1. Sphingolipid-cholesterol domains (lipid rafts) in normal human and dog thyroid follicular cells are not involved in thyrotropin receptor signalling. <p>Thyroid hormone regulates growth and development throughout the animal kingdom. The thyroid which secretes it, is controlled by TSH and its receptor TSHR. TSH and its receptor TSHR act through TSHR-coupled G proteins to control thyroid functions, with a stronger coupling of the TSHR with Gs protein than with Gq protein in human thyrocytes. Gq is not activated by TSH/TSHR in dog, whereas dog TSHR activates it in CHO transfected cells. To better understand TSHR and its downstream effectors G proteins, we attempted to answer the questions by the role of “lipid rafts/caveolae” in TSH action.<p>Lipid rafts/caveolae are sphingolipids-cholesterol-enriched microdomains on plasma membrane that have been proposed to play a role in signal transduction. By concentrating the signal molecules, lipid rafts/caveolae increase the efficiency of the interactions between the molecules and sequestrate them from the bulk membranes. The compartmentation of signal proteins in lipid rafts/caveolae might provide a possible explanation for the relationship between TSHR and G proteins in human and dog thyroctyes.<p>To answer these questions, we first tested the existence of such lipid microdomains in human and dog thyrocytes. By northernblot and RT-PCR of caveolin-1 mRNA, we demonstrated its existence in thyrocytes. The immunohistochemistry of caveolin-1 showed that caveolin/caveolae are present on the apical membrane of thyrocytes, opposite to the TSHR localization on the basolateral membranes. The isolation of lipid rafts/caveolae by Triton X-100/OptiPrep density experiments showed that TSHR and Gq are not in the rafts, even though other proteins such as insulin receptor, flotillin-2 and partially Gs are present in these lipid domains, as expected. Testing the function of the TSH receptor on its main cascade (Gs-Adenylyl cyclase-cAMP) after treating the follicles with Methyl β-cyclodextrin (a cholesterol chelator), we observed no modification of the cAMP levels by this treatment. This is in agreement with our conclusion that the TSHR-Gs-cAMP pathway does not involve the lipid rafts/caveolae domain.<p>TSH-activated signalling does not take place in these membrane domains. Therefore, the differences between species, concerning the TSHR-G proteins coupling cannot be explained by the presence of these membrane domains.<p>2. Species specific thyroid signal transduction: conserved physiology, diverged mechanisms<p>As mentioned above, Gq proteins are activated in human but not in dog thyroid, in response to TSHR. However the dog TSH receptor is able to activate Gq, as demonstrated in transfected CHO cells. Thus, different thyroid signal transduction pathways exist in different species. <p>In this study, we investigated the effects of TSH on its two signal transduction cascades, the cAMP pathway and the phospholipase C – IP3 – DAG pathway, as measured by cAMP levels and inositol phosphate generation. We also measured the effects of TSH and of agents stimulating specifically one of these cascades, forskolin for the cAMP pathway and Ca++ ionophore (ionomycin) and phorbolmyristate ester (TPA) for the phospholipase C pathway, on markers of thyroid hormone synthesis (H2O2 generation and iodide binding to proteins) and on thyroid hormone secretion in vitro in the various thyroids. <p>We demonstrated that in all species investigated, the TSH receptor activates both hormone synthesis and secretion. While in some species, including humans, rats and mice, the TSH receptor activates both the cAMP and phospholipase C– IP3 – DAG cascades, in others (e.g. dog) it only stimulates the first. The cAMP pathway activates the limiting step in thyroid hormone synthesis, the generation of H2O2, in dog, rat and mice but not in human, pig, horse and beef. Thus physiology remains but the pathways to achieve it differ. On a practical point of view, these results allow to choose adequate animal models for investigating different aspects of human thyroid signalling.<p><p>3. Duoxes -TPO association and its regulation in human thyrocytes: the thyroxisome<p>Duox (Dual Oxidase) and TPO (thyroid peroxidase) are the crucial enzymes for the thyroid hormones biosynthesis (T3/T4). TPO uses the hydrogen peroxide (H2O2) produced by Duox1 and Duox2 isoenzymes to covalently link oxidized iodide to tyrosines of thyroglobulin and couple the iodinated tyrosines to form triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4). An excess of H2O2 is considered to be toxic for cells although at appropriate concentrations H2O2 may carry out signalling functions. Even though thyrocytes show a better resistance to H2O2 than other cells, it would be beneficial for thyrocytes if Duox and TPO localize closely to increase the working efficiency and avoid an excessive H2O2 spillage. In this study, we explored the association of Duox with TPO, and the possible factors affecting their interaction in the human thyrocyte model. This association was established by co-immunoprecipitation approaches on purified plasma membranes from human thyrocytes and COS-7 transfected cells. <p>Our results show that 1) Duox and TPO localize closely at the plasma membranes of human thyrocytes, 2) this association is up-regulated through the Gq-PLC-Ca2+-PKC pathway and down-regulated through the Gs-cAMP-PKA pathway. 3) H2O2 directly increases the association of Duox and TPO. 4) Partial NH2- or COOH-terminal Duox1 and Duox2 proteins show different binding abilities with TPO in COS-7 transfected cells.<p>The association of the two proteins Duox and TPO thus supports our previous hypothesis of the thyroxisome, a pluriprotein plasma membrane complex in which elements of the iodination apparatus localize closely, thus optimizing working efficiency and minimizing H2O2 spillage. Defect in this association, independently of the catalytic efficiency of the enzyme, could therefore impair thyroid hormone synthesis and be harmful to thyroid cells, leading to thyroid insufficiency.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans une première partie du travail, nous nous sommes intéressés à l'effet de l'acrylamide sur la tumorigénèse thyroïdienne. En effet des chercheurs suédois avaient récemment attiré l’attention de la communauté scientifique sur la présence de ce xénobiotique dans des denrées alimentaires couramment utilisées. Des études antérieures avaient montré que l’acrylamide, administré chroniquement à des rats pendant deux ans, induisait des tumeurs parmi lesquelles les tumeurs thyroïdiennes étaient les plus fréquentes. Pour ces raisons l’acrylamide est considéré comme une substance potentiellement cancérigène pour l’homme. Nous avons voulu investiguer les mécanismes d’action possibles de l’acrylamide dans la tumorigénèse thyroïdienne avec un modèle in vitro et ensuite un modèle in vivo.<p>Dans le modèle in vitro, nous avons d’abord testé l’effet de l’acrylamide sur les propriétés caractéristiques de la thyroïde, qui pourraient expliquer la spécificité de cette substance pour ce tissu. Dans un premier temps, nous avons donc testé l’effet de l’acrylamide sur l’accumulation d’AMPc (médiateur de la croissance) et sur la génération d’H2O2 potentiellement cancérigène mais nous avons montré qu’aucun de ces deux paramètres n’est modulé suite au traitement des cellules thyroïdiennes. Nous avons ensuite montré que l’acrylamide n’avait pas d’effet sur la prolifération dans les lignées thyroïdienne de rat, un facteur qui aurait pu expliquer l’effet tumorigène de l’acrylamide mais pas sa spécificité thyroïdienne. Nous avons enfin testé en utilisant l’essai comète la capacité de l’acrylamide à générer des cassures au niveau de l’ADN. Ceci nous a permis de montrer que l’acrylamide était capable d’induire des cassures dans l’ADN de lignées thyroïdiennes de rat ainsi que dans des cultures primaires de thyroïde humaines, de chien et de mouton. Afin de déterminer que l’effet observé sur l’ADN était dû à des cassures double brin, nous avons utilisé une technique de détection de l’histone H2AX phosphorylée. En effet, la phosphorylation de cette histone se produit lorsque des cassures d’ADN double brin sont présentes. Les résultats obtenus ne soutiennent pas l’hypothèse que l’acrylamide provoque des cassures double brin. Néanmoins ces dommages à l’ADN sont susceptibles d’induire des mutations qui peuvent jouer un rôle dans le processus de tumorigénèse de l’acrylamide.<p>Nous avons donc testé l’effet de l’acrylamide sur un modèle in vivo. Pour cela nous avons traité des souris avec de l’acrylamide additionné à l’eau de boisson à des doses comparables à celles administrées aux rats pendant 2, 6 ou 8 mois. Ce traitement a également été combiné avec de la thyroxine (T4) afin de mettre la thyroïde au repos ou avec du méthimazole qui inhibe la sécrétion des hormones thyroïdiennes et par conséquent induit la sécrétion de TSH, ce qui a pour effet de stimuler la glande. Ces traitements modérés ont eu les effets attendus au niveau des taux de TSH et de T4 circulants ainsi que sur la morphologie de la glande. L’acrylamide a eu de faibles effets sur le système nerveux périphérique traduit par une paralysie des membres postérieurs. Par contre nous n’avons pas observé d’apparition de tumeurs dans la thyroïde des souris. La cible thyroïdienne de l’acrylamide chez le rat semble donc spécifique de l’espèce et jette un doute sérieux sur un rôle cancérigène potentiel chez l’homme au niveau thyroïdien.<p><p>Dans une deuxième partie, nous avons investigué la réexpression de certains gènes thyroïdiens dans des lignées cancéreuses humaines. En effet nous avons montré au sein du laboratoire que la plupart des lignées thyroïdiennes les plus utilisées avaient perdu les gènes de différentiation spécifiques de la thyroïde. Pour cela nous avons utilisé des agents capables de modifier soit la méthylation de l’ADN comme la 5-aza-2’-déoxycytidine (5-AzadC) soit la compaction de la chromatine comme la trichostatine A (TSA), ce qui a pour conséquence de moduler le niveau d’expression des gènes. Ces traitements ont été utilisés à différentes concentrations, différents temps, seuls ou en combinaison. La 5-AzadC, utilisée seule a permis de réexprimer fortement les gènes Duox1 et Duox2 et faiblement NIS. En combinaison avec la TSA et la forskoline (un activateur de la voie AMPc), nous avons montré une forte réexpression de NIS mais au stade actuel de notre étude celui-ci n’est pas fonctionnel. Ceci montre que les agents modifiant la chromatine peuvent influencer l’expression des gènes de différenciation, cependant nous devons investiguer de façon plus large les différents agents ainsi que les conditions de culture pouvant mener à la réexpression d’un NIS fonctionnel. Grâce à ce traitement différenciant, qui permettrait un rétablissement du transport de l’iodure, un traitement par l’I131 des cancers indifférenciés de la thyroïde pourrait être réenvisagé.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La thyroïde capte et concentre l’iodure afin de produire les hormones thyroïdiennes T3 et T4. L’iodure est capté au pôle basolatéral du thyrocyte par le symporteur Na+/I- (NIS) et transporté jusqu'au pôle apical de la cellule où il est oxydé par la thyroperoxydase (TPO). La forme oxydée de l’iodure se lie à des résidus tyrosyls de la thyroglobuline (Tg), contenue dans la thyroïde, qui couplés donneront naissance à la T3 et la T4. L’iodation et le couplage sont possibles grâce à la thyroperoxydase et à la présence d’un système générateur d’H2O2. Celui-ci est composé des protéines à sept hélices transmembranaires Duox1 et Duox2 présentant 83% de similitude de séquence entre elles et possédant deux motifs EF-hand ainsi qu’un site de liaison au FAD et quatre sites de liaison au NADPH. Dans la thyroïde humaine, l’ARN messager de Duox2 est plus exprimé que celui de Duox1. Jusqu'il y a peu de temps, nous n'avions à notre disposition aucun anticorps spécifique de l’une ou l’autre des Duox. Il n'était donc pas possible de déterminer si cette différence d’expression se retrouve au niveau protéique. Les PCCl3 sont une lignée de thyrocytes de rat possédant un système générateur d’H2O2 fonctionnel. Contrairement aux cultures primaires de thyrocytes humains, ces cellules peuvent être transfectées facilement. L’introduction de siRNAs spécifiques de Duox1 ou Duox2 de rat, via des vecteurs plasmidiques, a permis de démontrer que le peroxyde d’hydrogène produit par les PCCl3 est principalement généré par Duox1. En effet, l’inhibition de l’expression de Duox1 est directement corrélée à la diminution de production d’H2O2. Cette inhibition n’interfère pas avec d’autres fonctions de la cellule thyroïdienne puisque les cellules invalidées pour Duox1 sont toujours capables de capter l’iodure. De plus, la réintroduction de l’expression de Duox1 par transduction lentivirale permet de restaurer la production de peroxyde d’hydrogène.<p>Faute d’une maturation correcte des protéines Duox à la membrane plasmique, il a longtemps été impossible de reconstituer un système générateur d’H2O2 actif par transfection de Duox1 et/ou Duox2 en système hétérologue. En 2006, les protéines activatrices des protéines Duox1 et Duox2, respectivement appelées DuoxA1 et DuoxA2, ont été identifiées. Leur co-expression avec les enzymes Duox permet à ces dernières de migrer à la membrane et d’être actives. La distribution tissulaire des protéines DuoxA est parallèle à celle des Duox. La découverte des protéines activatrices a permis d’étudier spécifiquement la régulation de l’activité de Duox1 et de Duox2. La production d’H2O2 de Duox1 est positivement régulée par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la protéine kinase A (PKA). La génération d’H2O2 de Duox2 est sous le contrôle de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ conduisant à l’activation de la protéine kinase C (PKC). L’activation de Duox2 est également corrélée à une modification de l’état de phosphorylation de la protéine. Dans les thyrocytes humains, le récepteur de la TSH est couplé aux protéines Gs et Gq/11. La TSH liée à son récepteur est donc capable d’activer la voie de l’AMPc et la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Dans les thyrocytes humains en culture primaire, l’activation de la PKA et de la PKC mène également à une augmentation de la phosphorylation des protéines Duox. <p>En conclusion :1) Duox1 est majoritairement responsable de la production d’H2O2 dans la lignée de thyrocytes de rat PCCl3 ;2) l’activité de Duox1 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est régulée positivement par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la PKA ;3) l’activité de Duox2 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est stimulée par la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ via des phosphorylations par la PKC ;4) les thyrocytes humains expriment les deux protéines Duox. La production d’H2O2 est augmentée suite à l’activation de la voie de l’AMPc et de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Les protéines Duox sont phosphorylées au niveau basal et cette phosphorylation est augmentée suite à l’activation de la PKA ou de la PKC.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished