The inflammatory bowel diseases (IBD) are chronic, relapsing and remitting diseases of the gastrointestinal tract. There are two main types of IBD: Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The prevalence of IBD is highest in the western world, approximately 100-200 people per 100,000 are affected. In recent years there has been a marked increase in the incidence of CD and UC, in both adults and children (Henderson et al., 2012; Molodecky et al., 2012). This is particularly relevant in Scotland where recent research shows that there has been a 79% increase in the number of cases of paediatric IBD since the 1990’s (Henderson et al., 2012). A yeast 2 hybrid screen identified TLE1as an interacting partner of the known CD susceptibility gene; Nucleotide- binding oligomerisation protein 2 (Nod2). An initial genome wide association study (GWAS) also found an association between the rs6559629 SNP, located in Tle1 and ileal CD (p =3.1 x 10-5) and showed that carriage of the Tle1 risk allele increases the effects of Nod2 mutations in CD. TLE1 functions as a transcriptional co repressor in a variety of different cellular and developmental pathways The work presented in this thesis investigates the potential role of TLE1 in CD. This has been approached using four different strategies: sequencing TLE1 in CD patients and controls, analysing the effects of knocking down TLE1 on genome wide expression, investigating whether the known IBD susceptibility protein XBP1 binds to a predicted binding site in TLE1 and investigating TLE1 levels and localisation in human intestinal samples from CD patients and controls Sequencing TLE1 exons and introns 15/16 and 16/17 in a Scottish cohort of 24 CD patients and healthy controls identified a number of potentially pathogenic exonic and intronic SNPs. Two exonic SNPs and thirteen intronic SNPs were identified and these were further investigated in larger Scottish (203 CD cases, 190 HC) and European cohorts (6,333 CD cases and 15,056 HC) but were not present at statistically significantly different frequencies. Secondly, the effects of TLE1 knock down on genome wide expression were analysed using an Illumina HT12 expression chip. The results showed that TLE1 knock down significantly altered expression of 19 loci (Bonferroni) and 526 loci (FDR). Four of the 19 Bonferroni significant loci are potentially involved in CD: RIOK1 (p=4.3×10-3), SGPL1 (p=4.3×10-3), TUSC3 (p=1.8×10-2) and CCND1 (p=2.7×10-3). Furthermore, expression of SGPL1 and RIOK1 were shown to be differentially expressed at the mRNA level between inflamed patients and controls. The third approach investigates a predicted binding site for the known IBD susceptibility gene, XBP1 in TLE1 which was identified using the Haploreg program. This work shows, using chromatin immunoprecipitation, that exogenous XBP1 does not appear to bind to this predicted binding site. Finally, TLE1 expression was analysed in human intestinal resection samples from patients of known NOD2 status. This work shows that TLE1 and NOD2 are expressed in Paneth cells, however TLE1 expression is not altered in patients carrying CD associated NOD2 variants. In this work TLE1 sequence, expression and potential interacting proteins have been analysed. The results presented suggests multiple mechanisms by which TLE1 may be influencing susceptibility to CD including: the unfolded protein response (TUSC3), S1P signalling and ribosome biogenesis. They also implicate TLE1 in Paneth cell function alongside NOD2. The exact means by which TLE1 may play a role in IBD pathogenesis has yet to be fully elucidated.

Mon travail a porté sur la caractérisation des effecteurs toxiques et protéines d’immunité du T6SS Sci-1 d’Escherichia coli Entero-agrégatif, éléments de la lutte inter-bactérienne. Nous avons identifié en outre Tle1, un effecteur de toxine codé par ce groupe et montré que Tle1 possède des activités de phospholipase A1 et A2 requises pour détruire la cellule proie dans la compétition interbactérienne. L'auto-protection de la cellule attaquante est assurée par une lipoprotéine de membrane externe, Tli1, qui lie Tle1 dans un rapport stoechiométrique 1: 1 avec une affinité nanomolaire et inhibe son activité phospholipase. Il a été prédit que la protéine 435 provenant à partir d'un groupe de gènes T6SS1 de l'agent pathogène AIEC LF82 est une phospholipase de la famille d'effecteurs Tle3 avec une activité PLA1. Sa toxicité peut être neutralisée par la protéine d'immunité cognate 434 qui est un Tli3 putatif, en formant le complexe de protéine Tle3 - Tli3. Les deux protéines séparées et leur complexe ont ensuite été appelées protéines complexes Tle3AIEC, Tli3AIEC et Tle3AIEC - Tli3AIEC, respectivement. Afin d'étudier plus en détail le mécanisme de Tle3-AIEC et de Tli3-AIEC, nous avons réalisé l'expression, la purification, la caractérisation, la cristallisation des deux protéines et des études cristallographiques de rayons X préliminaires du complexe Tle3-AIEC/Tli3-AIEC afin de comprendre comment la protéine Tle3-AIEC reconnaît et se lie à son effecteur apparenté Tli3-AIEC et inhibe son activité. Les données préliminaires de diffraction des rayons X ont été recueillies à partir de cristaux Tle3AIEC-SeMet/Tli3AIEC à une résolution de 3,8 Å. / Here, we analyzed the Entero-aggregative Escherichia coli Sci-1 T6SS toxin effectors. We identified Tle1, a toxin effector encoded by this cluster and show that Tle1 possesses phospholipase A1 and A2 activities required for the inter-bacterial competition. Self-protection of the attacker cell is secured by an outer membrane lipoprotein, Tli1, which binds Tle1 in a 1:1 stoichiometric ratio with nanomolar affinity, and inhibits its phospholipase activity.The protein 435 from the pathogen AIEC LF82 has been predicted to be a phospholipase of the Tle3 effector family with PLA1 activity from a T6SS1 gene cluster. Its toxicity can be neutralized by the cognate immunity protein 434 that is a putative Tli3, by forming Tle3 - Tli3 protein complex. The two separated proteins and their complex were then called Tle3AIEC, Tli3AIEC and Tle3AIEC - Tli3AIEC complex proteins, respectively. In order to further investigate the related mechanism of Tle3AIEC and Tli3AIEC, we performed expression, purification, characterization, crystallization of the two proteins and preliminary X-ray crystallographic studies of the Tle3AIEC - Tli3AIEC complex in order to understand how Tle3AIEC protein recognizes and binds to its cognate Tli3AIEC effector and inhibits its activity. X-ray diffraction data were collected from selenomethionine-derivatize Tle3AIEC SeMet - Tli3AIEC crystals to a resolution of 3.8 Å.

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique de la paroi vasculaire à évolution lente et silencieuse dont les principaux facteurs de risque sont les dyslipidémies, l’obésité, le diabète et le tabagisme. Les macrophages jouent un rôle crucial dans le développement et la progression de cette maladie. Ils sont issus de la différentiation des monocytes et ils ne constituent pas une population homogène. On peut reconnaître au moins deux sous-populations: les macrophages pro-inflammatoire M1 et les macrophages alternatifs ou M2 qui montrent des propriétés anti-inflammatoires. Les fonctions des macrophages sont régulées par des facteurs de transcription. Mon laboratoire d’accueil a réalisé une analyse transcriptomique sur les facteurs de transcription régulés dans les macrophages alternatifs et parmi les plus induits dans les M2 il y a NOR1 (Neuron-derived Orphan Receptor 1) et TLE1 (Transducin Like Enhancer of Split 1). Pour cette raison nous les avons choisis pour en étudier le rôle dans les macrophages alternatifs humains. Etude de l’expression et rôle de NOR1 dans les macrophages alternatifsNOR1 fait partie de la famille NR4A3 ensemble à deux autres membres, Nurr1 et Nur77 : les trois sont exprimés dans les macrophages au sein de la lésion d’athérosclérose humaine. Cependant l’expression et le rôle de NOR1 dans les macrophages alternatifs n’a pas encore été étudié. En utilisant le model en vitro des macrophages primaires alternatifs humains polarisée en présence de l’IL-4, nous avons démontré que l’expression de NOR1 est induite dans les macrophages M2 chez l’homme, tandis que cette régulation n’est pas vérifiée chez la souris. D’ailleurs l’expression de NOR1 est plus importante dans les zones de la lésion atherosclerotique humaine enrichies par les macrophages CD68+MR+ . En utilisant l’approche de diminution de l’expression de NOR1 par un siRNA spécifique, nous démontrons que l’expression de certaines marqueurs de la polarisation alternative tels que Mannose Receptor (MR), Interleukin-1 receptor antagonist (IL1Ra), CD200 receptor (CD200R), coagulation factor XIII A1 polypeptide (F13A1), interleukin 10 (IL10) and the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPARg) sont diminués. De plus, l’expression et l’activité de la matrix metallopeptidase 9 (MMP9) sont induites suite au silencing de NOR1, cette régulation est confirmé par l’approche de surexpression de NOR1 par infection adenovirale. Ces données identifient NOR1 parmi les facteurs de transcription induits dans les macrophages alternatifs humains et permettent de mettre en évidence comme NOR1 soit capable de modifier le phénotype alternatif des macrophages.Etude de l’expression et fonctions potentielles de TLE1 dans les macrophages alternatifsTLE1, appartenant à la grande famille appelée chez la Drosophile avec le nome de Groucho, est connu pour être un répresseur incapable de se fixer directement à l’ADN et que par conséquence agit par interaction avec des autres facteurs de transcription. Aucune donnée n’est disponible quant à l’expression ou aux fonctions de TLE1 dans les macrophages. Nos résultats montrent que TLE1 est parmi les facteurs de transcription les plus exprimés dans les macrophages alternatifs humains. Cette régulation est aussi observée dans les macrophages de souris. Nous avons aussi montré que TLE1 est fortement exprimé dans les zones enrichies en macrophages M2 au sein de la plaque athérosclérotique humaine ainsi que dans les macrophages à phénotype mixte qui infiltrent le tissu adipeux (ATM). Nous avons caractérisé l’expression génique de TLE1 dans les patients obèses avec ou sans diabète et nous montrons que l’expression de TLE1 varie selon le statut métabolique du donneur. / Atherosclerosis is an inflammatory disease in which macrophages play a crucial role. Macrophages are derived from the differentiation of circulating monocytes and they are not an homogenous population. We can distinguish at least two types of macrophages: The pro-inflammatory M1 macrophages and the alternative anti-inflammatory macrophages M2. Functions of macrophages are controlled by transcriptional factors. My laboratory has realised a transcriptomic analysis of transcriptional factors differently regulated among RM and M2 macrophages. Among the most regulated transcriptional factors there is NOR1 (Neuron-derived Orphan Receptor 1) and TLE1 (Transducin Like Enhancer of Split 1). According to these data, we have chose these two transcriptional factors in order to determine their role in human alternative macrophages. The neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1) is induced upon human alternative macrophage polarization and stimulates the expression of markers of the M2 phenotypeThe neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1), together with Nur77 and Nurr1, is a member of the NR4A orphan nuclear receptor family expressed in human atherosclerotic lesion macrophages. However, the expression and the functions of NOR1 in human alternative macrophages have not been studied yet. Using an in vitro model of IL-4 polarized primary human alternative macrophages we demonstrate that NOR1 expression increased in alternative M2 macrophages in humans but not in mice. Moreover NOR1 expression is also most abundant in CD68+MR+ alternative macrophage-enriched areas of human atherosclerotic plaques in vivo. Silencing NOR1 expression in human alternative macrophages decreases the expression of a panel of M2 markers such as the Mannose Receptor (MR), Interleukin-1 receptor antagonist (IL1Ra), CD200 receptor (CD200R), coagulation factor XIII A1 polypeptide (F13A1), interleukin 10 (IL10) and the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPARg). Moreover, expression and enzymatic activity of MMP9 are induced by NOR1 silencing in M2 macrophages, a regulation confirmed in NOR1 gain of function experiments. These data identify NOR1 among the transcription factors induced during alternative differentiation of human macrophages and demonstrate that NOR1 modifies the alternative macrophage phenotype. Study of TLE1 expression and potential functions in human alternative macrophagesTLE1 is a member of the Groucho family and it is mainly described as a transciptional co-repressor. Although lacking in DNA binding activity of their own, this protein is recruited to gene promoters through interaction with other factors. No data are available regarding the expression or role of TLE1 in macrophages. Our results show that TLE1 is among the highest expressed transcriptional factors in human alternative macrophages. This regulation is verified also in murine macrophages. Histological analysis showed that TLE1 expression in human carotid atherosclerotic lesions in vivo co-localizes with the macrophage marker CD68 and the alternative maker MR. Q-PCR analysis of macrophage-enriched areas isolated by LCM showed that the mRNA levels of TLE1 are higher in zones of alternative CD68+MR+ macrophages compared to zones enriched in CD68+MR- macrophages. Moreover we have shown that TLE1 expression is higher in adipose tissue macrophages (ATM) compared to resting macrophages isolated from blood of the same patients. Finally we have characterised the mRNA expression of TLE1 in obese patients affected or not by diabetes and we have shown that TLE1 expression is influenced by the metabolic state of the patients.