TSG101 is a tumor susceptibility gene, which exhibits many biological functions including the regulation of transcription, cell growth and differentation, protein trafficking and receptor recycling. Recent studies have revealed overexpression of TSG101 in human cancers of papillary thyroid carcinoma and breast cancer, whereas downregulation in the periphery of cancer tissue. These data indicated that the amount of TSG101 gene products might be relevant to tumor formation. Understanding the detail regulation of TSG101 gene expression might advance our knowledge on the processes of neoplastic conversion. In this regard, our lab have cloned and characterized upstream sequence of TSG101 transcription start site, and defined the region of -1~-436 as proximal promoter by luciferase reporter assay. Sequence analysis of this region using NSITE program on Softberry web site has revealed several transcription factor binding sites including MAZ, Sp1, ETF and ETS-1. Using EMSA and luciferase assay, we have demonstrated MAZ and Sp1 as major transcription factors regulate TSG101 proximal promoter. In this thesis, we advance our study to further explore the role of ETF and ETS-1 sites in regulation TSG101 promoter. We first cloned the region encompassing two ETS-1 sites in ¡V190~-1 region into pGL3-basic( -190/pGL3-basic ). The luciferase reporter assay of wildtype and mutant ¡V190/pGL3-basic plasmids further demonstrated important role of these ETS-1 sites. To explore detail contribution of the above mentioned transcription factor binding sites in regulation TSG101 promotor, we have made mutant reporter constructs containing different assortment of mutations in these binding sites, and assayed the effect of mutant on TSG101 promoter activity. The results showed that in cancer cell lines (COS-1, ARO and WRO) tested, Sp1, ETF, and ETS-1 binding sites are essential and they act co-operatively in regulating the activity of TSG101 proximal promoter. The results also indicated that Sp1 and ETS-1 were positive regulators, while ETF worked as a negative regulator.

Le gène B4GALNT2 code l’enzyme β1,4-N-acétylgalactosaminyltransférase II qui contrôle l’expression de l’antigène glucidique de groupe sanguin Sda (GalNAcβ1,4[Neu5Acα2-3]Galβ1-4GlcNAc-R). Cet antigène glucidique est aussi détecté dans les tissus humains, principalement dans le tractus gastro-intestinal. Il est exprimé dans le côlon sain et tend à disparaître dans le côlon cancéreux, alors que l’antigène sLex (Neu5Acα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc-R) normalement absent dans le côlon sain apparaît dans les cellules cancéreuses coliques. Cependant les mécanismes moléculaires permettant l’expression de l’antigène tumoral sLex au dépend de l’antigène Sda restent inconnus. Le gène B4GALNT2 gouverne l’expression de différents transcrits résultant de l’utilisation de deux sites d’initiation de la transcription différents localisés à 200 pb l’un de l’autre. L’utilisation alternative de deux premiers exons (E1s et E1L) conduit à la production de deux types de transcrits majoritaires, l’un court, l’autre long. Pour comprendre les mécanismes transcriptionnels qui régulent l’expression du gène B4GALNT2 dans le côlon, nous avons établi le profil d’expression du gène B4GALNT2 dans différentes lignées cellulaires et différents tissus humains par Q-PCR et nous avons entrepris une identification des régions génomiques régulatrices essentielles du gène B4GALNT2. La quantification relative de chaque type de transcrit indique que le transcrit court est le transcrit majoritairement exprimé dans les cellules coliques, dans le côlon et l’estomac dont l’expression diminue fortement dans le côlon cancéreux. Nous avons délimité une région minimale promotrice en transfectant transitoirement des constructions contenant différentes régions génomiques en amont du gène rapporteur de la luciférase, dans différentes lignées cellulaires, coliques saines ou non et gastriques. Des expériences de retard sur gel nous ont permis de mettre en évidence des complexes protéines-acide nucléique. Des sites de fixation potentiels pour des facteurs de transcription ont été déterminés par des analyses bioinformatiques de la région promotrice basale. La mutation de ces sites par mutagénèse dirigée nous a permis de déterminer l’implication de ces facteurs de transcription dans la régulation du gène B4GALNT2. Enfin, la fixation in cellulo de ces facteurs de transcription au niveau de la région promotrice minimale du gène B4GALNT2 a été confirmée par immunoprécipitation de la chromatine. Nos résultats suggèrent que le transcrit court du gène B4GALNT2 humain soit majoritairement exprimé dans le colon sain est régulé par un ensemble de facteurs de transcription tels que Ets-1, DMP1 ou Sp1. / The B4GALNT2 gene encodes the β1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase II enzyme that controls expression of the histo blood group antigen Sda (GalNAcβ1,4[Neu5Acα2-3]Galβ1-4GlcNAc-R). This carbohydrate antigen is detected in human tissues primarily in the gastrointestinal tract. It is expressed in healthy colon and tends to disappear in colon cancer, whereas the sLex antigen (Neu5Acα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc-R) normally absent in healthy colon appears in colic cancer cells. However, molecular mechanisms underpinning expression of sLex tumor antigen at the expense of Sda antigen remain largely unknown. The B4GALNT2 gene drives the expression of several transcripts with alternative first exon named E1S (Short) and E1L (Long) arising from the use of two different transcriptional start sites located 200 bp apart from each other. To understand the transcriptional mechanisms that govern B4GALNT2 gene expression in colon, we have established the B4GALNT2 transcript expression profile in various cell lines and tissues using Q-PCR and we have undertaken an identification of essential regulatory genomic regions of the B4GALNT2 gene. The relative quantification of each transcript indicated that the short transcript variant of B4GALNT2 is the major transcript expressed in colic cells, and in colon and stomach, and is dramatically reduced in cancer colon. We report on the delineation of a minimal promoter region using transient cell expression of genomic deletion constructs harboring the luciferase reporter gene in healthy colic (or not) and gastriccell lines. Electrophoretic Mobility Shift Assay experiences allowed us to highlight protein-nucleic acid interactions in this minimal promoter region. Transcription factor binding sites were determined by bioinformatics analysis of the minimal promoter region. Mutation of these sites by directed mutagenesis allowed us to determine their implication in the regulation of the B4GALNT2 gene. Finally, in cellulo fixation of these transcription factors to the minimal promoter region of the B4GALNT2 gene was confirmed by chromatin immunoprecipitation. Our data further suggest that the short B4GALNT2 transcript is predominantly expressed in healthy colon and is regulated by a combination of various transcription factors such as Ets-1, DMP1 or Sp1.

ETS1 est un facteur de transcription (FT) spécifique transposé dans les leucémies aigües. Le rôle essentiel d'ETS1 a été décrit au cours de l'hématopoïèse, plus particulièrement dans la différenciation lymphocytaire T. Son expression temporelle coordonnée participe au contrôle des transitions du stade double négatif (DN) CD4-/CD8- au stade double positif (DP) CD4+/CD8+jusqu'au stade simple positif (SP) CD4+ ou CD8+. Au cours de l'ontogenèse T, ETS1 transactive notamment l'expression des chaînes β et α du récepteur des cellules T (TCR). Nous avons criblé à grande échelle les cibles d'ETS1 aux stades DN et DP en ChIP-Seq, ainsi que desmarques histone et de l'ARN polymérase II (Pol II). Afin de faciliter nos analyses bioinformatiques, nous avons développé deux logiciels, CoCAS et AmaMineReg, qui permettent d'identifier plus facilement les cibles à partir de données brutes et de discriminer les vrais des faux positifs. Nous avons trouvé 5900 cibles en DN et 3400 en DP, principalement intergéniques dont 2000 sont communes, non caractérisées et correspondent aux gènes induits par la réponse immédiate à la signalisation TCR. Parmi les cibles différentiellement exprimées entre les deux stades, ETS1 active les gènes thymus-spécifiques et réprime les gènes hématopoïétiques non T spécifiques,en fonction de la co-occurrence avec le motif RUNX1. Nous avons également caractérisé très clairement le site de fixation en conditions natives, qui se révèle être CTTCCT.De plus, ETS1 co-localise avec des marques chromatines permissives aux régions inter- et intragéniques,caractérisées par un contenu GC, densité de motifs de fixation de FT (SFFT) et conservation inter-espèces accrus. / ETS1 is a specific transcription factor (TF) transposed in acute leukemias. key role of ETS1 wasdescribed during hematopoiesis, especially in T lymphocyte differentiation. Its temporal expression participates in the coordinated control of phase transitions from the CD4-/CD8-double negative (DN) stage to CD4+/CD8+ double positive (DP) up to CD4 or CD8 single positivestage (SP). During ontogenesis T ETS1 notably transactivates the expression of the alpha and beta chains of the T-Cell receptor (TCR). We performed genome-wide screening of ETS1 at both DN and DP stages via ChIP-Seq, as well as histone hallmarks and RNA polymerase II (PolII). To facilitate computational analysis we developed two new software suites, and COCASAmaMineReg, which allow easier identification of targets from raw data and to discriminate between true and false positives. We found 5900 targets in 3400 in DN and DP, mostly intergenic, out of which 2000 are common, and correspond to uncharacterized genes induced bythe immediate response to TCR signaling. Among targets differentially expressed between thetwo stages, Ets1 activates thymus-specific genes and represses non T-specific haematopoietic genes depending on the co-occurrence with the RUNX1 motif. We also very clearly characterized the binding site in native conditions, which proved to be CTTCCT. Furthermore, Ets1 colocalizes with permissive chromatin marks in inter-and intra-genic regions, characterized byincreased GC content, TF binding motifs (TFBS) density as well as inter-species conservation

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Ets-1 est un facteur de transcription, membre de la famille Ets, possédant un domaine de liaison à l’ADN hautement conservé, qui permet de reconnaître un cœur consensus GGAA/T présent dans le promoteur de ses gènes cibles. Ce facteur régule des gènes impliqués dans divers processus physiologiques tels que le développement, l’hématopoïèse et l’angiogenèse ou pathologiques notamment dans la progression et l’invasion tumorale. Malgré les efforts engagés par la communauté scientifique ces dix dernières années, il y a peu de stratégies de ciblage thérapeutique d’Ets-1 qui peuvent être transposées dans un cadre clinique. Compte tenu du fait que ce facteur de transcription est un marqueur de mauvais pronostic pour de nombreux carcinomes, dont entre autres, ceux du sein, des poumons ou encore du colon, la mise en évidence d’une stratégie de ciblage de son activité pro-tumorale pourrait constituer une avancée majeure dans la lutte contre le cancer. Ets-1 n’agit pas seule au niveau de ses promoteurs cibles mais en coopération avec une variété de co-régulateurs transcriptionnels. De plus, ce facteur est ciblé par de nombreuses voies de transduction des signaux cellulaires. L’identification de nouveaux partenaires interagissant avec Ets-1 devrait donc nous permettre de mieux appréhender ses réseaux de régulation afin de mettre au point une stratégie de ciblage de son activité. Dans ce but, nous avons mis en œuvre un système de purification de partenaires basé sur la forte affinité entre la biotine et la streptavidine, appelé « streptavidin pull-down ». Nous avons ainsi identifié de nouveaux partenaires protéiques potentiels. Parmi ceux-ci, nous avons pu confirmer comme partenaires interagissant avec Ets-1, des protéines de réparation de l’ADN tels que le complexe DNA-PK et la PARP-1. La poly(ADP-ribose) polymérase -1 (PARP-1) est une enzyme aux rôles multiples qui catalyse la poly(ADP-ribosyl)ation ou PARylation. Si elle fut identifiée à l’origine comme une protéine de réparation de l’ADN, de nombreux travaux ont montré ces dernières années qu’elle est un co-régulateur majeur des mécanismes de transcription. Nous avons démontré qu’Ets-1 interagit directement avec la PARP-1 et est PARylée par celle-ci. L’utilisation d’inhibiteurs catalytiques de la PARP-1 sur des cellules de lignées cancéreuses, exprimant Ets-1, a pour conséquences l’accumulation massive de ce facteur et une augmentation de son activité transcriptionnelle. Ceci suggère une implication de la PARylation dans la stabilité d’Ets-1 en lien avec sa dégradation par le protéasome. Cependant, sous inhibition de la PARP-1, l’accumulation d’Ets-1 est toxique pour la cellule cancéreuse. En effet, nous avons observé une forte augmentation des dommages à l’ADN qui corrèle avec la mort des cellules tumorales. Nous supposons qu’une activité non régulée d’Ets-1 est néfaste pour le devenir cellulaire d’autant plus quand une enzyme de réparation de l’ADN comme la PARP-1 est inhibée.Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation d’Ets-1 au sein des cellules cancéreuses en liaison avec les protéines de réparation de l’ADN. De plus, l’utilisation d’inhibiteurs de la PARP-1 pourrait constituer une nouvelle stratégie afin de cibler spécifiquement les tumeurs exprimant Ets-1. / Ets-1 is a transcription factor, member of the Ets family, having a well-conserved DNA binding domain which recognizes a core consensus sequence, GGAA/T, present in the promoter of target genes. This factor regulates genes involved in various physiological processes such as development, haematopoiesis, and angiogenesis and in pathological processes notably cancer progression and invasion. Despite the efforts of the scientific community during these past 10 years, few strategies for Ets-1 therapeutic targeting can be apply to clinical medicine. Considering the fact that this transcription factor is a poor prognostic marker for numerous carcinomas, such as breast, lung or colorectal cancers, the finding of a new strategy for targeting its activity in tumours could be a new advance in the fight against cancer. Ets-1 does not act alone on its target promoters but with a wide range of transcriptional co-regulators. Moreover, this factor is a target for many signal transduction pathways. Identifying novel proteins that interact with Ets-1 should permit a better understanding of its regulation networks to develop a strategy for targeting its activity. For this purpose, we used a purification system to identify interacting partners based on the strong affinity between biotin and streptavidin, called streptavidin pull-down. We thereby identified new potentials interaction partners. Among those, we could confirm as Ets-1 partners, DNA repair proteins, such as the DNA-PK complex and PARP-1. The poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is an enzyme with various roles that catalyses poly(ADP-ribosyl)ation or PARylation. Originally, it was identified as a DNA repair protein. Nevertheless, these past few years, many studies have highlighted its role as a co-regulator in transcription processes. We demonstrated that Ets-1 directly interact with PARP-1 and is PARylated in return. In Ets-1-expressing cancer cells, the catalytic inhibition of PARP-1 caused massive accumulation of this factor and enhanced its transcriptional activity. These results suggest that PARylation is involved in Ets-1 protein stability linked to its proteasomal degradation. Nevertheless, under PARP-1 inhibition, accumulation of Ets-1 is toxic for cancer cells. Indeed, we observed a strong increase in DNA damage that leads to cancer cells death. We assume that an unregulated activity of Ets-1 is harmful to the cellular outcome even more when a DNA repair protein such as PARP-1 is inhibited.These results give new insight into Ets-1 regulation in cancer cells linked to DNA repair proteins. Furthermore, our findings suggest that PARP-1 inhibitors would be useful in a new therapeutic strategy that specifically targets Ets-1-expressing tumours.

Le blocage du processus de maturation est un élément central de l’oncogenèse des LAL-Tcomme en témoigne la forte corrélation observée entre le stade d’arrêt de maturation et le type d’oncogène dérégulé. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires responsables de l’arrêt de différenciation est une piste de choix dans la recherche de thérapie« différenciante ». Les LAL-T qui expriment les oncogènes TLX1/HOX11 et TLX3/HOX11L2correspondent à des lymphoblastes T ayant arrêté leur développement au stade cortical « préalphabeta». A ce stade, les thymocytes expriment une chaine TCRβ mais n’expriment pas la protéine TCRα. Une analyse moléculaire du locus TCRα montre que ce dernier n’est pas réarrangé dans ces LAL-T. Notre hypothèse est que les oncoprotéines TLX1 et TLX3bloquent l’expression et le réarrangement du locus TCRα et ainsi sont directement impliqués dans l’arrêt de la différentiation au stade pré-αβ. La mise en route des réarrangements aulocus TCRα est sous le contrôle d’un élément de régulation de la transcription situé en 3’ dulocus : l’enhancer alpha (Eα) dont l’activation nécessite les facteurs de transcription ETS1,RUNX1 et LEF1. Nous avons montré que l’expression de TLX1/3 réprime l’activité transcriptionnelle de l’enhanceosome Eα, que cette répression est dépendante de l’homéodomaine et qu’elle est spécifique et dose dépendante. De plus, nous avons mis en évidence que cette répression exercée par TLX1/3 est possible par une interaction protéine/protéine mise en évidence par Co-IP avec ETS1. Nous avons montré par EMSA que ETS1recrute TLX1/3 au niveau de Eα et confirmé ces résultats in vivo par la technique de ChIP.Par ailleurs, par une approche fonctionnelle de ‘knockdown’, nous avons utilisé des lentivirus contenant des vecteurs shRNAs de TLX1 et TLX3 afin d’éteindre leur expression dans les lignées cellulaires LAL-T qui l’exprime (respectivement ALL-SIL et DND-41). Ces expériences nous ont permis d’observer qu’au sein de ces lignées LAL-T TLX+, la down-régulation des oncogènes TLX1/3 est accompagnée d’une réactivation de l’Eα, traduite par la présence d’expression de transcrits germinaux du TCRα. L’ensemble de nos résultats suggère que TLX1/3 sont impliqués dans l’inhibition du locus TCRα et, par conséquence dans l’arrêt de différenciation observé dans ces leucémies / Acute lymphoblastic leukemias (ALL) are characterized by multi-step oncogenic processesleading to a cell differentiation arrest. Improved understanding of the underlying molecular mechanisms is a prerequisite for targeted therapeutic approaches. In T lineage ALLs, over expressionof the orphan homeobox factors, TLX1 or TLX3 is associated with a corticalthymic maturation arrest. We demonstrate that both TLX1 and TLX3 proteins interact withETS1, an essential component of the TCRα gene-enhanceosome, resulting in repression ofenhancer activity, blocked TCR-Jα rearrangement, and auto-extinction of clones with a TCRαenhancer driven TLX1-TCRδ chromosomal translocation. Our results identify novel functionsfor homeodomain proteins during T-cell development and imply that TLX1/3 exert an ETS1-dependent block to αβ T-cell maturation in T-ALLs, there fore representing promising targets for differentiation therapy

Wang, Chengdong. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2013. / Includes bibliographical references (leaves 113-134). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.