Le blocage du processus de maturation est un élément central de l’oncogenèse des LAL-Tcomme en témoigne la forte corrélation observée entre le stade d’arrêt de maturation et le type d’oncogène dérégulé. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires responsables de l’arrêt de différenciation est une piste de choix dans la recherche de thérapie« différenciante ». Les LAL-T qui expriment les oncogènes TLX1/HOX11 et TLX3/HOX11L2correspondent à des lymphoblastes T ayant arrêté leur développement au stade cortical « préalphabeta». A ce stade, les thymocytes expriment une chaine TCRβ mais n’expriment pas la protéine TCRα. Une analyse moléculaire du locus TCRα montre que ce dernier n’est pas réarrangé dans ces LAL-T. Notre hypothèse est que les oncoprotéines TLX1 et TLX3bloquent l’expression et le réarrangement du locus TCRα et ainsi sont directement impliqués dans l’arrêt de la différentiation au stade pré-αβ. La mise en route des réarrangements aulocus TCRα est sous le contrôle d’un élément de régulation de la transcription situé en 3’ dulocus : l’enhancer alpha (Eα) dont l’activation nécessite les facteurs de transcription ETS1,RUNX1 et LEF1. Nous avons montré que l’expression de TLX1/3 réprime l’activité transcriptionnelle de l’enhanceosome Eα, que cette répression est dépendante de l’homéodomaine et qu’elle est spécifique et dose dépendante. De plus, nous avons mis en évidence que cette répression exercée par TLX1/3 est possible par une interaction protéine/protéine mise en évidence par Co-IP avec ETS1. Nous avons montré par EMSA que ETS1recrute TLX1/3 au niveau de Eα et confirmé ces résultats in vivo par la technique de ChIP.Par ailleurs, par une approche fonctionnelle de ‘knockdown’, nous avons utilisé des lentivirus contenant des vecteurs shRNAs de TLX1 et TLX3 afin d’éteindre leur expression dans les lignées cellulaires LAL-T qui l’exprime (respectivement ALL-SIL et DND-41). Ces expériences nous ont permis d’observer qu’au sein de ces lignées LAL-T TLX+, la down-régulation des oncogènes TLX1/3 est accompagnée d’une réactivation de l’Eα, traduite par la présence d’expression de transcrits germinaux du TCRα. L’ensemble de nos résultats suggère que TLX1/3 sont impliqués dans l’inhibition du locus TCRα et, par conséquence dans l’arrêt de différenciation observé dans ces leucémies / Acute lymphoblastic leukemias (ALL) are characterized by multi-step oncogenic processesleading to a cell differentiation arrest. Improved understanding of the underlying molecular mechanisms is a prerequisite for targeted therapeutic approaches. In T lineage ALLs, over expressionof the orphan homeobox factors, TLX1 or TLX3 is associated with a corticalthymic maturation arrest. We demonstrate that both TLX1 and TLX3 proteins interact withETS1, an essential component of the TCRα gene-enhanceosome, resulting in repression ofenhancer activity, blocked TCR-Jα rearrangement, and auto-extinction of clones with a TCRαenhancer driven TLX1-TCRδ chromosomal translocation. Our results identify novel functionsfor homeodomain proteins during T-cell development and imply that TLX1/3 exert an ETS1-dependent block to αβ T-cell maturation in T-ALLs, there fore representing promising targets for differentiation therapy

La maturation des cellules lymphoïdes T est un processus thymique hautement régulée où se mettent en place de manière ordonnée et successive les réarrangements des loci du TCRδ, γ, β et enfin α. Ceci nécessite des événements de recombinaisons somatiques V(D)J qui font intervenir les protéines RAG1/2, les séquences RSS jouxtant les segments V, D et J et des éléments régulateurs (enhancers) assurant une cis-régulation de ce processus. Le contrôle de la recombinaison V(D)J se fait grâce à divers mécanismes incluant des mécanismes épigénétiques, l'intervention de facteurs de transcription et la conformation/séquence des RSS (la règle 12/23 et la restriction B12/23). Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des proliférations malignes de blastes de phénotype thymique immature. Elles présentent des caractéristiques communes avec les progéniteurs T dont elles dérivent. Les anomalies cytogénétiques les plus fréquentes sont des translocations chromosomiques avec les loci TCRα/δ et TCRβ. La dérégulation, par translocation chromosomique, de nombreux oncogènes, comme le gène à homéodomaine TLX, ont été décrits dans les LAL-T. Les mécanismes moléculaires de ces anomalies, et notamment le rôle joué par la machinerie V(D)J ainsi que les mécanismes moléculaires intimes du blocage de différenciation observé restent cependant peu connus. Les leucémies, TLX1 ou TLX3 positive, se caractérisent par un blocage de maturation au stade cortical. Celui-ci se définit notamment par la présence de réarrangements complets du TCRβ, mais sans réarrangement du TCRα ni expression détectable du récepteur membranaire TCRαβ. Par un système de gène rapporteur, nous avons mis en évidence l'action répressive des protéines à homéodomaines TLX1 et TLX3 sur l'Enhancer Alpha (Eα). Puis l'interaction protéique entre ETS1 et TLX1/3 a été mise en évidence in vivo dans des lignées TLX positives. Enfin, nous montrons le recrutement des protéines TLX1/3, via ETS1, sur l'Eα. De manière intéressante, l'inactivation directe (knock-down par shRNA TLX1) ou indirecte (surexpression d'un TCRαβ exogène) de cette répression a pour conséquence une reprise de la différenciation T suivie d'une mort cellulaire par apoptose. De manière notable, cette apoptose est observé uniquement en condition de culture sur OP9DL1. Les cellules restent ainsi dépendantes du blocage de maturation dont la levée semble incompatible avec leur survie malgré l'accumulation de nombreux évènements oncogéniques. Parallèlement, en analysant les translocations TCRα/δ-TLX1 dans les LAL-T et dans le thymus d'individus sains, nous avons identifié un mécanisme d'auto-sélection clonal par addiction oncogénique. L'étude des translocations TCR-oncogènes sur une série de 280 LAL-T, nous a permis de confirmer la survenue des translocations TCRα/δ-oncogènes dans 19% de cas et TCRβ-oncogènes dans 14% des cas de LAL-T. Ce travail descriptif a permis l'identification de quatre nouveaux oncogènes impliqués dans les translocations TCR dans les LAL-T (LEF1, GNAQ, NKX2.4, IL2RB). Le clonage moléculaire des points de cassure a permis de mettre en évidence une absence d'intervention de la machinerie RAG au niveau de la cassure double brin de l'oncogène, soit une translocation de type 2. De façon intéressante, nous montrons un découplage entre le moment de survenue de la translocation (stade DN) et l'activation de l'oncogène (cortical, pré-αβ). Enfin nous avons mise en évidence un mécanisme de dérégulation oncogénique sensiblement différent en fonction du locus du TCR (α/δ ou β) impliqué dans la translocation. Cette étude descriptive, a permis de pointer l'implication fréquente des segments Dδ2 et Dδ3 dans les translocations chromosomiques et nous a amené à analyser les étapes les plus précoces de la thymopoïèse humaine. Nous avons pu mettre en évidence un ordonnement strict des réarrangements précoces de ce locus : Dδ2-Dδ3 précédant toujours les réarrangements impliquant les segments Jδ1. Le premier réarrangement Dδ2-Dδ3 à s'effectuer est détectable au stade de maturation Early Thymic Precursor ETP (CD34+ /CD1a-/CD7+/dim). De façon importante, nous montrons que le facteur de transcription RUNX1 est directement impliqué dans ce remaniement par sa fixation sur le Dδ2-23RSS et son interaction avec RAG1. Ainsi l'inactivation de RUNX1 dans des CD34+ de sang cordon, cultivés en condition de différenciation T a pour conséquence une absence totale de réarrangement Dδ2-Dδ3. L'ensemble de ces données met bien en évidence le rôle majeur de RUNX1 dans l'ordonnement précoce des réarrangements du TCRδ et pointe pour la première fois que ce locus, comme celui du TCRβ, est contrôlé par la restriction B12/23 chez l'Homme contrairement à ce qui est décrit chez la souris. Au final l'ensemble de ces expériences montre que l'oncogenèse et l'ontogénie T sont étroitement liées et qu'ainsi le blocage du processus de maturation physiologique T est un élément central du processus oncogénique dont les cellules leucémiques restent dépendantes pour leur survie. Ces résultats soulignent le potentiel de l'étude des LAL-T pour une meilleure compréhension de l'ontogénie T et ouvrent des perspectives originales de thérapie ciblée " différenciante ".