O timo é um dos órgãos linfoides mais acometidos pelas patologias imunodepressoras, o qual geralmente é avaliado quanto ao grau de perda linfocitária a partir de técnicas histológicas subjetivas. Este trabalho teve como propósito a adaptação e aplicação do sistema ADDL (Análise Digital de Depleção Linfóide) em timos, a fim de tornar sua análise mais precisa. Primeiramente, realizou-se um estudo piloto, no qual foram utilizadas amostras de timo do trabalho desenvolvido por Camillotti (2011), porém constatou-se um número insatisfatório de lobos tímicos para os três escores de depleção linfocitária adotados, assim como dificuldade na categorização com apenas 3 graus de lesão. Optou-se, então, pela indução de imunodepressão através da utilização de um glicocorticóide, e pela classificação dos timos em cinco escores (1 a 5). Para tanto, foram utilizados 70 aves de um dia de idade, sendo que aos 21 dias de idade, foram separadas 15 aves para composição do grupo controle e 55 para o grupo tratado. Foi empregado o protocolo de tratamento com dexametasona adaptado de Kong, et al. (2002). Durante as coletas, de cada uma das aves, ambas as cadeias tímicas eram pesadas, sendo selecionados seis lobos para o processamento histológico de rotina, análise quanto ao grau de depleção linfocitária por dois avaliadores (A e B) e submissão a todas as etapas de processamento pelo sistema ADDL. Foram construídas ao final, cinco RNAs (Redes Neurais Artificiais): duas tendo em vista o escore por lobo (escore do avaliador A; escore do avaliador B) e três considerando o escore por ave (moda dos escores de 6 lobos/ave do avaliador A; moda dos escores de 6 lobos/ave do avaliador B, moda conjunta dos escores dos avaliadores A + B). A fim de relacionar o peso relativo (PR) do timo ao escore digital de depleção, foi aplicado o teste de correlação de Spearman, seguido de análise de regressão, e para evidenciar diferenças entre os escores atribuídos pelos avaliadores, utilizou o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney. Constatou-se que o tratamento com dexametasona permitiu a aquisição de timos com escores entre 1 a 5. Houve diferença significativa entre as leituras realizadas pelos avaliadores considerando o lobo e também entre a moda de escores dos dois avaliadores, assim como entre a moda do avaliador B e a moda conjunta (p<0,005). Foi observado que as duas RNAs construídas por lobo obtiveram um percentual de 50% de classificações corretas. As RNAs construídas utilizando a moda mostraram um percentual de acerto de 86,57% para o avaliador A, 80,60% para avaliador B e 94,03% para a rede construída a partir da moda conjunta dos avaliadores. Paralelamente, observou-se ρ= -0,77 e R2=0,58 entre as variáveis “PR” e “Escore digital de depleção linfocitária”. Em conclusão, foi possível a aplicação do sistema ADDL para timos, sendo a RNA treinada com a moda conjunta dos escores dos avaliadores A e B, o modelo que alcançou melhor desempenho. Portanto, o uso de ferramentas de análise de imagem em conjunto com as RNAs, torna possível uma avaliação do sistema imune da ave adotando critérios objetivos para as análises histológicas quanto a perda linfocitária. / The thymus is a lymphoid organs most affected by immunosuppressive diseases, which is usually assessed on the degree of lymphocyte loss from subjective histological techniques. This work aimed to the adaptation and application of the system DALD (Digital Analysis of Lymphoid Depletion) in the thymus in order to make your analysis more accurate. First,a pilot study was performed, in which samples from the thymus of the work of Camillotti (2011) were used, but it was found a number of poor thymic lobes for the three scores lymphocyte depletion adopted, as well as difficulty with categorization only three degrees of injury. It was decided, therefore, by inducing immunosuppression by using a glucocorticoid, and the classification of the five scores thymus (1 to 5). Therefore, 70 birds a day old were used, and at 21 days of age, 15 birds were separated for composition of the control group and 55 in the treated group. A treatment protocol with dexamethasone adapted Kong et al. (2002) was performed. During collection, each of the birds, both chains thymus were weighed, and selected six lobes for histological processing, analysis of the degree of lymphocyte depletion by two raters (A and B) and submission to all stages of DALD processing by the system. At the end of five ANNs (Artificial Neural Networks) were built: two in view of the score by lobe (The score evaluator, the evaluator score B) and three taking the score per bird (mode scores of 6 lobes / bird evaluator The; mode scores of 6 lobes / bird evaluator B, trendy joint scores of evaluators A + B). In order to relate the relative weight (RW) of the thymus to score digital depletion the Spearman correlation test was used, followed by regression analysis, and to highlight differences between the scores assigned by the evaluators used the Wilcoxon- Mann- Whitney test. It was found that treatment with dexamethasone permitted the acquisition of thymus with scores ranging from 1 to 5. Significant difference between the readings made by the evaluators considering the lobe and also between mode scores of two raters, as well as between mode evaluator B and joint mode (p <0.005). It was observed that the two ANNs constructed by lobe obtained a percentage of 50% correct classifications. ANNs built using the fashion shown a percentage of accuracy of 86.57% for the evaluator A, 80.60% to avaliator B and 94,03% for the network constructed from the trendy joint assessors. In parallel, it was noted ρ = -0.77, and R2 = 0.58 between "RW" and "digital lymphoid depletion score". In conclusion, it was possible to apply the system to DALD sweetbreads, and the trained ANN with mode combined scores of raters A and B, the model achieved better performance. Therefore, the use of image analysis tools along with the ANNs makes possible an assessment of the bird's immune system adopting objective criteria for histological analyzes as the lymphocyte loss.

O timo é um órgão de grande importância imunológica durante a vida fetal e no período neonatal, para que o indivíduo se torne imunocompetente. É considerado, anatomicamente, o maior órgão com alta atividade linfopoiética no indivíduo jovem. O timo dos gatos apresenta duas porções, torácica e cervical, onde cada uma delas apresenta um lobo direito e esquerdo em sua maioria. A maior contribuição vascular origina-se da artéria torácica interna esquerda e do tronco braquiocefálico. Possui coloração rósea-pálido, localizado em região de mediastino cranial, entre os pulmões e na base do coração a porção torácica, e a porção cervical estende-se além das costelas em sentido cranial localizada ventralmente a traquéia. Foram utilizados 12 fetos de gatos domésticos, sem raça definida, machos e fêmeas, divididos em três grupos. Os timos foram processados para o estudo da microscopia de luz, e as análises estereológicas foram realizadas utilizando o método disector físico associado com o princípio de ConnEuler. As variações de volume, comprimento, espessura e largura de maneira geral apresentaram aumento conforme o desenvolvimento dos animais, com diferenças entre os sexos. As medidas estereológicas relativas a densidade numérica vascular (Nv(vasc)) apresentam-se maiores nas fêmea, ocorrendo uma diminuição gradativa e o número total de vasos no órgão (N(vasc)) apresentou valores maiores nos machos com uma diminuição gradual. A estimação da densidade do comprimento do vaso (Lv) e da densidade de superfície de área (Sv) apresentaram diminuição aos 45 dias de idade, e a densidade do comprimento do vaso (Lv) apresentou valor maior nos machos de 35 e 55 dias, enquanto que na densidade de superfície de área (Sv) os valores variaram entre os sexos. / During the phoetal life and neonatal period, the thymus has a great importance to became an individual healthy. Anatomically is the largest organ with high limphopoietic activity in young individual. The cat thymus presents two portions, thoracic and cervical, where each one of them presents a right and left lobe at the most. The major contribution initiates from the inner thoracic artery and from braquicephalicus trunk. The organ presents pink-pale color, located in region of cranial mediastine, between lungs and at the base of the heart; the thoracic portion and the cervical extend beyond the ribs located ventrally to the trachea. For this study were used twelve fetus of the mongrel domestic cats, males and females, divided into three groups. The thymus were processed for the light-microscopy, and the stereological analyses were done using the physical disector method associated with the ConnEuler principle. The volume of the organ, lenght, thickness and wide increased gradually with the development, with diferences between sex. The stereological variables related to vascular number density (Nv(vasc)) were greater in females, decreasing gradually and the vascullar total number (N(vasc)) were greater in males decreasing gradually. The lenght density (Lv) and the surface area density showed decreasing at forty-five days old, and the lenght density were greater in males ate thirty-five and fifty-five days old, while the surface area density the values were varied between sex.

O timo é um dos órgãos linfoides mais acometidos pelas patologias imunodepressoras, o qual geralmente é avaliado quanto ao grau de perda linfocitária a partir de técnicas histológicas subjetivas. Este trabalho teve como propósito a adaptação e aplicação do sistema ADDL (Análise Digital de Depleção Linfóide) em timos, a fim de tornar sua análise mais precisa. Primeiramente, realizou-se um estudo piloto, no qual foram utilizadas amostras de timo do trabalho desenvolvido por Camillotti (2011), porém constatou-se um número insatisfatório de lobos tímicos para os três escores de depleção linfocitária adotados, assim como dificuldade na categorização com apenas 3 graus de lesão. Optou-se, então, pela indução de imunodepressão através da utilização de um glicocorticóide, e pela classificação dos timos em cinco escores (1 a 5). Para tanto, foram utilizados 70 aves de um dia de idade, sendo que aos 21 dias de idade, foram separadas 15 aves para composição do grupo controle e 55 para o grupo tratado. Foi empregado o protocolo de tratamento com dexametasona adaptado de Kong, et al. (2002). Durante as coletas, de cada uma das aves, ambas as cadeias tímicas eram pesadas, sendo selecionados seis lobos para o processamento histológico de rotina, análise quanto ao grau de depleção linfocitária por dois avaliadores (A e B) e submissão a todas as etapas de processamento pelo sistema ADDL. Foram construídas ao final, cinco RNAs (Redes Neurais Artificiais): duas tendo em vista o escore por lobo (escore do avaliador A; escore do avaliador B) e três considerando o escore por ave (moda dos escores de 6 lobos/ave do avaliador A; moda dos escores de 6 lobos/ave do avaliador B, moda conjunta dos escores dos avaliadores A + B). A fim de relacionar o peso relativo (PR) do timo ao escore digital de depleção, foi aplicado o teste de correlação de Spearman, seguido de análise de regressão, e para evidenciar diferenças entre os escores atribuídos pelos avaliadores, utilizou o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney. Constatou-se que o tratamento com dexametasona permitiu a aquisição de timos com escores entre 1 a 5. Houve diferença significativa entre as leituras realizadas pelos avaliadores considerando o lobo e também entre a moda de escores dos dois avaliadores, assim como entre a moda do avaliador B e a moda conjunta (p<0,005). Foi observado que as duas RNAs construídas por lobo obtiveram um percentual de 50% de classificações corretas. As RNAs construídas utilizando a moda mostraram um percentual de acerto de 86,57% para o avaliador A, 80,60% para avaliador B e 94,03% para a rede construída a partir da moda conjunta dos avaliadores. Paralelamente, observou-se ρ= -0,77 e R2=0,58 entre as variáveis “PR” e “Escore digital de depleção linfocitária”. Em conclusão, foi possível a aplicação do sistema ADDL para timos, sendo a RNA treinada com a moda conjunta dos escores dos avaliadores A e B, o modelo que alcançou melhor desempenho. Portanto, o uso de ferramentas de análise de imagem em conjunto com as RNAs, torna possível uma avaliação do sistema imune da ave adotando critérios objetivos para as análises histológicas quanto a perda linfocitária. / The thymus is a lymphoid organs most affected by immunosuppressive diseases, which is usually assessed on the degree of lymphocyte loss from subjective histological techniques. This work aimed to the adaptation and application of the system DALD (Digital Analysis of Lymphoid Depletion) in the thymus in order to make your analysis more accurate. First,a pilot study was performed, in which samples from the thymus of the work of Camillotti (2011) were used, but it was found a number of poor thymic lobes for the three scores lymphocyte depletion adopted, as well as difficulty with categorization only three degrees of injury. It was decided, therefore, by inducing immunosuppression by using a glucocorticoid, and the classification of the five scores thymus (1 to 5). Therefore, 70 birds a day old were used, and at 21 days of age, 15 birds were separated for composition of the control group and 55 in the treated group. A treatment protocol with dexamethasone adapted Kong et al. (2002) was performed. During collection, each of the birds, both chains thymus were weighed, and selected six lobes for histological processing, analysis of the degree of lymphocyte depletion by two raters (A and B) and submission to all stages of DALD processing by the system. At the end of five ANNs (Artificial Neural Networks) were built: two in view of the score by lobe (The score evaluator, the evaluator score B) and three taking the score per bird (mode scores of 6 lobes / bird evaluator The; mode scores of 6 lobes / bird evaluator B, trendy joint scores of evaluators A + B). In order to relate the relative weight (RW) of the thymus to score digital depletion the Spearman correlation test was used, followed by regression analysis, and to highlight differences between the scores assigned by the evaluators used the Wilcoxon- Mann- Whitney test. It was found that treatment with dexamethasone permitted the acquisition of thymus with scores ranging from 1 to 5. Significant difference between the readings made by the evaluators considering the lobe and also between mode scores of two raters, as well as between mode evaluator B and joint mode (p <0.005). It was observed that the two ANNs constructed by lobe obtained a percentage of 50% correct classifications. ANNs built using the fashion shown a percentage of accuracy of 86.57% for the evaluator A, 80.60% to avaliator B and 94,03% for the network constructed from the trendy joint assessors. In parallel, it was noted ρ = -0.77, and R2 = 0.58 between "RW" and "digital lymphoid depletion score". In conclusion, it was possible to apply the system to DALD sweetbreads, and the trained ANN with mode combined scores of raters A and B, the model achieved better performance. Therefore, the use of image analysis tools along with the ANNs makes possible an assessment of the bird's immune system adopting objective criteria for histological analyzes as the lymphocyte loss.

O timo secreta substâncias promotoras da sobrevivência de linfócitos e hormônios ligados à dinâmica do citoesqueleto. Esses agentes são produzidos em grande quantidade pelo animal recém-nato, e apresentam efeito homeostático sobre a população de linfócitos T circulantes, por toda a vida. Na sepse, a atrofia dos órgãos linfóides, o surgimento de acúmulos de actina intersticial, e a diminuição dos níveis de fibronectina plasmática guardam relação com a mortalidade. O trabalho aqui descrito procurou detectar o efeito do sobrenadante de cultura de timo de rato Wistar neonato, saudável, sobre a mortalidade e as expressões simultâneas de actina e fibronectina em timos de ratos Wistar adultos submetidos a sepse peritoneal. Foi constatada uma diminuição na expressão de actina e de fibronectina no interstício de timos de ratos Wistar adultos sépticos, tratados com a aplicação intraperitoneal do sobrenadante de explante de timo de ratos neonatos. Tal efeito provocou um aumento da sobrevivência semelhante ao tratamento com meio de cultura apenas ( sem explante), contudo houve uma notável melhora dos sinais clínicos . Não houve qualquer efeito anti-inflamatório, com o tratamento com o sobrenadante, sobre inflamação periférica em animais saudáveis submetidos a injeção intramuscular de glutaraldeído, o que afastou a hipótese de influência sobre a enzima tranglutaminase tecidual, ativada em estados inflamatórios , e responsável pela aglomeração intersticial, da actina originada de células lesadas. O autor concluiu que os efeitos observados pelo tratamento com sobrenadante de cultura de timo de animal recém-nato, podem ser atribuídos a estimulação de mecanismos promotores da integridade celular, frente aos estresses químicos vigentes no meio interno, durante a sepse. O autor sugere que a observação simultânea de actina e fibronectina no timo pode auxiliar nos estudos de tratamentos experimentais da sepse. / The response of septic adult Wistar rats submitted to treatment with supernatant from the culture of thymus of healthy newly-born Wistar rats were observed. Although there has not been significant reduction in mortality compared relation to treatment with culture medium only (without explanted) , it was possible to observe a rapid improvement in the clinical conditions and a lower agglomeration of actin and fibronectin in the thymus of treated animals. We did not observe any anti-inflammatory effect of the supernatant in animals with paw inflammation exclusively, which averted the modulation of the Tissue Transglutaminase Enzyme, agglomerator of the actin released by diseased cells. The author concludes that the treament of sepsis with supernatant stimulated survival in thymus, and suggests that the immuno-hystochemical study of actin and fibronectin in the thymus isa useful method in the analysis of experimental treatments of sepsis.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-08-01T19:55:39Z No. of bitstreams: 3 Dissertação- Reginaldo Teixeira Nunes - 2014.pdf: 2255035 bytes, checksum: 70c145eb933df8fd6b89f116a91cade4 (MD5) Ata da Defesa de Mestrado. Reginaldo Texeira Nunes.jpg: 2607204 bytes, checksum: fb38ba2b64baafd566c2d99c81304371 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-02T12:26:59Z (GMT) No. of bitstreams: 3 Dissertação- Reginaldo Teixeira Nunes - 2014.pdf: 2255035 bytes, checksum: 70c145eb933df8fd6b89f116a91cade4 (MD5) Ata da Defesa de Mestrado. Reginaldo Texeira Nunes.jpg: 2607204 bytes, checksum: fb38ba2b64baafd566c2d99c81304371 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T12:26:59Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Dissertação- Reginaldo Teixeira Nunes - 2014.pdf: 2255035 bytes, checksum: 70c145eb933df8fd6b89f116a91cade4 (MD5) Ata da Defesa de Mestrado. Reginaldo Texeira Nunes.jpg: 2607204 bytes, checksum: fb38ba2b64baafd566c2d99c81304371 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-07-04 / The basidiomycete Cryptococcus neoformans is a pathogenic yeast responsible for causing meningoencephalitis in patients with a compromised immune system, leading to high mortality rates worldwide. Presently available antifungal drugs for treating this disease are not always efficient and they may lead to serious side effects and sometimes to fungal resistance. This situation has caused an increasing search for natural products derived from plants with antifungal action. Cymbopogon winterianus Jowitt (Poaceae), popularly known as citronella and Thymus vulgaris L. (Labiatae), known as thyme, are two plants commonly used in folk medicine. This study aimed at evaluating the biological activity of both C. winterianus and T. vulgaris essential oils (EOs) on C. neoformans clinical isolates. We evaluated the in vitro susceptibility of C. neoformans to each EO by the broth microdilution method, the in vitro interaction between EOs and fluconazole by the checkerboard method, their toxicity on human erythrocytes and their effects on the mitochondrial metabolism of fungal cells. Both EOs showed to possess antifungal activity against the tested isolates, with minimum inhibitory concentrations (MICs) ranging from 32 to 256 μg/mL for C. winterianus and from 32 to 128 μg/mL for T. vulgaris. No synergism between the EOs and fluconazole was observed. C. winterianus and T. vulgaris EOs did not cause hemolysis on human erythrocytes at concentrations corresponding to MIC values, indicating, therefore, low toxicity. The MTT assays showed no alterations on mitochondrial metabolism of fungal cells by C. winterianus at concentrations ≤ 128μg/mL, as well as no alterations at any concentrations corresponding to MIC values by T. vulgaris, suggesting that the main mechanism of action of both EOs is not by interfering with mitochondrial activity. Results show that C. winterianus and T. vulgaris EOs may be promising on the production of new antifungal drugs. / O basidiomiceto Cryptococcus neoformans é uma levedura patogênica causadora de meningoencefalite em pacientes imunocomprometidos, levando a altas taxas de mortalidade em todo o mundo. Os antifúngicos atualmente disponíveis para o tratamento dessa enfermidade nem sempre são eficazes, podendo causar efeitos colaterais graves e levar a casos de resistência. Diante dessa situação, a busca por produtos naturais, com ação antifúngica, oriundos de plantas tem crescido consideravelmente. Cymbopogon winterianus Jowitt (Poaceae), conhecida popularmente como citronela e Thymus vulgaris L. (Labiatae), conhecida como tomilho-branco, são duas plantas comumente utilizadas na medicina popular. Este trabalho avaliou a atividade biológica dos óleos essenciais (OEs) de ambas, em isolados clínicos de C. neoformans. Foram avaliados a suscetibilidade in vitro destes isolados ao OE de cada planta pelo método de microdiluição em caldo, a interação in vitro entre os OEs e fluconazol pelo método de checkerboard, sua toxicidade em eritrócitos humanos e seus efeitos no metabolismo mitocondrial de células fúngicas. Ambos os OEs apresentaram atividade antifúngica, com concentrações inibitórias mínimas (CIMs) variando de 32 a 256μg/mL, para C. winterianus, e de 32 a 128μg/mL para T. vulgaris. Não houve sinergismo entre os OEs e fluconazol. Os OEs de C. winterianus e T. vulgaris não causaram hemólise em eritrócitos humanos nas concentrações correspondentes às CIMs, mostrando-se de baixa toxicidade. Nos ensaios com MTT, observou-se que não houve alterações no metabolismo mitocondrial das células fúngicas por C. winterianus em concentrações iguais ou inferiores a 128μg/mL, e em nenhum dos valores correspondentes às CIMs por T. vulgaris, sugerindo que o principal mecanismo de ação antifúngica desses OEs nas CIMs não ocorre por interferência na atividade mitocondrial. Os resultados obtidos demonstram que OEs de C. winterianus e T. vulgaris podem ser promissores para a produção de novos antifúngicos.

Durante a vida fetal e no período neonatal, o timo é órgão de grande importância imunológica e, anatomicamente é o maior órgão linfático e com alta atividade linfopoiética, constando como precursor da linfopoiese. No que diz respeito à irrigação do timo em cães, a literatura é escassa, visto que os autores quando se reportam ao assunto fazem-no na sua maioria de maneira genérica. Com isso, aspectos morfológicos como número de vasos, tamanho do órgão foram estudados considerando as variáveis sexo e faixas etárias. Para este estudo, foram utilizados 24 fetos de cães domésticos, sem raça definida, machos e fêmeas, divididos em quatro grupos etários. Os timos foram processados para o estudo da microscopia de luz, e as análises estereológicas foram realizadas utilizando o método do disector físico associado com o princípio de ConnEulor. O volume do órgão (Vref), comprimento, espessura e largura aumentaram gradativamente com o desenvolvimento, sendo maior nos machos do que nas fêmeas. As variáveis estereológicas analisadas (densidade de comprimento do vaso - Lv, comprimento do vaso - L, densidade de superfície de área - Sv, superfície de área - S, estimação da densidade numérica vascular ? Nv(vasc) número total de vasos no órgão - N (vasc) ), tiveram um aumento gradativo, sendo que o Lv foi maior nas fêmeas e as demais os machos apresentaram maior valor. Aumento na Nv(vasc) e N (vasc) foi observado nos animais do grupo IV. / During phoetal life and neonatal period, the thymus is the organ that has a wide immunological relevance and, anatomically speaking is the largest lymphoid organ presenting high limphopoietic activity presented as the predecessor of limphopoiesis. The literature about thymus irrigation in dogs is scarce, becouse most authors refer to the subject in a general way. Then, morphological aspects as number, shape, size, irrigation, and quantitative were study considering sexy and differents ages of development of the dogs. To the study, were used twenty-four fetus of the mongrel domestics dogs, males and females, divided into four different well defined aged groups (fetus 30, 40, 50 and 60 days). The thymus were processed for the light microscopy study, and the stereological analyses were done using the physical disector method associated with the ConnEulor principle. The volume of the organ, length, thickness and wide increased gradually with the development, in males is great that female. The stereological variables analysed (length density ? Lv, length od vascullar ? L, surface area density ? Sv, surface area ? S, vascullar number density ? N.v(vasc) , and vascullar total number - N. (vasc) ), had the gradual high, the Lv was more in female and the others variables were more in males. The rise of N.v(vasc) and N. (vasc) was observed on the group four animals.

Dans le thymus, la présentation par les cellules stromales thymiques (cellules épithéliales (TEC) ou dendritiques (DC)) de peptides dérivés de protéines du soi associés au complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II) est un mécanisme essentiel au développement des lymphocytes T CD4 (LT CD4) et à la sélection du répertoire de récepteur à l'antigène (TCR) qu'elles expriment. Ainsi, une interaction de faible intensité entre le TCR exprimé par les thymocytes et les complexes pMHC est nécessaire à la sélection positive des thymocytes alors qu'une interaction de forte affinité conduira à la délétion. L'apprêtement des protéines dans la voie de présentation du CMH-II dépend d'une protéolyse séquentielle impliquant un ensemble de protéases de spécificité relativement imprécise. Ainsi des protéases peuvent promouvoir ou empêcher la génération de certains peptides pouvant se lier aux molécules de CMH-II. La protéase à sérine spécifique du thymus (TSSP) est exprimée dans le thymus par les TEC du cortex et les DC thymiques, mais pas par les DC en périphérie. Différentes études suggèrent que TSSP serait une protéase de la voie de présentation du CMH-II qui limiterait par des mécanismes encore inconnus la présentation de certains antigènes du " soi " dans le thymus et notamment par les DC. Ainsi TSSP limiterait la tolérance au " soi " dans le thymus. Notamment, nous avons montré que les souris NOD déficientes en TSSP (NOD Tssp°) sont résistantes au diabète de type 1 (T1D) corrélé à une délétion accrue de cellules T CD4 spécifiques de certains antigènes associés au T1D. Ainsi, les souris NOD Tssp° sont partiellement tolérantes à S100ß, un antigène des îlots de Langerhans associé au développement du T1D. Afin de mieux comprendre l'impact de la sélection négative sur le répertoire autoréactif, nous avons analysé le répertoire de cellules T CD4 spécifiques de S100ß chez des souris NOD sauvages (WT) et NOD Tssp°. Bien que relativement divers, le répertoire TCRaß présente, dans les deux souches de souris, un biais pour des réarrangements TCRa dominants et publics de faible avidité. Des cellules T CD4 de forte avidité exprimant un répertoire privé sont retrouvées chez les souris NOD WT mais sont sélectivement délétés chez les souris NOD Tssp°. Ainsi, l'augmentation de la disponibilité en antigène favorise la délétion de cellules T de fortes avidité. Parallèlement, nous avons analysé l'effet de l'absence de TSSP sur le développement d'une autre pathologie autoimmune médiée par les cellules T CD4, l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) induite par le peptide MOG35-55. Les souris NOD Tssp° développent une pathologie moins sévère que les souris sauvage. Cette réduction de sévérité résulte, au moins en partie, d'une diminution de l'avidité et de la fonctionnalité des cellules T CD4 encéphalitogènes spécifiques de MOG35-55. L'ensemble de ces travaux et les études précédentes de notre équipe suggère que TSSP, en régulant négativement la présentation antigénique, empêche la tolérance au soi et ainsi favorise l'émergence d'un répertoire TCR autoréactif de haute avidité pour l'antigène. Dans ce contexte, le maintien de TSSP au cours de l'évolution est surprenant. Néanmoins, l'absence de TSSP entraîne également une réduction de réponse spécifique de certains antigènes du non soi. Ainsi, dans le thymus, TSSP en limitant la tolérance au soi permettrait une diversification du répertoire TCR. / In the thymus, the presentation by thymic stromal cells (epithelial (TEC) or dendritic cells (DC)) of peptides derived from self-proteins associated with the major histocompatibility complex class II (MHC-II) is an essential mechanism for the development of CD4 T cells (CD4) and selection of their antigen receptor (TCR) repertoire. Thus, a low intensity interaction between the TCR expressed by thymocytes and pMHC complexes is necessary for the positive selection of thymocytes while a high affinity interaction lead to its deletion. The processing of proteins for MHC-II presentation pathway is dependent of sequential proteolysis involving a set of protease with a relatively imprecise specificity. Proteases can therefore promote or inhibit the generation of certain peptides that can bind to MHC-II molecules. The thymus specific serine protease (TSSP) is expressed in the thymus by cortical TEC and thymic DC, but not by DC in the periphery. Various studies suggest that TSSP is a protease of MHC-II presentation pathway which could limit, by some unknown mechanisms, the presentation of certain self-antigens in the thymus and in particular by DC. Thus, TSSP might limit self-tolerance in the thymus. In particular, we have shown that TSSP-deficient NOD mice (NOD Tssp°) are resistant to type 1 diabetes (T1D) correlated with an increased deletion of CD4 T cells specific for certain antigens associated with T1D. Thus, NOD Tssp° are partially tolerant to S100ß, a Langerhans islet antigen associated with the development of T1D. To better understand the impact of negative selection on the self-reactive repertoire, we analyzed the S100ß-specific CD4 T cells repertoire of NOD wildtype (WT) and NOD Tssp° mice. Although it's relatively diverse, the TCRaß repertoire presents, in both strains of mouse, a bias to low-avidity dominant and public TCRa rearrangements. High avidity CD4 T cells expressing a private repertoire are found in NOD WT mice but are selectively deleted in NOD Tssp° mice. Thus, increasing the availability of antigen promotes high avidity T cells deletion. In parallel, we analyzed the effect of the absence of TSSP on the development of another autoimmune disease mediated by CD4 T cells, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by the MOG35-55 peptide. NOD Tssp° mice develop a less severe pathology than WT mice. This reduction of severity results, at least in part, in a decrease of avidity and functionality of encephalitogenic MOG35-55- specific CD4 T cells. Taken together, this work and previous studies from our team suggests that TSSP, by negatively regulating antigen presentation, prevents self-tolerance and thus promotes the emergence of a self-reactive TCR repertoire of high avidity for the antigen. In this context, maintaining TSSP during evolution is surprising. Nevertheless, the absence of TSSP also reduces the specific response against some non-self-antigens. Thus, in the thymus, TSSP by limiting self-tolerance would allow the diversification of the TCR repertoire.

O timo é o órgão linfóide primário responsável pelo estabelecimento inicial de um repertório funcional de células T. A via de sinalização Notch é essencial para o desenvolvimento de células T a partir de células-tronco hematopoiéticas, e a distribuição de seus receptores e ligantes no timo humano ainda é desconhecida. A expressão de AIRE é crucial para a seleção de um repertório de receptores de linfócitos T (TCR) sem autorreatividade. Neste estudo, analisamos o padrão de expressão de AIRE e a distribuição de Notch em timos pacientes com cardiopatias congênitas, parte dos quais com síndrome de Down. Descrevemos a localização intratímica e os tipos celulares capazes de expressar os diferentes receptores e ligantes Notch. A expressão de AIRE em células epiteliais medulares foi significantemente reduzida em timos de crianças com síndrome de Down, deficiência esta que pode explicar a alta incidência de doenças autoimunes nesta cromossomopatia. / The thymus is a primary lymphoid organ which is essential for the initial establishment of a functional repertoire of T cells. Notch signaling is crucial for T-cell lineage development from hematopoietic stem cells; however, distribution of Notch ligands and receptors in human thymus is still unknown. AIRE is crucial for the selection of a T-cell-receptor (TCR) repertoire purged of self-reactive specificities. In this study, we analyzed the expression patterns of AIRE and Notch in human thymuses from children with congenital cardiopathies that undergo heart surgery, part of whom with Down syndrome. We described the intra-thymic localization and the cell types that express Notch receptors and ligands. AIRE expression in medullary epithelial cells is significantly decreased in Down syndrome patients. This deficiency could explain higher incidence of autoimmune disease in Down syndrome.

The definitive endoderm gives rise to several specialized organs, including the thymus. Improper development of the definite endoderm or its derivatives can lead to human disease; in the case of the thymus, immunodeficiency or autoimmune disorders. Human pluripotent stem cells (hPSCs) have emerged as a system to model human development, as study of their differentiation allows for elucidation of the molecular basis of cell fate decisions, under both healthy and impaired conditions. Here, we first developed a CRISPR-effector system to control endogenous gene expression in hPSCs, a novel approach to manipulating hPSC state. Next, the human-specific, loss-of-function phenotypes of candidate transcription factors driving hPSC-to-definitive endoderm differentiation were analyzed through combined CRISPR-perturbation and single-cell RNA-sequencing. This analysis revealed the importance of TGFβ mediators in human definitive endoderm differentiation as well as identified an unappreciated role for FOXA2 in human foregut development. Finally, as the differentiation of definitive endoderm to thymic epithelial progenitors (TEPs) is of particular interest, a single-cell transcriptomic atlas of murine thymus development was generated in anticipation of identifying factors driving later stages of TEP differentiation. Taken together, this dissertation establishes a CRISPR-effector system to interrogate gene and regulatory element function in hPSC differentiation strategies, details the role of specific transcription factors in human endoderm differentiation, and sets the groundwork for future investigations to characterize hPSC-derived TEPs and the factors driving their differentiation.

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