Initialement développés pour leur action inhibitrice sur les lymphocytes T, les immunosuppresseurs affectent aussi les cellules dendritiques (CD). Nous avons précédemment montré que l’acide mycophénolique (MPA) induisait une résistance des CD humaines à la maturation, néanmoins son mécanisme d’action sur les CD reste méconnu. Ce travail de thèse montre que le MPA inhibe l’activation de p38MAPK et que cette propriété entraîne l’inhibition de la maturation phénotypique induite par le facteur nécrotique tumoral a (TNFa), la diminution de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et de la capacité allostimulatrice induite par le TNFa ou le lipopolysaccharide suggérant que l’inhibition de la synthèse de cytokines inflammatoires serait déterminante pour inhiber la capacité allostimulatrice. Nous rapportons également que le MPA inhibe la phosphorylation de ERK induite par le TNFa. Ainsi, l’action du MPA sur les CD s’exerce différemment selon l’environnement dans lequel se trouvent les CD. / Immunosuppressive drugs, initially developed to inhibit T cell activation, are also known now to affect dendritic cell (DC) functions. Previous works from our laboratory showed that mycophenolic acid (MPA) induced a resistance to maturation in human DC, however its mechanism of action in DC, remains elusive. In this study, we found that MPA inhibited p38MAPK phosphorylation independently. This p38MAPK inhibition resulted in a decrease phenotypic maturation upon tumor necrosis factor-a (TNF-a) stimulation and in a decrease in the pro-inflammatory cytokine secretion upon either lipopolysaccharide or TNF-a activation. MPA also decreased allostimulatory ability after both stimuli suggesting that inflammatory cytokine inhibition was predominant over co-stimulation marker reduction to inhibit the DC allostimulatory ability. We also showed that MPA only inhibited the TNFa-induced ERK phosphorylation. Thus, the microenvironnement of the DC might influence its ability to response to MPA.

Le facteur VIII (FVIII) joue un rôle essentiel dans la coagulation sanguine. Lorsque le FVIII fait génétiquement défaut, une pathologie hémorragique grave survient: l'hémophilie A (HA) congénitale. La complication majeure de la prise en charge de ces patients est l'apparition d'allo-anticorps (alloAcs) dirigés contre le FVIII thérapeutique administré. Dès lors, la seule thérapeutique efficace est l'induction de tolérance immune (ITI) qui vise à les éradiquer. Cependant, ce traitement échoue dans 30% des cas, sans qu'aucun facteur ne permette actuellement de prédire l'échec de ce traitement contraignant et coûteux. des facteurs immunologiques prédictifs de l'efficacité de l'ITI ont été recherchés chez 25 patients par analyse du répertoire épitopique et isotypique des Acs anti-FVIII à l'aide de la technologie x-MAP. Des biomarqueurs individuels (Acs anti-A2 et -A1 du FVIII), et des combinaisons originales ont été identifiés (0,841 < AUC < 0,946). Des manifestations hémorragiques peuvent apparaitre chez des patients non hémophiles, dues à des autoAcs anti-FVIII (HA acquise). Dans certains cas, les autoAcs se développent au moment du postpartum. peu de données sont disponibles sur cette réponse immune. Dans une seconde étude portant sur 73 cas, nous avons découvert un profil immunologique (autoAcs anti-A1) différenciant les HA du postpartum et les autres HA acquises. Les profils d'IgG anti-FVIII que nous avons établis s'avèrent prometteurs pour prédire l'efficacité de l'ITI et engendrer une cartographie précise de la réponse autoimmune chez les patients atteints d'HA acquise. / Factor VIII (FVIII) plays a critical role in blood coagulation. When FVIII s genetically defective, a serious hemorrhagic disease occurs: congenital hemophilia A (HA). The main complication of the management of these patients is the appearance of alloantibodies (alloAbs) directed against administred therapeutic FVIII. therefore, the only effective treatment is the immune tolerance induction (ITI), which aims to eradicate these alloAbs. However, this treatment fails in up to 30% of cases, without any factor currently able to predict the failure of this constraining and expensive treatment. Immunological factors predictive to the efficacy of ITI were investigated in 25 patients by analysis of epitopic and isotypic IgG profile of anti-FVIII Abs using x-MAP technology. Individual biomarkers (anti-FVIII A1 and -A2 Abs), and original combinations were identified (0,841 < AUC < 0,946). Hemorrhagic manifestations can occur in non-hemophiliac patients, due to anti-FVIII autoAbs (acquired HA). In some patients, the autoAbs appear in postpartum period but few data are available on the immune response due to the rarity of the disease. In a second study of 73 cases, we found a different immunological profile between patients with postpartum HA and the other acuired HA patients. IgG profiles of anti-FVIII we have established are promising for predicting the effectiveness of ITI and generate an accurate mapping of autoimmune response in patients with acquired HA.

Le système immunitaire comporte différents mécanismes de tolérance périphérique permettant de contrôler la réponse des cellules T CD8+. Dans certaines conditions encore peu connues, des cellules T potentiellement auto-réactives peuvent contourner les mécanismes de tolérance et se différencier en cellules effectrices, capables d’attaquer différentes organes de l’organisme, dans un processus d’auto-réactivité. En utilisant une souris transgénique exprimant un antigène modèle dans les cellules bêta du pancréas, j’ai étudié deux processus fondamentaux impliqués dans la différenciation des cellules T CD8+ en réponse aux antigènes du soi.1) Rôle de la translocation des lipopolysaccharides (LPS) dans la rupture de la tolérance. Nous avons préalablement démontré dans le laboratoire que des protocoles de lympho-déplétions, tels l’irradiation, étaient capables d’induire une rupture de la tolérance périphérique dans les cellules T CD8+. L’irradiation provoque la translocation des LPS des bactéries commensales vers la circulation sanguine, ce qui induit une activation du système immunitaire inné. Mes données ont montré que la translocation des LPS était corrélée avec l’activation systémique des cellules dendritiques (DC) CD11c+, en particulier les DC CD8+, responsables de la cross-présentation des auto-antigènes pancréatiques dans les tissus lymphoïdes. Alors que le traitement par des antibiotiques avant l’irradiation permet de prévenir la translocation des LPS, l’activation des DC n’est que partiellement affectée, et le développement de l’auto-immunité résultant d’une rupture de la tolérance périphérique des cellules T CD8+ ne peut pas être empêchée par le traitement.2) Visualisation de la coopération entre cellules T CD4+ et CD8+ effectrices dans la destruction des cellules bêta pancréatiques in vivo. En utilisant la microscopie intra-vitale à 2-photons, j’ai pu analyser, pour la première fois, la dynamiques des cellules T CD4+ et CD8+ auto-réactives exprimant un marqueur fluorescent, lors de l’infiltration du pancréas et du développement du diabète auto-immun. J’ai mis en évidence que l’infiltration des cellules T était accompagnée d’un remodelage de la matrice extracellulaire du pancréas, permettant la migration dirigée des lymphocytes. De plus, j’ai montré que l’arrêt MHC classe II-dépendant des cellules T CD4+, dû à des interactions avec des cellules présentatrices d’antigène recrutées au site d’inflammation et impliquant dans certains cas également les cellules T CD8+, contribuait au maintien des fonctions effectrices des cellules T CD8+. / The immune system has evolved multiple mechanisms of peripheral tolerance to control CD8+ T cell responses. Under particular conditions that are not yet well understood, potentially autoreactive T cells may override tolerance and differentiate into effector cells capable of targeting the own components of the organism resulting in self-reactivity. Utilizing transgenic mice expressing a model antigen in the beta cells of the pancreas, I have studied two important processes involved in CD8+ T cells differentiation in response to self-antigens. 1) Role of lipopolysaccharides (LPS) translocation in the breakdown of CD8+ T cell tolerance. It has been previously shown in our laboratory that lymphodepleting protocols, such as total body irradiation, promote breakdown of peripheral CD8+ T cell tolerance. Irradiation induces translocation of commensal bacteria LPS, a potent innate immune system activator, into the bloodstream. My data demonstrated that LPS translocation correlated with systemic activation of CD11c+ dendritic cells (DC), in particular CD8+ DC, responsible for pancreatic self-antigen cross-presentation, in lymphoid tissue. While antibiotic treatment of mice before irradiation prevented LPS translocation, DC activation was only partially affected, and onset of autoimmunity and breakdown of CD8+ T cell tolerance could not be prevented.2) Intra-vital visualization of effector CD8+ and CD4+ T cell cooperation in beta cell destruction in the pancreas. Using two-photon microscopy, I have been able, for the first time, to simultaneously analyze dynamics of fluorescently tagged autoreactive CD8+ and CD4+ T cells as they infiltrated the pancreas and induced autoimmune diabetes. I found that T cell infiltration promoted extracellular matrix remodeling in the pancreas, which in turn served as a scaffold for T cell migration. In addition, I showed that MHC class II dependent arrest of effector CD4+ T cells, due to interactions with antigen presenting cells, occasionally also implicating CD8+ T cells, provided help to effector CD8+ T cells in maintaining their effector functions.

Au cours du développement tumoral, le système immunitaire est constamment exposé aux antigènes tumoraux, mais le plus souvent dans un contexte non-inflammatoire qui favorise l'induction d'une tolérance envers ces antigènes. La tolérance peut être médiée par des mécanismes passifs (ignorance, anergie ou délétion des clones spécifiques de la tumeur) ou actifs, pour lesquels les lymphocytes T régulateurs (Tregs) jouent un rôle prépondérant. Les lymphocytes T (LT) CD4+ sont la source principale des Tregs mais présentent également des fonctions antitumorales directes et indirectes. Les connaissances actuelles sur le rôle des LT CD4+ au cours du développement tumoral proviennent en grande partie d'études de modèles murins de tumeurs transplantées. Cependant, l'inflammation initiée lors de l'inoculation de ces tumeurs due à une mort cellulaire importante favorise la présentation persistante par le MHC-II des antigènes tumoraux dans un environnement inflammatoire artificiel. Nous tentons ici de contourner ce problème en utilisant deux modèles murins différents: le premier est un modèle de tumeur transplantée dans lequel un néoantigène de classe II (DBY) est induit à distance du moment de l'inoculation de la tumeur. Le deuxième est un modèle d'adénocarcinome pulmonaire induit génétiquement exprimant l’epitope DBY, dans lequel la tumorigenèse est initiée par l'expression d’un oncogène associée à la délétion d’un gène suppresseur de tumeurs. La réponse antitumorale des LT CD4+ est suivie par le transfert de LT CD4+ spécifiques de DBY "Marilyn". Dans le modèle de tumeur transplantée, nous montrons que l'apparition d'un néoantigène dans une tumeur bien établie n'est pas ignorée par le système immunitaire. Bien au contraire, le néoantigène arrive au ganglion drainant la tumeur et induit une activation efficace des cellules Marilyn, qui prolifèrent, produisent de l'IFN-γ et recirculent jusqu'à la tumeur. En revanche, malgré une activation efficace des LT CD4+, les tumeurs ne sont pas rejetées. Dans le modèle génétiquement induit, nous montrons que des néoantigènes exprimés dès le début du développement tumoral, arrivent jusqu'au ganglion drainant la tumeur en quantité suffisante pour induire l'activation et la prolifération des LT CD4+, mais que cette activation est non-optimale et ne permet qu'une faible migration vers le site de la tumeur. En revanche, une partie des cellules Marilyn acquièrent l'expression de FOXP3 ainsi qu'une signature transcriptomique de Tregs et ce dès les stades précoces du développement tumoral, tandis que le reste des cellules Marilyn présentent un phénotype anergique (CD44hiCD73hiFR4hi). L'administration de CpG n'empêche pas la conversion en Treg des cellules Marilyn, malgré l'augmentation de la maturation des cellules dendritiques dans le poumon et le ganglion drainant la tumeur. La déplétion des Tregs de l'hôte en revanche inhibe cette conversion et favorise l'activation des cellules Marilyn en cellules effectrices compétentes, capables de migrer jusqu'au site tumoral. Enfin, les cellules Marilyn, lorsqu'elles sont activées hors du ganglion drainant la tumeur échappent à l'inhibition induite par la tumeur et deviennent des cellules effectrices compétentes. Ainsi, dans un modèle tumoral reproduisant le développement naturel progressif des tumeurs humaines, un état de tolérance est induit par la tumeur. Cette tolérance est dépendante des Tregs présents dans le ganglion drainant la tumeur, qui confèrent une tolérance aux LT CD4+ naïfs arrivant dans le ganglion. / During tumor development, the immune system is persistently exposed to tumor-associated antigens, frequently in a non-inflammatory context, favoring the establishment of tolerance. Passive (ignorance, anergy or deletion of tumor-specific T cells) or active mechanisms mediated by regulatory T cells (Tregs) may be involved in tolerance. CD4+ T cells are the main source of Tregs but they also display indirect and direct antitumor activity. So far, the contribution of CD4+ T cells during tumor development has been mainly addressed in murine transplanted tumor models. However, in these models the artificial inflammation associated with the presence of dying tumor cells at the time of tumor inoculation favors a long-lasting MHC-II-restricted tumor antigen presentation in an artificial inflammatory context. Here, we addressed this issue using two different models: a transplanted one in which the MHC-II neoantigen (DBY) is induced long after tumor implantation and a genetically engineered mouse (GEM) model of lung adenocarcinoma also expressing the DBY epitope, in which malignant transformation results from both the expression of an oncogene and the deletion of a tumor suppressor gene. Tumor-specific CD4+ T cell response was followed by transfer of naive DBY-specific Marilyn CD4+ T cells. In the transplanted tumor model, we found that the appearance of a neoantigen in established tumors was not ignored by the immune system. On the contrary, the neoantigen reached the tumor-draining lymph node (TdLN) and induced efficient priming of Marilyn cells that proliferated, produced IFN-γ, and recirculated to the tumor site. However, despite efficient induction of a tumor-specific CD4+ T cell response, tumors were not rejected. In the GEM model, we found that starting at the early tumor stages, neoantigens were expressed and reached the TdLN in sufficient amount to induce activation and proliferation of naive Marilyn T cells. However, this priming was suboptimal and resulted in a weak migration to the tumor site. Instead, some of the activated Marilyn cells acquired the expression of FOXP3 and a Treg gene signature while the remaining FOXP3- cells displayed a CD44hiCD73hiFR4hi anergic phenotype. CpG administration did not revert the Marilyn Treg conversion despite reinforcing dendritic cell maturation in the lung and the TdLN. Depletion of the host Treg compartment however, inhibited this conversion and favored Marilyn cell activation into full-blown effector cells able to migrate to the tumor site. Finally, Marilyn cells that were primed at distance of the TdLN, escaped tumor induced inhibition and became full effectors. Thus, in a tumor model reproducing the natural development of slowly growing human tumors, a tumor-associated dominant tolerance is established in the lymph node draining the tumor. This state of unresponsiveness is highly dependent on the presence of Treg cells in the TdLN, conferring tolerance to incoming tumor-specific naive CD4+ T cells.