcins ce qui empêche leur effet bactéricide. Une meilleure compréhension de la pathogenèse des infections à S. suis pourrait orienter de nouvelles stratégies thérapeutiques en lien avec les neutrophiles pour lutter contre la bactérie. Par exemple, le G-CSF couplé à des d’autres immunomodulateurs pourra être envisagé comme traitement métaphylactique dans les élevages porcins pour prévenir d’éventuelles éclosions. / Streptococcus suis is a porcine pathogen and an emerging zoonotic agent causing severe invasive diseases. When the bacterium invades the host and enters the bloodstream, neutrophils quickly mobilize to try to eliminate the threat through various antimicrobial mechanisms. These cells are regulated by granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), which is produced during the infection. It could be a key player in controlling S. suis infection, but nothing is known about the production and role of G-CSF in S. suis infections. Furthermore, neutrophil recruitment and activation remain poorly documented. The hypothesis of this project is that S. suis induces G-CSF production by innate immune cells following infection, and the factor modulates the recruitment and activation of neutrophils. Nevertheless, S. suis prevents immune cells activation and evades elimination by neutrophils due to its virulence factors. The first objective was to characterize the recruitment and activation of neutrophils in response to S. suis in a murine infection model (C57BL/6). We demonstrated that S. suis infection causes a rapid release of neutrophils from the bone marrow to the blood and spleen. In the blood, neutrophils exhibit an activated phenotype. Simultaneously, the infection causes a dramatic increase in systemic G-CSF, following a pattern similar to that of neutrophils, suggesting a role for the factor in the mobilization of these cells. The second objective aimed to understand the molecular mechanisms of G-CSF production. We quantified G-CSF produced by different primary mouse immune cells and showed that dendritic cells and macrophages produce G-CSF in response to S. suis. Cells recognize the bacterium through their Toll-like receptor (TLR) 2 and intracellular receptors, engaging key signaling pathways for pro-inflammatory mediator production. The third objective was to elucidate the role of G-CSF in the recruitment and activation of neutrophils during S. suis infection, and its consequences for pathogenesis. In a murine model, we demonstrated that G-CSF causes the release of neutrophils from the bone marrow into the blood, without increasing bacterial clearance and inflammatory response. In vitro, S. suis weakly activates porcine neutrophils, and G-CSF does not enhance the cellular functions. The fourth objective aimed to determine if certain bacterial factors of S. suis modulate G-CSF production and neutrophil activation. Using mutants and purified bacterial components, we demonstrated that dendritic cells and murine macrophages recognize S. suis lipoproteins to produce G-CSF. However, these lipoproteins are partially masked by the bacterium's capsule, limiting cytokine production. Similarly, the capsule hinders optimal activation of porcine neutrophils, preventing their bactericidal effect. A better understanding of the pathogenesis of S. suis infections could guide new therapeutic strategies related to neutrophils to combat the bacterium. For example, G-CSF combined with other immunomodulators could be considered as a metaphylactic treatment in pig farming to prevent potential outbreaks.

La bactérie pathogène, Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque), produit une sérinethréonine-kinase membranaire, StkP, et une tyrosine-kinase, CpsD, qui sont respectivement des régulateurs importants de la division cellulaire et de la synthèse de la capsule polysaccharidique. Ces observations ont été directement la base de mon projet de thèse. Au cours de mon étude, j'ai participé à la mise en évidence du mécanisme par lequel CpsD coordonne la synthèse de la capsule polysaccharidique avec le cycle cellulaire du pneumocoque, en contrôlant via son autophosphorylation la mobilité de la protéine ParB de la ségrégation du chromosome. Pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire sous jacent, j'ai caractérisé un nouveau partenaire de CpsD et de ParB appelé RocS. J'ai montré que cette protéine est indispensable pour la ségrégation du chromosome. J'ai ensuite identifié que CpsD et RocS constituent un nouveau mécanisme de protection du nucléoïde, qui était jusque-là inconnu chez le pneumocoque. D'autre part, j'ai contribué à la caractérisation du rôle des sousdomaines PASTA du domaine extracellulaire de StkP dans la régulation de l'épaisseur de la paroi cellulaire septale ainsi que dans le degré d'activation de StkP. Plus particulièrement j'ai mis en évidence que le quatrième sous-domaine PASTA de StkP contrôle la fonction de l'hydrolase de la paroi cellulaire LytB, qui est nécessaire pour les étapes finales de la division cellulaire. Mon travail suggère donc l'existence de réseaux de régulation interconnectés du cycle cellulaire du pneumocoque impliquant ces deux protéine-kinases / The pathogenic bacterium, Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus), produces a membrane serine threonine kinase, StkP, and a tyrosine kinase, CpsD, which are important regulators of cell division and polysaccharide capsule synthesis, respectively. These observations were directly at the basis of my thesis project. During my thesis, I participated in the identification of the mechanism by which CpsD coordinates the synthesis of the polysaccharide capsule with the cell cycle of the pneumococcus. Indeed, CpsD autophosphorylation controls the mobility of the chromosome partioning protein ParB protein of the chromosome segregation. To better understand the underlying molecular mechanism, I characterized a new CpsD and ParB partner that we called RocS. I showed that this protein is required for chromosome segregation. I also identified that CpsD and RocS form an atypical nucloied occlusion system, which was previously unknown in pneumococcus. On the other hand, I have contributed to the characterization of the role of the PASTA sub-domains of the StkP extracellular domain in the regulation of the septal cell wall thickness as well as in the degree of activation of StkP. More specifically I showed that the fourth PASTA sub domain of StkP controls the function of the cell wall hydrolase LytB, which is required for the final steps of cell division. My work therefore suggests the existence of interconnected regulation networks of the pneumococcal cell cycle and involving these two protein kinases

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Streptococcus suis et Streptococcus du groupe B (GBS) sont deux bactéries encapsulées qui induisent des pathologies similaires chez l’homme et/ou l’animal, incluant septicémies et méningites. La capsule polysaccharidique (CPS) est un facteur de virulence clé de ces deux pathogènes et les anticorps (Ac) anti-CPS présentent un bon potentiel protecteur. Néanmoins, ces molécules sont faiblement immunogéniques et les mécanismes de la génération de la réponse humorale anti-CPS demeurent méconnus. L’objectif principal de cette thèse était d’évaluer les caractéristiques et les mécanismes du développement de la réponse Ac dirigée spécifiquement contre les CPS de S. suis et GBS, ainsi que l’effet de la biochimie de la CPS dans cette réponse. Nous avons étudié S. suis types 2 et 14 et GBS types III et V, dont les CPS présentent plusieurs similarités dans leurs compositions et leurs structures, incluant la présence d’acide sialique, un sucre potentiellement immunosuppresseur, tout en possédant une antigénicité propre. Nous avons tout d’abord analysé la nature de la réponse Ac anti-CPS sérique face à la bactérie entière. Les souris infectées par S. suis développent une réponse très faible (S. suis type 2) voire insignifiante (S. suis type 14) de profil isotypique restreint à l’IgM et sont incapables de monter une réponse mémoire efficace face à une seconde infection. Un profil similaire est obtenu chez le porc infecté par S. suis type 2. On détecte des titres d’IgM anti-CPS significatifs chez les souris infectées par GBS (type III ou V). Toutefois, la magnitude de la réponse reste globalement faible et aucune commutation de classe n’est observée. Nous avons ensuite examiné l’influence de la biochimie de la CPS sur ces profils de réponse en conduisant des expériences avec la CPS hautement purifiée de ces pathogènes. Tandis que la CPS de GBS type III administrée aux souris conserve des propriétés immunogéniques similaires à celles observées durant l’infection par la bactérie intacte, les CPS de S. suis type 2 et GBS type V perdent toute capacité à induire une réponse Ac spécifique. L’analyse de l’interaction in vitro des CPS avec les cellules dendritiques (DC) murines, des acteurs clés dans la détection des pathogènes et l’orchestration des réponses immunitaires subséquentes, révèle que ces molécules stimulent la production de niveaux conséquents de chémokines via différents récepteurs. Néanmoins, les CPS sont inaptes à induire la sécrétion de cytokines et elles interfèrent avec la capacité des DC à exprimer BAFF, une cytokine clé dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. L’utilisation de CPS chimiquement désialylées démontre que l’acide sialique ne joue aucun rôle immunosuppresseur majeur dans le développement de la réponse Ac dirigée contre les CPS purifiées de S. suis ou GBS, ni sur l’interaction des CPS avec les DC in vitro, ni sur profil de la réponse in vivo. D’autres propriétés biochimiques intrinsèques à ces CPS seraient responsables de l’inaptitude de l’hôte infecté à monter une réponse Ac adéquate et les identifier constituera un outil précieux pour une meilleure compréhension de l’immunopathogénèse de S. suis et GBS ainsi que pour développer des moyens de lutte efficaces contre ces bactéries. / Streptococcus suis and Group B Streptococcus (GBS) are two encapsulated bacteria that induce similar pathologies in humans and/or animals, including septicemia and meningitis. The capsular polysaccharide (CPS) is a major virulence factor for both pathogens and CPS-specific antibodies (Ab) display a good protective potential. However, CPSs are weak immunogenic molecules and the mechanisms of the generation of the CPS-specific humoral response remain poorly known. Thus, the main objective of this thesis was to evaluate the characteristics and the mechanisms of the development of the Ab response directed against S. suis and GBS CPSs, as well as the influence of the biochemistry of the CPS on this response. We worked with S. suis types 2 and 14 and GBS types III and V, whose CPSs present several similarities in their compositions and structures, including the presence of sialic acid, a potentially immunosuppressive sugar, while being very distinct antigens. Initially, we analyzed the features of the CPS-specific serum Ab response to whole bacteria. S. suis-infected mice developed a very low (S. suis type 2) to undetectable (S. suis type 14) response restricted to the IgM isotype, and were unable to mount an efficient memory response after a secondary infection. A similar profile of response was obtained in S. suis type 2-infected pigs. We detected significant CPS-specific IgM titers in GBS-infected mice (type III or V). Nonetheless, the magnitude of the response remained globally low and no isotype switching was observed. Then, we examined the influence of the biochemistry of the CPS on these response profiles by conducting experiments with highly purified CPSs from these pathogens. Whereas the purified GBS type III CPS administrated to mice retained similar immunogenic properties as those observed during the infection with the intact bacteria, purified S. suis type 2 and GBS type V CPSs were no longer able to induce a specific Ab response. The analysis of the in vitro interaction between the CPSs and murine dendritic cells (DCs), crucial actors in the detection of pathogens and the orchestration of subsequent immune responses, revealed that these molecules stimulate the production of significant levels of chemokines through different receptors. Nevertheless, CPSs were unable to induce cytokine secretion and interfered with the ability of DCs to express BAFF, a key cytokine for B lymphocyte differentiation into plasma cells. The use of chemically desialylated CPSs demonstrated that sialic acid does not play a major immunosuppressive role in the development of the Ab response specific to purified S. suis or GBS CPSs, neither on the in vitro interaction between CPSs and DCs, nor on the profile of the in vivo response. Other biochemical properties intrinsic to these CPSs would be responsible for the inaptitude of the infected host to mount an adequate Ab response, and their identification will be a precious tool for a better understanding of the immunopathogenesis of S. suis and GBS, as well as for the development of efficient strategies to fight against these bacteria.

Le streptocoque du groupe B (GBS) est un agent causant des septicémies et des méningites chez les nouveaux nés et chez les adultes. Une réaction sérologique dirigée contre la capsule polysaccharidique (CPS) permet de différencier les 10 sérotypes de GBS, dont le sérotype III qui est le plus fréquemment isolé en cas de méningite. Actuellement l’efficacité de l’unique traitement disponible, l’antibioprophylaxie intrapartum, est controversée. Dans l’optique d’élargir les options de prévention, cette étude vise à mieux comprendre les interactions entre GBS III et le développement de la réponse adaptative, sujet qui est peu documenté. Cette étude a évalué, par cytométrie en flux (FACS), les sous-populations des lymphocytes B (LB) spléniques impliquées suite à l’infection systémique de GBS III dans un modèle in vivo. De plus, la réponse humorale contre GBS III et contre la CPS III purifiée ainsi que la formation des centres germinatifs (GCs) spléniques dans un contexte de multiples infections par GBS ont été évalués. Les résultats suggèrent que la première infection stimule la production d’anticorps contre GBS III mais peu contre sa CPS. De plus, GBS III activerait la différenciation des LB et induirait la formation des GCs liée au déclenchement d’une réponse mémoire permettant un meilleur contrôle lors des infections subséquentes. Malgré sa faible immunogénicité, la CPS ne semblerait pas interférer avec le développement de l’immunité adaptative humorale contre la bactérie. La production d’anticorps contre GBS III qui implique la commutation de classe serait principalement produite contre des épitopes différents de ceux composant la CPS III. / Group B Streptococcus (GBS) is an agent of septicemia and meningitis in newborns but also in adults. A serological reaction directed against the polysaccharide capsule (CPS) allows to differentiate 10 GBS serotypes, including serotype III which is the most frequently isolated in cases of meningitis. Currently the effectiveness of the only available treatment, intrapartum antibiotic prophylaxis, is controversial. To improve prevention strategies, this study aims to better understand the interactions between GBS and the development of the adaptive response, a subject that is poorly documented. This study evaluated, by flow cytometry (FACS), the splenic subpopulations of B lymphocytes (LB) involved following systemic GBS infection in an in vivo model. This study also evaluated the serum anti-GBS antibody response and against its purified capsule as well as the formation of splenic germinal centers (GCs) in the context of multiple GBS infections. Results suggest that the first infection stimulates the production of antibodies against GBS III but little against its capsule. Furthermore, results suggest that GBS activates B cell differentiation by inducing the production of GCs, which are linked to triggering a memory response allowing better control in subsequent infections. Despite its low immunogenicity, the CPS does not appear to interfere with the development of adaptive humoral immunity against the bacteria. Therefore, the production of antibodies against GBS III, involving class switching, would recognize different epitopes from those found on its capsule.