La cohésion des chromatides sœurs est assurée par un complexe protéique en forme d’anneau assurant leur capture topologique. Ce complexe est constitué par des protéines conservées de la levure à l’Homme regroupées sous le terme « cohésine » : Smc1, Smc3 et la phosphoprotéine Scc1 fermant l’anneau (respectivement Psm1, Psm3 et Rad21 chez Schizosaccharomyces pombe). Les protéines régulatrices Rad61-Wapl, Pds5 et Scc3 (Wpl1,Pds5 et Psc3 respectivement chez S. pombe) interagissent avec l’anneau via Scc1. Il a été proposé que la capture de l’ADN par les cohésines nécessite l’ouverture transitoire de l’interface Smc1/Smc3. La réaction de dissociation fait quant à elle intervenir le sous-complexe Wapl/Pds5/Scc3 entraînant vraisemblablement l’ouverture de l’interface Scc1/Smc3. Le mécanisme par lequel la cohésion est créée et celui par lequel Wapl promeut la dissociation des cohésines des chromosomes, sont encore inconnus. Parmi les mutants de cohésion chez Saccharomyces cerevisiae, la mutation thermosensible eco1-1 affecte le gène ECO1 codant une acétyl-transférase, essentielle à la viabilité cellulaire, conservée de la levure à l’Homme (Eco1 « Establishment of Cohesion » chez S. cerevisiae, Eso1 chez S.pombe, ESCO1-2 chez l’Homme) et ayant Smc3 pour substrat. Il a été montré que l’acétyl-transférase s’oppose à l’action de dissociation de Wapl. C’est un crible génétique réalisé par plusieurs équipes, visant à trouver des mutants suppresseurs d’eco1-1, qui a permis d’identifier les gènes codant les protéines Wapl, Pds5, Scc3 et Smc3 comme composants du mécanisme d’ouverture de l’anneau de cohésine. Un crible similaire a été réalisé chez S.pombe dans notre laboratoire, dans le but de trouver des suppresseurs de la mutation thermosensible eso1-H17. Ce crible a identifié les gènes orthologues à ceux trouvés chez la levure : wpl1, pds5, psc3 et psm3 mais aussi le gène codant la sous-unité catalytique du complexe sérine/thréonine phosphatase de type IV (PP4), noté pp4c. Nous avons alors mis en œuvre des expériences pour caractériser PP4c ainsi que sa sous-unité régulatrice Psy2 qui s’est révélée être également impliquée dans la cohésion des chromatides soeurs. Nous avons également identifié la protéine Rad21 comme substrat du complexe PP4, puis identifié les phosphosites potentiellement cibles de PP4, pour ensuite cribler et analyser des phosphomutants de Rad21 récapitulant l’effet suppresseur de la délétion de PP4. / Sister-chromatid cohesion is ensured by a ring shape protein complex which is in charge of their topological embrace. This complex consists of proteins which are conserved from yeast to human and grouped under the term “cohesin”: Smc1, Smc3 and the phosphoprotein Scc1 which closes the ring (respectively Psm1, Psm3 and Rad21 in Schizosaccharomyces pombe). The regulatory proteins Rad61-Wapl, Pds5 and Scc3 (Wpl1,Pds5 and Psc3 respectively in S. pombe) interact with the ring via Scc1. It has been suggested that DNA capture by the cohesin complex involves the transient opening of the Smc1/Smc3 interface. The dissociation reaction involves the sub-complex Wapl/Pds5/Scc3 which likely causes the opening of the Scc1/Smc3 interface. The mechanisms by which cohesion is created and by which Wapl promotes the cohesin dissociation from chromosomes are still unknown. Among the cohesion mutants in Saccharomyces cerevisiae the thermosensitive eco1-1 mutation affects the ECO1 gene encoding an acetyl-transferase essential for cell viability and conserved from yeast to human (Eco1 « Establishment of Cohesion » in S.cerevisiae, Eso1 in S. pombe and ESCO1-2 in human) and whose substrate is Smc3. It has been shown that the acetyl-transferase counteracts the dissociation action of Wapl. A genetic screen carried out by several teams in order to find suppressors of the eco1-1 mutation has led to the identification of the genes encoding the Wapl, Pds5, Scc3 and Smc3 proteins as components of the opening mechanism of the cohesin ring. A similar screen was carried out in S. pombe in our lab to find suppressors of the thermosensitive mutation eso1-H17. This screen identified the orthologous genes to those found in the budding yeast: wpl1,pds5, psc3 and psm3 and also the gene encoding the catalytic subunit of the type 4 serine/threonine phosphatase complex (PP4) named pp4c. We have therefore carried out experiments to characterize PP4c and its regulatory subunit Psy2 which has also been found to be involved in sister-chromatid cohesion. We have likewise identified the Rad21 subunit as a PP4 substrate and identified phosphosites as potential targets of PP4. We have then screened and analyzed Rad21 phosphomutants which were able to mimic the suppressor effect of the deletion of pp4c.

Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque) est un agent pathogène humain responsable de maladies invasives et potentiellement mortelles. Les mécanismes impliqués dans le processus d'invasion restent largement inconnus, mais plusieurs observations suggèrent que les processus de signalisation impliquant la phosphorylation des protéines participeraient au caractère invasif du pneumocoque. Le génome de S. pneumoniae code pour une seule tyrosine-kinase (CpsD) et une seule sérine/thréonine-kinase (StkP). Cette dernière serait notamment impliquée dans la virulence, la compétence et la division cellulaire. Elle représente donc une cible thérapeutique potentielle intéressante pour lutter contre les infections liées au pneumocoque. L'objectif de cette thèse a donc été de caractériser le rôle de cette sérine/thréonine-kinase StkP dans la division cellulaire du pneumocoque. StkP est une protéine transmembranaire qui se caractérise par la présence de motifs structuraux conservés dans son domaine catalytique appelés motifs de Hanks. De plus, StkP possède un domaine extracellulaire composé de la répétition de quatre domaines PASTA (Penicillin-binding protein And Serine/Threonine kinase Associated). Le modèle actuel suggère que ces domaines PASTA seraient capables de fixer des fragments de la paroi cellulaire afin de permettre l'activation de StkP qui se comporterait donc comme un récepteur membranaire permettant de réguler la division cellulaire du pneumocoque. Mes travaux de thèse ont permis de revisiter ce modèle en démontrant que les domaines PASTA ne servent pas uniquement à contrôler l'activité protéine-kinase de StkP mais également à contrôler l'épaisseur de la paroi cellulaire et ainsi permettre la constriction de la cellule. Plus précisément, j'ai démontré que le domaine PASTA distal est spécialisé dans l'interaction avec une hydrolase de la paroi cellulaire alors que les trois autres domaines PASTA sont nécessaires à l'activité kinase de StkP mais également au positionnement du domaine PASTA distal. Ainsi, le domaine extracellulaire de StkP se comporterait comme une règle permettant de définir l'épaisseur de la paroi cellulaire de la bactérie. Ces travaux permettent donc de proposer un nouveau modèle d'activation et de régulation de la division cellulaire par la sérine/thréonine-kinase StkP / Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is one of the most important human pathogens that causes potentially fatal invasive diseases. Mechanisms required for the pneumococcal invasion process remain largely unknown, but several observations suggest that phosphorylation-based signaling processes will be at play in the invasiveness of the pneumococcus. S. pneumoniae encodes only one tyrosine-kinase (CpsD) and one serine/threonine-kinase (StkP). The latter would be involved in virulence, competence, and cell division. StkP represent therefore a promising target to combat pneumococcal infections. My aims were to better understand the role of StkP in pneumococcal cell division. StkP is a transmembrane protein characterized by the presence of a series of conserved structural motifs called Hanks motifs in its catalytic domain. In addition, StkP possesses an extracellular domain composed of the repetition of four PASTA domains (Penicillin-binding protein And Serine/Threonine kinase Associated). The current model proposes that PASTA domains are able to bind cell wall fragments resulting in StkP kinase activation. StkP would thus behave as an authentic kinase receptor regulating cell division. My thesis works has allowed to revisit this model by showing that PASTA domains do not only serve StkP kinase activation. Rather, they contribute to determine the cell wall thickness and govern cell constriction. More precisely, I demonstrated that the distal PASTA domain possesses unique features for the binding of a cell wall hydrolase whereas the other three contributes to StkP kinase activation and the positioning of the distal PASTA domain. Thus, the extracellular domain of StkP acts as a ruler determining the cell wall thickness. This work allows to propose an alternative model of activation and regulation of cell division by the serine/threonine-kinase StkP

Malgré les modèles établis pour certaines bactéries, la morphogenèse de bactéries de formes atypiques est peu comprise. C'est le cas de la bactérie pathogène pour l'homme Streptococcus pneumoniae, ou pneumocoque, qui possède une forme ovo-diplococcale. Cependant, à mon arrivé au laboratoire, il avait été démontré qu'une sérine/thréonine protéine-kinase membranaire appelée StkP était indispensable à la division cellulaire et à la morphogenèse du pneumocoque. L'objectif de ma thèse a ainsi été de caractériser certains substrats de StkP et d'étudier leur rôle, ainsi que l'impact de leur phosphorylation, au cours du processus de division cellulaire. Dans ce contexte, j'ai montré que le substrat DivIVA et son paralogue GpsB coordonnent l'élongation et la division cellulaire du pneumocoque. Ces travaux permettent de proposer un nouveau modèle de morphogenèse du pneumocoque dans lequel la triade StkP/DivIVA/GpsB organise la synthèse de la paroi cellulaire nécessaire à l'élongation et à la division de la cellule. J'ai également mis en évidence que la protéine MapZ interagit avec la paroi cellulaire lors de l'élongation cellulaire afin de marquer de manière permanente le site de division, où elle recrute la protéine FtsZ. Ces travaux ont ainsi permis d'identifier un système inédit de régulation positive du positionnement du site de division chez les bactéries. Enfin, j'ai caractérisé les déterminants moléculaires du positionnement de MapZ au centre de la cellule. S. pneumoniae étant un pathogène humain important, nous pouvons anticiper que nos données pourraient servir de base fondamentale à des projets plus appliqués de lutte contre les infections bactériennes / Despite the established models for some bacteria, the morphogenesis of bacteria with atypical shapes is poorly understood. This is the case of the human pathogen Streptococcus pneumoniae, or pneumococcus, that displays an ovo-diplococcal shape. However, when I joined the lab, it had just been shown that a membrane serine/threonine kinase named StkP was crucial for the cell division and the morphogenesis of the pneumococcus. The goal of my thesis was to characterize the substrates of StkP and to study their function as well as the impact of their phosphorylation in the cell division process. First, I have shown that the substrate DivIVA together with its paralog GpsB coordinate cell elongation and division of the pneumococcus. Based on these observations, we propose a new model of pneumococcal morphogenesis in which the triad StkP/DivIVA/GpsB organizes cell wall synthesis involved in cell elongation and division. In a second part of my work, I have studied another substrate of StkP that was of unknown function and that we named MapZ. I have shown that MapZ interacts with the cell wall during the cell elongation to position at midcell. Then MapZ recruits the cell division protein FtsZ and controls the closure of the Z-ring. This work has uncovered a new mechanism of positive regulation for the positioning of the division site in bacteria. Finally, I characterized the molecular determinants of MapZ positioning at the division site. S. pneumoniae is an important human pathogen, we can thus anticipate that our work will represent a fundamental base for applied projects in order to develop new strategies against bacterial infections

Bacillus subtilis est la bactérie modèle des bactéries Gram-positif à bas pourcentage en GC et possède un intérêt marqué en biotechnologie. Par ailleurs, la phosphorylation des protéines est un mécanisme de régulation essentiel chez les bactéries qui reste encore largement à explorer. B. subtilis possède plusieurs ser/thr kinases potentielles (PrkA, YbdM, YabT et PrkC, qui a été déjà largement caractérisée), mais très peu de substrats de ces kinases ont été mis en évidence. Récemment, des études phosphoprotéomiques ont permis d’identifier de nombreux peptides phosphorylés sur des sérines ou des thréonines chez B. subtilis, incluant: a) deux régulateurs globaux de la phase de transition, DegS et AbrB et b) RecA, qui joue un rôle essentiel dans la réparation des cassures double-brin de l’ADN et la recombinaison. Des tests de phosphorylation in vitro nous ont permis d’identifier les ser/thr kinases capables de phosphoryler DegS, RecA et AbrB. La phosphorylation de DegS sur son résidu sérine 76 par la kinase YbdM influence, in vitro et in vivo, son activité kinase vis à vis de son substrat DegU. L’expression chez B. subtilis d’un allèle codant la protéine DegS-S76D (la sérine étant remplacée par un aspartate phosphomimétique) perturbe l’ensemble des processi cellulaires régulés par le système à deux composants DegS/DegU. Ces résultats suggèrent un lien entre la phosphorylation de DegS sur sa sérine 78 et le niveau de phosphorylation de son substrat DegU, cette modification post-traductionnelle représentant un degré supplémentaire de régulation pour ce système à deux composants. Au cours du démarrage de la sporulation, B. subtilis exprime une ser/thr kinase atypique, YabT, qui localise au septum et est activée grâce à la liaison de séquences ADN non spécifiques. YabT activée phosphoryle RecA sur sa sérine 2, ce qui induit la formation de foci RecA. Dans une souche exprimant une protéine RecA non phosphorylable (RecA-S2A) ou inactivée pour yabT, la formation de spores en présence de lésions de l’ADN est diminuée. Ces résultats suggèrent une homologie fonctionnelle au cours du développement entre la phosphorylation de RecA chez B. subtilis et la phosphorylation de son homologue eukaryote Rad51, qui permet leur recrutement sur des lésions de l’ADN. Nous proposons donc que la phosphorylation de RecA serve de signal pour promouvoir la formation de foci au cours de la sporulation. In vitro, le régulateur transcriptionnel AbrB est phosphorylé par les kinases YabT, YbdM et PrkC, L’utilisation de protéines mutées AbrB-S86A (non phosphorylable) et AbrB-S86D (forme phosphomimétique) nous a permis de montrer que la phosphorylation d’AbrB diminue son affinité pour l’ADN cible. L’expression chez B. subtilis des protéines AbrB-S86A et –S86D perturbe des phénomènes mis en place au cours de la phase stationnaire comme la production d’exoprotéases, la compétence et la sporulation via la dérégulation des gènes et opérons AbrB-dépendants correspondants. Nous proposons donc que la phosphorylation d’AbrB par les Hanks-kinases constitue un mécanisme de contrôle supplémentaire nécessaire à l’inactivation de ce régulateur transcriptionnel, qui peut être activateur ou répresseur, pendant la phase de transition. / Bacillus subtilis is the model organism for low GC Gram-positive bacteria and is of great biotechnological interest. Protein phosphorylation is an important regulatory mechanism in bacteria and it has not been extensively studied yet. Recent site-specific phosphoproteomic studies identified a large number of novel serine/threonine phosphorylation sites in B. subtilis, including a) two transition phase global gene regulators DegS and AbrB and b) RecA, that plays a major role in double-strand break repair and DNA recombination. .B. subtilis disposes of several putative Ser/Thr kinases like PrkA, YbdM, YabT and a characterizd kinase PrkC, but very few physiological substrates for these have been defined so far. In vitro phosphorylation assays were used to identify which of these kinases were able to phosphorylate DegS, RecA and AbrB. DegS phosphorylation on serine 76 by the kinase YbdM influenced its activity towards DegU both in vitro and in vivo, and expression of DegS S76D( on replacing serine to aspartate) in B. subtilis perturbed cellular processes regulated by the DegS/DegU two component system. This suggests a link between DegS phosphorylation at serine 76 and the level of DegU phosphorylation, establishing this post-translational modification as an additional trigger for this two-component system. At the onset of sporulation, B. subtilis expresses an unusual serine/threonine kinase YabT, which exhibits a septal localization and is activated by non-sequence-specific DNA binding. Activated YabT phosphorylates RecA at the residue serine 2, which in turn promotes the formation of RecA foci at the onset of spore development. On the other hand, non-phosphorylatable RecA or inactivated YabT lead to reduced spore formation in the presence of DNA lesions . This suggests a functional similarity between B. subtilis developmental stage dependent RecA phosphorylation and its eukaryal homologous Rad51 phosphorylation, which leads to its recruitment to the lesion sites. We therefore proposed that RecA phosphorylation serves as an additional signal mechanism that promotes focus formation during spore development. AbrB is phosphorylated by YabT, YbdM and PrkC in vitro and AbrB phosphorylation leads to reduced affinity for its target DNA and abolished binding cooperativity in vitro and in vivo. Expression of the phosphomimetic AbrB-S86D or of the non-phosphorylatable AbrB-S86A mutant protein in B. subtilis disturbed some stationary phase phenomena such as exoprotease production, competence and the onset of sporulation, probably by deregulation of AbrB-target genes and operons. We therefore, proposed that AbrB phosphorylation as an additional regulatory mechanism needed to switch off this ambiactive gene regulator during the transition phase.