La thyroïde capte et concentre l’iodure afin de produire les hormones thyroïdiennes T3 et T4. L’iodure est capté au pôle basolatéral du thyrocyte par le symporteur Na+/I- (NIS) et transporté jusqu'au pôle apical de la cellule où il est oxydé par la thyroperoxydase (TPO). La forme oxydée de l’iodure se lie à des résidus tyrosyls de la thyroglobuline (Tg), contenue dans la thyroïde, qui couplés donneront naissance à la T3 et la T4. L’iodation et le couplage sont possibles grâce à la thyroperoxydase et à la présence d’un système générateur d’H2O2. Celui-ci est composé des protéines à sept hélices transmembranaires Duox1 et Duox2 présentant 83% de similitude de séquence entre elles et possédant deux motifs EF-hand ainsi qu’un site de liaison au FAD et quatre sites de liaison au NADPH. Dans la thyroïde humaine, l’ARN messager de Duox2 est plus exprimé que celui de Duox1. Jusqu'il y a peu de temps, nous n'avions à notre disposition aucun anticorps spécifique de l’une ou l’autre des Duox. Il n'était donc pas possible de déterminer si cette différence d’expression se retrouve au niveau protéique. Les PCCl3 sont une lignée de thyrocytes de rat possédant un système générateur d’H2O2 fonctionnel. Contrairement aux cultures primaires de thyrocytes humains, ces cellules peuvent être transfectées facilement. L’introduction de siRNAs spécifiques de Duox1 ou Duox2 de rat, via des vecteurs plasmidiques, a permis de démontrer que le peroxyde d’hydrogène produit par les PCCl3 est principalement généré par Duox1. En effet, l’inhibition de l’expression de Duox1 est directement corrélée à la diminution de production d’H2O2. Cette inhibition n’interfère pas avec d’autres fonctions de la cellule thyroïdienne puisque les cellules invalidées pour Duox1 sont toujours capables de capter l’iodure. De plus, la réintroduction de l’expression de Duox1 par transduction lentivirale permet de restaurer la production de peroxyde d’hydrogène. Faute d’une maturation correcte des protéines Duox à la membrane plasmique, il a longtemps été impossible de reconstituer un système générateur d’H2O2 actif par transfection de Duox1 et/ou Duox2 en système hétérologue. En 2006, les protéines activatrices des protéines Duox1 et Duox2, respectivement appelées DuoxA1 et DuoxA2, ont été identifiées. Leur co-expression avec les enzymes Duox permet à ces dernières de migrer à la membrane et d’être actives. La distribution tissulaire des protéines DuoxA est parallèle à celle des Duox. La découverte des protéines activatrices a permis d’étudier spécifiquement la régulation de l’activité de Duox1 et de Duox2. La production d’H2O2 de Duox1 est positivement régulée par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la protéine kinase A (PKA). La génération d’H2O2 de Duox2 est sous le contrôle de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ conduisant à l’activation de la protéine kinase C (PKC). L’activation de Duox2 est également corrélée à une modification de l’état de phosphorylation de la protéine. Dans les thyrocytes humains, le récepteur de la TSH est couplé aux protéines Gs et Gq/11. La TSH liée à son récepteur est donc capable d’activer la voie de l’AMPc et la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Dans les thyrocytes humains en culture primaire, l’activation de la PKA et de la PKC mène également à une augmentation de la phosphorylation des protéines Duox. En conclusion : 1) Duox1 est majoritairement responsable de la production d’H2O2 dans la lignée de thyrocytes de rat PCCl3 ; 2) l’activité de Duox1 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est régulée positivement par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la PKA ; 3) l’activité de Duox2 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est stimulée par la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ via des phosphorylations par la PKC ; 4) les thyrocytes humains expriment les deux protéines Duox. La production d’H2O2 est augmentée suite à l’activation de la voie de l’AMPc et de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Les protéines Duox sont phosphorylées au niveau basal et cette phosphorylation est augmentée suite à l’activation de la PKA ou de la PKC.

1. Sphingolipid-cholesterol domains (lipid rafts) in normal human and dog thyroid follicular cells are not involved in thyrotropin receptor signalling. Thyroid hormone regulates growth and development throughout the animal kingdom. The thyroid which secretes it, is controlled by TSH and its receptor TSHR. TSH and its receptor TSHR act through TSHR-coupled G proteins to control thyroid functions, with a stronger coupling of the TSHR with Gs protein than with Gq protein in human thyrocytes. Gq is not activated by TSH/TSHR in dog, whereas dog TSHR activates it in CHO transfected cells. To better understand TSHR and its downstream effectors G proteins, we attempted to answer the questions by the role of “lipid rafts/caveolae” in TSH action. Lipid rafts/caveolae are sphingolipids-cholesterol-enriched microdomains on plasma membrane that have been proposed to play a role in signal transduction. By concentrating the signal molecules, lipid rafts/caveolae increase the efficiency of the interactions between the molecules and sequestrate them from the bulk membranes. The compartmentation of signal proteins in lipid rafts/caveolae might provide a possible explanation for the relationship between TSHR and G proteins in human and dog thyroctyes. To answer these questions, we first tested the existence of such lipid microdomains in human and dog thyrocytes. By northernblot and RT-PCR of caveolin-1 mRNA, we demonstrated its existence in thyrocytes. The immunohistochemistry of caveolin-1 showed that caveolin/caveolae are present on the apical membrane of thyrocytes, opposite to the TSHR localization on the basolateral membranes. The isolation of lipid rafts/caveolae by Triton X-100/OptiPrep density experiments showed that TSHR and Gq are not in the rafts, even though other proteins such as insulin receptor, flotillin-2 and partially Gs are present in these lipid domains, as expected. Testing the function of the TSH receptor on its main cascade (Gs-Adenylyl cyclase-cAMP) after treating the follicles with Methyl β-cyclodextrin (a cholesterol chelator), we observed no modification of the cAMP levels by this treatment. This is in agreement with our conclusion that the TSHR-Gs-cAMP pathway does not involve the lipid rafts/caveolae domain. TSH-activated signalling does not take place in these membrane domains. Therefore, the differences between species, concerning the TSHR-G proteins coupling cannot be explained by the presence of these membrane domains. 2. Species specific thyroid signal transduction: conserved physiology, diverged mechanisms As mentioned above, Gq proteins are activated in human but not in dog thyroid, in response to TSHR. However the dog TSH receptor is able to activate Gq, as demonstrated in transfected CHO cells. Thus, different thyroid signal transduction pathways exist in different species. In this study, we investigated the effects of TSH on its two signal transduction cascades, the cAMP pathway and the phospholipase C – IP3 – DAG pathway, as measured by cAMP levels and inositol phosphate generation. We also measured the effects of TSH and of agents stimulating specifically one of these cascades, forskolin for the cAMP pathway and Ca++ ionophore (ionomycin) and phorbolmyristate ester (TPA) for the phospholipase C pathway, on markers of thyroid hormone synthesis (H2O2 generation and iodide binding to proteins) and on thyroid hormone secretion in vitro in the various thyroids. We demonstrated that in all species investigated, the TSH receptor activates both hormone synthesis and secretion. While in some species, including humans, rats and mice, the TSH receptor activates both the cAMP and phospholipase C– IP3 – DAG cascades, in others (e.g. dog) it only stimulates the first. The cAMP pathway activates the limiting step in thyroid hormone synthesis, the generation of H2O2, in dog, rat and mice but not in human, pig, horse and beef. Thus physiology remains but the pathways to achieve it differ. On a practical point of view, these results allow to choose adequate animal models for investigating different aspects of human thyroid signalling. 3. Duoxes -TPO association and its regulation in human thyrocytes: the thyroxisome Duox (Dual Oxidase) and TPO (thyroid peroxidase) are the crucial enzymes for the thyroid hormones biosynthesis (T3/T4). TPO uses the hydrogen peroxide (H2O2) produced by Duox1 and Duox2 isoenzymes to covalently link oxidized iodide to tyrosines of thyroglobulin and couple the iodinated tyrosines to form triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4). An excess of H2O2 is considered to be toxic for cells although at appropriate concentrations H2O2 may carry out signalling functions. Even though thyrocytes show a better resistance to H2O2 than other cells, it would be beneficial for thyrocytes if Duox and TPO localize closely to increase the working efficiency and avoid an excessive H2O2 spillage. In this study, we explored the association of Duox with TPO, and the possible factors affecting their interaction in the human thyrocyte model. This association was established by co-immunoprecipitation approaches on purified plasma membranes from human thyrocytes and COS-7 transfected cells. Our results show that 1) Duox and TPO localize closely at the plasma membranes of human thyrocytes, 2) this association is up-regulated through the Gq-PLC-Ca2+-PKC pathway and down-regulated through the Gs-cAMP-PKA pathway. 3) H2O2 directly increases the association of Duox and TPO. 4) Partial NH2- or COOH-terminal Duox1 and Duox2 proteins show different binding abilities with TPO in COS-7 transfected cells. The association of the two proteins Duox and TPO thus supports our previous hypothesis of the thyroxisome, a pluriprotein plasma membrane complex in which elements of the iodination apparatus localize closely, thus optimizing working efficiency and minimizing H2O2 spillage. Defect in this association, independently of the catalytic efficiency of the enzyme, could therefore impair thyroid hormone synthesis and be harmful to thyroid cells, leading to thyroid insufficiency.

Ce travail de thèse vise à l’identification des voies de signalisation cellulaires responsables de la régulation de l’expression des gènes humains DUOX dans la thyroïde. Les protéines DUOX1 et DUOX2 sont exprimées à la membrane apicale du thyrocyte, grâce à leur facteur de maturation DUOXA, et participent à la synthèse des hormones thyroïdiennes à travers la génération de peroxyde d’hydrogène. Les voies de signalisation et les facteurs de transcription contrôlant l’expression des gènes DUOX ne sont pas clairement définis dans les thyroïdes humaines et murines mais plusieurs études ont démontré une augmentation de leur expression via des cytokines inflammatoires dans des lignées cellulaires humaines. L’existence de cytokines susceptibles de réguler positivement l’expression des DUOX dans les thyrocytes a grandement suscité notre intérêt. En effet, il importe de comprendre les mécanismes responsables de leur expression car les protéines DUOX sont de plus en plus associées à des cancers et des maladies inflammatoires chroniques. Dans ce travail de recherche, il a été mis en évidence que les cytokines de type Th2 interleukine-4 et interleukine-13 augmentent la production de peroxyde d’hydrogène dans les thyrocytes humains en culture primaire suite à une induction des protéines DUOX2 et DUOXA2. L’interleukine-4 augmente aussi l’expression des couples de gènes Duox1/Duoxa1 et Duox2/Duoxa2 dans les thyrocytes murins, générant ainsi plus de peroxyde d’hydrogène. La stimulation par l’interleukine-4 et l’interleukine-13 dans les thyrocytes humains est dépendante du récepteur IL4RII et de l’activation de la voie de signalisation JAK1/STAT6. L’effet de l’interleukine-4 est contrecarré par la cytokine de type Th1 interféron-ɣ et est associée à une augmentation de l’expression de la protéine SOCS-1 qui bloque la fonction du facteur de transcription STAT6. L’induction de l’expression des gènes DUOX2/DUOXA2 dans des thyroïdes provenant de patients atteints de la maladie de Graves où le taux d’interleukine-4 sérique est susceptible d’être augmenté n’a pas pu être mise en évidence.In vitro, la mise en culture primaire affecte l’état de différenciation des thyrocytes murins ;en effet l’expression des marqueurs de la fonction thyroïdienne Nis, Tpo, Duox2 et Duoxa2 est diminuée, ce qui n’est pas le cas pour les gènes Duox1 et Duoxa1. Nous avons alors été convaincus de poursuivre l’étude de la régulation des Duox dans un système in vivo. Nous avons généré une nouvelle souris transgénique Thyr-IL-4, dans la souche C57BL/6J, surexprimant spécifiquement l’interleukine-4 dans la thyroïde. Deux lignées indépendantes de souris transgéniques ont été analysées. La souris Thyr-IL-4 a un phénotype euthyroïdien bien que la morphologie de ses follicules thyroïdiens soit altérée par une augmentation inattendue de leur taille. L’analyse du profil d’expression des gènes montre une forte induction de Duox1, Duoxa1 et Slc26a4 (Pendrine) dans les thyroïdes transgéniques ;il n’y a pas de modification de l’expression des gènes Duox2 et Duoxa2, tandis que l’expression du marqueur thyroïdien Slc5a5 (Nis) est diminuée. La surexpression de Duox1 est liée à une augmentation de la production de peroxyde d’hydrogène dans les tissus thyroïdiens transgéniques ex vivo, sans engendrer de dégâts cellulaires in vivo. Nous montrons pour la première fois la régulation de l’expression du gène et de la protéine Pendrine par l’interleukine-4 dans la thyroïde. La diminution de l’expression de Nis est associée à une diminution de captation de l’iode par les thyrocytes et du taux de thyroglobuline liée aux hormones thyroïdiennes T3 et T4 dans les thyroïdes transgéniques. Ces modifications d’expression de marqueurs thyroïdiens n’induisent pas un phénotype hypothyroïdien mais les souris jeunes Thyr-IL-4 sont plus susceptibles que les souris sauvages à développer une hypothyroïdie lorsqu’elles sont carencées en iode. Enfin nous n’observons pas d’infiltration leucocytaire majeure chez nos souris, pourtant l’expression de gènes impliqués dans des voies de signalisation immunitaires est augmentée. Suite à l’induction d’une réaction immunitaire dirigée contre le récepteur de la TSH, nous avons observé une réponse inflammatoire plus marquée dans les souris Thyr-IL-4 par rapport aux souris sauvages caractérisée par une infiltration leucocytaire CD45+ plus importante. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce travail de thèse consiste en l’étude de deux membres de la famille des NADPH oxydases :Duox1 et Duox2, et leurs partenaires DuoxA1 et DuoxA2. Exprimées dans la thyroïde, ces deux enzymes sont essentielles à la synthèse des hormones thyroïdiennes, puisqu’elles produisent du peroxyde d’hydrogène (H2O2), indispensable à l’organification de l’iodure par la thyroperoxydase. Duox1 et Duox2 sont également exprimées dans de nombreux autres tissus, comme les voies respiratoires et le tractus digestif, au sein desquels elles jouent un rôle primordial dans la défense de l’organisme contre les pathogènes. Afin d’être exprimées à la surface des cellules où elles sont actives, les protéines Duox nécessitent la présence de facteurs de maturation, appelés DuoxA1 et DuoxA2. Initialement identifiées comme des protéines résidentes du réticulum endoplasmique lors de leur découverte en 2006, les protéines DuoxA ont été détectées à la surface des cellules et pourraient dès lors former un complexe membranaire avec les protéines Duox. Les mécanismes d’activation des Duox par leurs facteurs de maturation DuoxA ne sont pas encore complètement connus à ce jour et la preuve formelle d’une interaction entre les deux partenaires à la surface des cellules était encore manquante lorsque ce travail de thèse a débuté. Nous avons généré des clones de cellules HEK293 Tet-On3G exprimant de manière constitutive les protéines Duox1 ou Duox2, ainsi que les protéines DuoxA1 ou DuoxA2 sous le contrôle d’un promoteur inductible à la doxycycline, et ce pour les 4 combinaisons suivantes :D1DA1, D2DA2, D1DA2 et D2DA1. Ces cellules ont permis d’étudier l’expression, la stabilité et l’activité des enzymes Duox en fonction de l’expression modulée de DuoxA. De plus, la présence d’étiquettes HA et V5 au niveau de l’extrémité NH2-terminale des protéines Duox et DuoxA, respectivement, a permis de comparer de manière fiable l’expression des protéines dans les différents types de clones et de mettre en évidence une interaction entre les deux partenaires. Nous avons confirmé l’efficacité de ce système cellulaire pour reconstituer l’expression des protéines DuoxA1 et DuoxA2, ainsi que la maturation et l’activité concomitantes des protéines Duox1 et Duox2. Lorsqu’elles sont exprimées seules, ni les protéines Duox ni les protéines DuoxA ne sont exprimées à la surface des cellules. Dans les cellules exprimant les partenaires non pairés (Duox1/DuoxA2 et Duox2/DuoxA1), l’expression des protéines à la surface des cellules est plus faible, tout comme la production d’H2O2 ionomycine-dépendante qui y est associée. En normalisant cette production d’H2O2 à l’expression des protéines Duox et DuoxA à la surface des cellules, nous avons montré que l'association Duox2/DuoxA2 était plus active que le partenariat Duox1/DuoxA1, ce qui justifie que Duox2/DuoxA2 constitue le système générateur majeur de peroxyde d’hydrogène dans la thyroïde. Par ailleurs, nous avons montré que l’H2O2 produit par les cellules exprimant le couple Duox2/DuoxA2 induisait des cassures double brins à l’ADN, après stimulation de l’activité de Duox2 par l’ionomycine et le PMA. Enfin, nous avons montré que les protéines Duox et DuoxA stabilisent leur partenaire respectif. Lorsqu’elles sont associées à leur partenaire pairé (D1DA1 et D2DA2), les protéines Duox et DuoxA sont plus stables et leur temps de demi-vie est augmenté, par rapport aux couples non pairés (D1DA2 et D2DA1). Nous avons montré une interaction spécifique entre les protéines Duox et DuoxA à la surface des 4 types de clones HEK293 Tet-On3G, à l’aide de la technique de Duolink®. Les complexes formés par les couples pairés se sont avérés encore une fois plus stables au cours du temps que les complexes non pairés. Finalement, nous avons démontré l’importance de la glycosylation des facteurs de maturation dans leur expression à la surface, ainsi que dans la maturation et l’activité des enzymes Duox. Ce travail de thèse a permis de démontrer que le système générateur d’H2O2 tel qu’il est retrouvé au pôle apical des thyrocytes est un complexe enzymatique membranaire constitué de la NADPH oxydase DUOX1/2 qui interagit avec les DUOXA1/2 respectivement. Le complexe DUOX2/DUOXA2 est le plus actif et des mutations dans l’un des partenaires sont fréquemment responsables d’hypothyroïdies congénitales. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

In this work, we have analysed the temporal dynamics of gut-dwelling bacteria and Borrelia in the gut of the deer tick Ixodes ricinus. Using quantitative PCR, we have shown that levels of the tick intestinal microflora are profoundly decreased at later stages of feeding on whole blood but not on serum. Even though we noted that host complement system manages to interfere with Borrelia viability in vitro, we did not see any effect of host complement on Borrelia acquisition in adult ticks in vivo. However, we revealed that host hemoglobin is essential for Borrelia proliferation in the tick gut. All together, these data imply that, during feeding, levels of gut-dwelling bacteria and Borrelia are determined by the host. While hemoglobin seems to be detrimental for gut-dwelling bacteria, Borrelia require it in order to proliferate. During off-host stage, we showed that levels of gut-dwelling microflora are regulated by an intestinal transmembrane enzyme Dual oxidase. In conclusion, we aimed, and mostly succeeded, to perform pilot experiments describing the biology of a complex process of regulating gut microflora in the vector Ixodes ricinus and extend it by its impact on Borrelia acquisition

1. Sphingolipid-cholesterol domains (lipid rafts) in normal human and dog thyroid follicular cells are not involved in thyrotropin receptor signalling. <p>Thyroid hormone regulates growth and development throughout the animal kingdom. The thyroid which secretes it, is controlled by TSH and its receptor TSHR. TSH and its receptor TSHR act through TSHR-coupled G proteins to control thyroid functions, with a stronger coupling of the TSHR with Gs protein than with Gq protein in human thyrocytes. Gq is not activated by TSH/TSHR in dog, whereas dog TSHR activates it in CHO transfected cells. To better understand TSHR and its downstream effectors G proteins, we attempted to answer the questions by the role of “lipid rafts/caveolae” in TSH action.<p>Lipid rafts/caveolae are sphingolipids-cholesterol-enriched microdomains on plasma membrane that have been proposed to play a role in signal transduction. By concentrating the signal molecules, lipid rafts/caveolae increase the efficiency of the interactions between the molecules and sequestrate them from the bulk membranes. The compartmentation of signal proteins in lipid rafts/caveolae might provide a possible explanation for the relationship between TSHR and G proteins in human and dog thyroctyes.<p>To answer these questions, we first tested the existence of such lipid microdomains in human and dog thyrocytes. By northernblot and RT-PCR of caveolin-1 mRNA, we demonstrated its existence in thyrocytes. The immunohistochemistry of caveolin-1 showed that caveolin/caveolae are present on the apical membrane of thyrocytes, opposite to the TSHR localization on the basolateral membranes. The isolation of lipid rafts/caveolae by Triton X-100/OptiPrep density experiments showed that TSHR and Gq are not in the rafts, even though other proteins such as insulin receptor, flotillin-2 and partially Gs are present in these lipid domains, as expected. Testing the function of the TSH receptor on its main cascade (Gs-Adenylyl cyclase-cAMP) after treating the follicles with Methyl β-cyclodextrin (a cholesterol chelator), we observed no modification of the cAMP levels by this treatment. This is in agreement with our conclusion that the TSHR-Gs-cAMP pathway does not involve the lipid rafts/caveolae domain.<p>TSH-activated signalling does not take place in these membrane domains. Therefore, the differences between species, concerning the TSHR-G proteins coupling cannot be explained by the presence of these membrane domains.<p>2. Species specific thyroid signal transduction: conserved physiology, diverged mechanisms<p>As mentioned above, Gq proteins are activated in human but not in dog thyroid, in response to TSHR. However the dog TSH receptor is able to activate Gq, as demonstrated in transfected CHO cells. Thus, different thyroid signal transduction pathways exist in different species. <p>In this study, we investigated the effects of TSH on its two signal transduction cascades, the cAMP pathway and the phospholipase C – IP3 – DAG pathway, as measured by cAMP levels and inositol phosphate generation. We also measured the effects of TSH and of agents stimulating specifically one of these cascades, forskolin for the cAMP pathway and Ca++ ionophore (ionomycin) and phorbolmyristate ester (TPA) for the phospholipase C pathway, on markers of thyroid hormone synthesis (H2O2 generation and iodide binding to proteins) and on thyroid hormone secretion in vitro in the various thyroids. <p>We demonstrated that in all species investigated, the TSH receptor activates both hormone synthesis and secretion. While in some species, including humans, rats and mice, the TSH receptor activates both the cAMP and phospholipase C– IP3 – DAG cascades, in others (e.g. dog) it only stimulates the first. The cAMP pathway activates the limiting step in thyroid hormone synthesis, the generation of H2O2, in dog, rat and mice but not in human, pig, horse and beef. Thus physiology remains but the pathways to achieve it differ. On a practical point of view, these results allow to choose adequate animal models for investigating different aspects of human thyroid signalling.<p><p>3. Duoxes -TPO association and its regulation in human thyrocytes: the thyroxisome<p>Duox (Dual Oxidase) and TPO (thyroid peroxidase) are the crucial enzymes for the thyroid hormones biosynthesis (T3/T4). TPO uses the hydrogen peroxide (H2O2) produced by Duox1 and Duox2 isoenzymes to covalently link oxidized iodide to tyrosines of thyroglobulin and couple the iodinated tyrosines to form triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4). An excess of H2O2 is considered to be toxic for cells although at appropriate concentrations H2O2 may carry out signalling functions. Even though thyrocytes show a better resistance to H2O2 than other cells, it would be beneficial for thyrocytes if Duox and TPO localize closely to increase the working efficiency and avoid an excessive H2O2 spillage. In this study, we explored the association of Duox with TPO, and the possible factors affecting their interaction in the human thyrocyte model. This association was established by co-immunoprecipitation approaches on purified plasma membranes from human thyrocytes and COS-7 transfected cells. <p>Our results show that 1) Duox and TPO localize closely at the plasma membranes of human thyrocytes, 2) this association is up-regulated through the Gq-PLC-Ca2+-PKC pathway and down-regulated through the Gs-cAMP-PKA pathway. 3) H2O2 directly increases the association of Duox and TPO. 4) Partial NH2- or COOH-terminal Duox1 and Duox2 proteins show different binding abilities with TPO in COS-7 transfected cells.<p>The association of the two proteins Duox and TPO thus supports our previous hypothesis of the thyroxisome, a pluriprotein plasma membrane complex in which elements of the iodination apparatus localize closely, thus optimizing working efficiency and minimizing H2O2 spillage. Defect in this association, independently of the catalytic efficiency of the enzyme, could therefore impair thyroid hormone synthesis and be harmful to thyroid cells, leading to thyroid insufficiency.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les espèces réactives de l’oxygène ont initialement été identifiées comme des produits délétères dérivés du métabolisme aérobie. Il est maintenant accepté que ces espèces sont produites de manière régulée par des enzymes et interviennent dans des fonctions cellulaires telles que la défense immunitaire, la signalisation intracellulaire, la biosynthèse des hormones et la modification de matrice extracellulaire. Les NADPH (Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate) oxydases (NOX) forment une famille d’enzymes transmembranaires capables de former de l’anion superoxyde (O2.-) par transfert d’électrons du NADPH à l’oxygène moléculaire (O2). DUOX1 et DUOX2 sont deux des sept membres composant cette famille qui génèrent directement de l’H2O2 comme produit de réduction de l’O2.<p>Initialement clonés à partir de la thyroïde dans notre laboratoire, les ADNc codant pour les protéines DUOX ont été identifiées dans d’autres tissus, comme par exemple la prostate ou l’épithélium respiratoire où DUOX1 est majoritaire. DUOX2 se retrouve également dans les glandes salivaires, dans la muqueuse rectale et tout le long du tractus digestif. D’autre part, un orthologue de DUOX, appelé Udx1, a été identifié en 2004 au niveau de la membrane ovocytaire chez l’oursin. Dans chacun de ces tissus, l’H2O2 produit par les protéines joue un rôle clef. <p>Le mécanisme d’activation de DUOX dans tous ces tissus n’a été identifié que récemment. En effet, pour être exprimé sous forme active à la surface cellulaire, les protéines DUOX nécessitent un facteur de maturation spécifique. Ces facteurs, appelés DUOXA1 et 2 pour « DUOX activator », suivent l’expression tissulaire de leur DUOX respectif. Nous avons montré que la région COOH-terminale de DUOXA1 est responsable de l’activité génératrice d’H2O2 de DUOX1. DUOX2 peut produire de l’H2O2 ou de l’O2.-. L’extrémité NH2-terminale de DUOXA2 est critique dans cette activité et détermine le type de dérivé oxygéné produit. Dans notre système, DUOXA2 n’est pas détecté à la surface cellulaire, sauf en cas de modification de son extrémité amino-terminale par l’addition d’un épitope. DUOXA1 peut être exprimé à la membrane plasmique mais sa présence n’est pas nécessaire au sein du complexe formé avec DUOX pour que ce dernier soit actif. Les facteurs de maturation jouent donc un rôle de protéine chaperonne, induisant la maturation et la translocation d’une protéine DUOX active à la surface cellulaire. <p>Dans la thyroïde, l’H2O2 produit par les protéines DUOX constitue le cofacteur de la thyroperoxydase catalysant l’oxydation de l’iode et le couplage de sa forme oxydée sur des résidus tyrosines de la thyroglobuline menant in fine à la synthèse des hormones thyroïdiennes T3 et T4 et leur relarguage dans la circulation sanguine. Plusieurs mutations dans le gène DUOX2 ont déjà été décrites chez des patients atteints de dyshormonogenèse transitoire ou permanente. Nous avons mis en évidence qu’une inactivation totale de la protéine DUOX2 était compatible avec un état hypothyroïdien peu sévère et transitoire, indiquant l’intervention probable de DUOX1 dans la synthèse des hormones thyroïdiennes. Le défaut génétique identifié est composé d’une délétion génomique partielle d’un allèle associée à une mutation faux-sens (G1518S) sur l’autre allèle du patient hypothyroïdien. Cette mutation, située dans le site catalytique de l’enzyme, mène à une abolition de l’activité de l’enzyme qui est néanmoins exprimée partiellement à la surface cellulaire. <p>Les messagers des DUOX ont été identifiés récemment dans les tractus digestif et respiratoire. Le rôle joué par l’H2O2 dans ces tissus semble avant tout être un rôle de défense contre les micro-organismes en mettant en jeu la lactoperoxydase oxydant le thiocyanate en composé bactéricide actif. Nous avons montré que l’H2O2 produit par DUOX exerce un effet répulsif sur les bactéries. En effet, l’invasion de cellules CHO exprimant de manière stable DUOX2 et DUOXA2 par Salmonella Typhimurium est diminuée lorsque la production d’H2O2 de ces cellules est stimulée. Cet effet répulsif constituerait un rôle primordial pour DUOX au niveau des muqueuses respiratoire et digestive.<p>Lors de la fertilisation, une explosion respiratoire a lieu et de l’H2O2 est produit. Cet H2O2 fourni à l’ovoperoxydase permettrait la formation d’une enveloppe rigide autour de l’ovocyte, bloquant ainsi l’entrée de spermatozoïdes surnuméraires. Ce phénomène a été largement étudié dans l’ovocyte d’oursin, dans lequel la NADPH oxydase responsable de la production d’H2O2 a été caractérisée: il s’agit de Udx1, l’orthologue de DUOX. Chez les mammifères, le phénomène existe mais le mécanisme est en grande partie inconnu. Nous avons montré que les ARNm des DUOX sont exprimés dans l’ovocyte humain ;ceci nous permet d’émettre l’hypothèse que l’inhibition de la polyspermie chez l’homme pourrait être similaire à celle de l’oursin. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La thyroïde capte et concentre l’iodure afin de produire les hormones thyroïdiennes T3 et T4. L’iodure est capté au pôle basolatéral du thyrocyte par le symporteur Na+/I- (NIS) et transporté jusqu'au pôle apical de la cellule où il est oxydé par la thyroperoxydase (TPO). La forme oxydée de l’iodure se lie à des résidus tyrosyls de la thyroglobuline (Tg), contenue dans la thyroïde, qui couplés donneront naissance à la T3 et la T4. L’iodation et le couplage sont possibles grâce à la thyroperoxydase et à la présence d’un système générateur d’H2O2. Celui-ci est composé des protéines à sept hélices transmembranaires Duox1 et Duox2 présentant 83% de similitude de séquence entre elles et possédant deux motifs EF-hand ainsi qu’un site de liaison au FAD et quatre sites de liaison au NADPH. Dans la thyroïde humaine, l’ARN messager de Duox2 est plus exprimé que celui de Duox1. Jusqu'il y a peu de temps, nous n'avions à notre disposition aucun anticorps spécifique de l’une ou l’autre des Duox. Il n'était donc pas possible de déterminer si cette différence d’expression se retrouve au niveau protéique. Les PCCl3 sont une lignée de thyrocytes de rat possédant un système générateur d’H2O2 fonctionnel. Contrairement aux cultures primaires de thyrocytes humains, ces cellules peuvent être transfectées facilement. L’introduction de siRNAs spécifiques de Duox1 ou Duox2 de rat, via des vecteurs plasmidiques, a permis de démontrer que le peroxyde d’hydrogène produit par les PCCl3 est principalement généré par Duox1. En effet, l’inhibition de l’expression de Duox1 est directement corrélée à la diminution de production d’H2O2. Cette inhibition n’interfère pas avec d’autres fonctions de la cellule thyroïdienne puisque les cellules invalidées pour Duox1 sont toujours capables de capter l’iodure. De plus, la réintroduction de l’expression de Duox1 par transduction lentivirale permet de restaurer la production de peroxyde d’hydrogène.<p>Faute d’une maturation correcte des protéines Duox à la membrane plasmique, il a longtemps été impossible de reconstituer un système générateur d’H2O2 actif par transfection de Duox1 et/ou Duox2 en système hétérologue. En 2006, les protéines activatrices des protéines Duox1 et Duox2, respectivement appelées DuoxA1 et DuoxA2, ont été identifiées. Leur co-expression avec les enzymes Duox permet à ces dernières de migrer à la membrane et d’être actives. La distribution tissulaire des protéines DuoxA est parallèle à celle des Duox. La découverte des protéines activatrices a permis d’étudier spécifiquement la régulation de l’activité de Duox1 et de Duox2. La production d’H2O2 de Duox1 est positivement régulée par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la protéine kinase A (PKA). La génération d’H2O2 de Duox2 est sous le contrôle de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ conduisant à l’activation de la protéine kinase C (PKC). L’activation de Duox2 est également corrélée à une modification de l’état de phosphorylation de la protéine. Dans les thyrocytes humains, le récepteur de la TSH est couplé aux protéines Gs et Gq/11. La TSH liée à son récepteur est donc capable d’activer la voie de l’AMPc et la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Dans les thyrocytes humains en culture primaire, l’activation de la PKA et de la PKC mène également à une augmentation de la phosphorylation des protéines Duox. <p>En conclusion :1) Duox1 est majoritairement responsable de la production d’H2O2 dans la lignée de thyrocytes de rat PCCl3 ;2) l’activité de Duox1 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est régulée positivement par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la PKA ;3) l’activité de Duox2 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est stimulée par la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ via des phosphorylations par la PKC ;4) les thyrocytes humains expriment les deux protéines Duox. La production d’H2O2 est augmentée suite à l’activation de la voie de l’AMPc et de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Les protéines Duox sont phosphorylées au niveau basal et cette phosphorylation est augmentée suite à l’activation de la PKA ou de la PKC.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Apoptosis-induced proliferation (AiP) is a compensatory mechanism to maintain tissue size and morphology following unexpected cell loss during normal development, and may also be a contributing factor to cancer growth and drug resistance. In apoptotic cells, caspase-initiated signaling cascades lead to the downstream production of mitogenic factors and the proliferation of neighboring surviving cells. In epithelial Drosophila tissues, the Caspase-9 homolog Dronc drives AiP via activation of Jun N-terminal kinase (JNK); however, the specific mechanisms of JNK activation remain unknown. Using a model of sustained AiP that produces a hyperplastic phenotype in Drosophila eye and head tissue, I have found that caspase-induced activation of JNK during AiP depends on extracellular reactive oxygen species (ROS) generated by the NADPH oxidase Duox. I found these ROS are produced early in the death-regeneration process by undifferentiated epithelial cells that have initiated the apoptotic cascade. I also found that reduction of these ROS by mis-expression of extracellular catalases was sufficient to reduce the frequency of overgrowth associated with our model of AiP. I further observed that extracellular ROS attract and activate Drosophila macrophages (hemocytes), which may in turn trigger JNK activity in epithelial cells by signaling through the TNF receptor Grindelwald. We propose that signaling back and forth between epithelial cells and hemocytes by extracellular ROS and Grindelwald drives compensatory proliferation within the epithelium, and that in cases of persistent signaling, such as in our sustained model of AiP, hemocytes play a tumor promoting role, driving overgrowth.