LBP vermittelt im Wirtsorganismus die direkte Immunantwort auf bakterielle Liganden wie das Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen oder Lipopeptide von Gram-positiven Bakterien. In dieser Arbeit wurde die Funktionsweise von LBP weiter aufgeklärt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine natürlich vorkommende Mutation des LBP (c998t), die an Position 333 zu einem Austausch der Aminosäure Prolin zu Leucin führt, hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Struktur und Funktionalität des Proteins untersucht. Westernblot-Analysen des rekombinant hergestellten Proteins und humaner Seren von Mutationsträgern weisen auf einen Zerfall des mutierten Proteins hin. Es kommt zu einer Beeinträchtigung der Bindung bakterieller Liganden und einer deutlichen Reduktion der LBP-vermittelten Zytokinausschüttung von Immunzellen. Der hier untersuchte Polymorphismus hat eine Allelfrequenz von 0,072 in einer gesunden europäischen Population. Genotypanalysen von Patientengruppen zeigten, dass es durch die Mutation zu einer deutlich erhöhten Mortalität bei Patienten mit septischen Komplikationen und einer durch Gram-negative Erreger verursachten Pneumonie kommt. Unsere Ergebnisse zur eingeschränkten Funktion des LBP-c998t bieten eine erste Erklärung dafür, wie diese Mutation vermutlich die Fähigkeit, Krankheiten zu bewältigen, beeinträchtigt. Innerhalb dieser Arbeit ging es um die Analyse der Bindung von bakteriellen Liganden an LBP. Dabei wurde eine potentiell gemeinsame Bindungsstelle für Liganden untersucht, die von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien stammen und später von den Toll-like Rezeptoren (TLRs) 2 und -4 erkannt werden. Dazu wurden Bindungsversuche zwischen Lipopeptiden und LPS mit einer zweiten LBP-Variante (LBP-E94/95) durchgeführt. Beim LPS führt dies zu einem Bindungsverlust. Auch für die Lipopeptide war durch die Mutationen die Interaktion mit LBP beeinträchtigt, was die These einer gemeinsamen Bindungsstelle von TLR2- und TLR4-Liganden an das Protein weiter unterstützt. / LBP enhances the innate immune reaction against bacterial ligands like LPS from gram negative or lipopeptides from gram positive bacteria in the host. Here we investigated the function of LBP using two recombinant mutants of the protein. The first part of this work examines a natural occurring mutation of LBP (c998t) leading to an amino acid exchange of proline to leucine at position 333 with regard to the impact on structure and function of the protein. Western blot analyses of the recombinant protein and sera obtained from individuals differing in the LBP genotype indicate the disaggregation of the mutated protein. Thereby binding of bacterial ligands to LBP is diminished and the LBP mediated cytokine secretion of immune cells is reduced. The gene polymorphism leading to the occurrence of the mutation is present with an allelic frequence of 0.072. A recent study has shown that this LBP-SNP led to a higher mortality in patients with septic complications and gram negative pneumonia. The results presented here, showing the negative impact on the function of LBP due to the mutation, may therefore be a first explanation on how this mutation affects the ability of people to deal with disease. Within this work binding of ligands to LBP was also explored. It was investigated whether ligands which are later recognized by Toll-like receptors (TLRs) 2 and – 4 share a common binding site on LBP. Assays with immobilized lipopeptides and LPS were performed with a second mutated LBP (LBP-E94/95). LPS binding to LBP is diminished completely. Here we showed that binding of lipopeptide to LBP is affected likewise, furthermore supporting the hypothesis of a common binding site for TLR2- and TLR4- ligands.

Toll-like Rezeptoren (TLR) und Nod-like Rezeptoren (NLR) sind Muster-erkennende Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die bakterielle Zellwandbestandteile erkennen können. Interleukin (IL)-1beta ist ein streng reguliertes Zytokin. Durch eine erste Stimulation wird der TLR-Rezeptor ausgelöst und führt zur Expression des Vorläuferproteins proIL-1beta. Durch einen zweiten Stimulus wird ein zytoplasmatischer NLR-Rezeptor zur Caspase1-Aktivierung angeregt. Dies führt zur post-translationalen Reifung von proIL-1beta zu reifem IL-1beta und zur Aktivierung weiterer Mechanismen der Pathogen-Eliminierung während einer bakteriellen Meningitis. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die synergistische Beziehung zwischen TLRs und NOD2 in Bezug auf die IL-1beta-Sekretion in Astrozyten und Mikroglia untersucht. Primäre murine WT-Astrozyten und eine humane Zelllinie, die mit Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipopeptid sowie Muramyldipeptid (MDP) stimuliert wurden, zeigten signfikant erhöhte IL-1beta-Werte. IL-1beta war in NOD2-/- Astrozyten nicht erhöht. NOD2 trägt demnach als MDP-ausgelöster Rezeptor in Astrozyten, vermutlich zusammen mit dem Inflammasom-Komplex, zur Caspase-1-Aktivierung bei. In Mikrogliazellen lässt sich der bei Astrozyten gezeigte Effekt nicht reproduzieren. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass die TLR-abhängige IL-1beta-Antwort durch NOD2-Beteiligung in murinen und humanen Astrozyten synergistisch erhöht wird. In einem weiteren Versuchsteil wurde in primären murinen Peritonealmakrophagen von adulten Mäusen der TLR/NLR-Synergismus untersucht. Es stellte sich überraschenderweise heraus, dass weibliche NOD2-/- Mäuse zu einer synergistisch erhöhten IL-1beta-Sekretion fähig waren. SiRNA-Versuche mit in Östrogen vorinkubierten RAW264.7-NOD2-/- Zellen zeigten eine eindeutige Synergie der TLR4- und NOD2-Rezeptoren in der IL-1beta-Ausschüttung. Östrogen scheint weiblichen Individuen einen protektiven Vorteil vor Infektionen bei NOD2-Defizienz zu verschaffen. / Toll-like receptors (TLR) and nod-like receptors (NLR) are pattern-recognition receptors that recognize lipopolysaccharide (LPS), lipopeptides and myramyldipeptide (MDP) derived from bacterial cell wall. We focus our question on the regulation of the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-1beta during bacterial meningitis in primary murine astrocytes and microglia as well as cell lines and the synergism of TLR4 or TLR2 and NOD2 to amplify IL-1beta-expression. ProIL-1beta is expressed by TLR-stimulation and activation of NF-kB signal transduction. Through the activation of Caspase-1, possibly through NOD2 and the inflammasome, proIL-1beta is cleaved on post-translational level and obtains its activated status, leading to pathogen elimination during bacterial meningitis. Primary murine WT-astrocytes and a human cell line primed with LPS or lipopeptide and stimulated with MDP show significantly increased IL-1beta levels in the supernatant. NOD2-/- astrocytes do not show elevated IL-1beta levels. After screening of cytoplasmic proCaspase-1 and activated Caspase-1 by Western blot it became clear, that stimulation of NOD2 with MDP led to Caspase-1 activation and thus to IL-1beta maturation in primary murine WT-astrocytes. We demonstrate for the first time that the synergism between TLR4 and NOD2 leads to significantly elevated IL-1beta levels and that NOD2 is capable of activating caspase-1 in primary murine astrocytes. Another part of the work was to test the TLR/NLR-synergism on primary peritoneal macrophages from adult mice. Surprisingly, female NOD2-/- mice showed significantly elevated IL-1beta levels. SiRNA- and stimulation-experiments with RAW264.7-NOD2-/- cells pre-incubated in estrogen show a clear synergy in IL-1beta secretion through TLR4 and NOD2 receptors. Estrogen seems to protect females from infection when having a NOD2 deficiency.

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Einleitung: Das Darmmikrobiom, ein hochkomplexes Ökosystem an Mikroorganismen, geht eine lebenslange wechselseitige Beziehung mit seinem Wirt ein und beeinflusst wesentlich dessen Darmreifung post partum. Dazu interagieren Darmbakterien direkt und indirekt mit den intestinalen Stammzellen in den Krypten und regulieren Zellteilung und -differenzierung, wobei die Mechanismen nicht abschließend geklärt sind. Das Darmmikrobiom stellt eine wichtige Quelle für Mikroben-assoziierte molekulare Muster (MAMPs) dar, die von Mustererkennungsrezeptoren wie den Toll-like-Rezeptoren (TLR) auf den intestinalen Epithelzellen erkannt werden können. Somit können TLR auf den intestinalen Epithelzellen eine mögliche Verbindung zwischen Darmmikrobiom und Anpassungsreaktionen der Dünndarmmorphologie darstellen. Ziele der Untersuchung: Folgende Hypothesen sollten untersucht werden: 1. Die Anwesenheit von Darmbakterien beeinflusst die Morphologie der Dünndarmschleimhaut. 2. Diese Wirkung wird über Toll-like-Rezeptoren und den Hedgehog-Signalweg in Epithelzellen vermittelt. 3. Über diese Signalwege werden auch funktionelle Eigenschaften wie die Durchlässigkeit der Darmbarriere verändert. Tiere, Material und Methoden: Zur Untersuchung des Einflusses des Mikrobioms wurden in einem gnotobiotischen Mausmodell keimfreie Tiere mit dem minimalen mikrobiellen Konsortium Altered Schaedler Flora (ASF) besiedelt. Die ASF, welche sich aus acht definierten Bakterienarten zusammensetzt, wurde aus dem Caecum ASF-besiedelter C3H/HeNTac-Mäuse entnommen und männlichen und weiblichen keimfreien C57BL/6J-Mäusen appliziert. Der Nachweis der Bakterienspezies erfolgte aus bakterieller DNA, die aus frischen Kotpellets isoliert wurde. Der Vergleich wurde zwischen Dünndärmen ASF-kolonisierter Mäuse (n = 13), keimfreien Tieren (n = 8), konventionell gehaltenen (n = 7) und einer Gruppe Antibiotika-behandelter Mäuse (n = 8) durchgeführt. Zur Untersuchung des Einflusses der Toll-like-Rezeptoren TLR2 und TLR4 wurden epithelspezifische TLR2-defiziente (TLR2ΔIEC) bzw. TLR4-defiziente Mäuse (TLR4ΔIEC) verwendet und mit ihren jeweiligen Wildtyp-Geschwistertieren (WT) verglichen. Die morphometrische Eigenschaften des Dünndarms wurden anhand von histologischen Schnitten untersucht, die mit Hämatoxylin-Eosin oder Periodic-Acid-Schiff gefärbt waren. Hierbei wurden u.a. Mukosahöhe und Villuslänge gemessen sowie die Anzahl der Epithelzellen und Anzahl der Becherzellen pro Villus gezählt. Weiterhin wurden sowohl in Dünndarmgewebe als auch in isolierten intestinalen Epithelzellen mittels qPCR die mRNAExpression der Liganden des Hedgehog (Hh)-Signalwegs Sonic Hedgehog (Shh) und Indian Hedgehog (Ihh) sowie Hedgehog-Zielgene wie Glioma-associated oncogene transcription factor 1 (Gli-1), Patched-1 (Ptch-1) und Hedgehog Interacting Protein (Hhip) untersucht. In einem Teil der Tiere wurde der Hedgehog-Signalweg durch Applikation des Inhibitors Vismodegib gehemmt. Ein möglicher Einfluss auf die Permeabilität des Dünndarms wurde über die mRNA-Expression diverser Tight Junction-Proteine wie Occludin oder Claudin-4 sowie durch einen Permeabilitätsassay mit FITC-Dextran untersucht. Gruppenvergleiche wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und Holm-Šídák post-hoc Test bzw. zwischen den TLR2ΔIEC oder TLR4ΔIEC und WT-Mäusen mittels zweiseitigem ungepaarten t-Test durchgeführt. Unterschiede wurden bei P < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Ergebnisse: Durch den Nachweis aller acht Bakterienarten in den Kotproben der behandelten Mäuse konnte die erfolgreiche Übertragung der ASF auf die Empfängertiere nachgewiesen werden. Hinsichtlich Mukosahöhe, Villuslänge, Anzahl der Epithelzellen und der Becherzellen wiesen keimfreie gegenüber konventionell gehaltenen Mäusen signifikant höhere Werte auf. Die Kolonisierung mit ASF führte zu einer signifikanten Verringerung dieser Merkmale, so dass sie sich denen der konventionell gehaltenen Tiere annäherten. Die mRNA-Expression der Hh-Liganden Shh und Ihh war sowohl im Dünndarm als auch in isolierten intestinalen Epithelzellen ASF-besiedelter Mäuse signifikant erhöht. Die Hh-Zielgene Gli-1, Ptch-1 und Hhip waren auf mRNA-Ebene im Dünndarm ASF-besiedelter Mäuse ebenfalls signifikant höher exprimiert. Mukosahöhe, Epithelzellzahl und Villuslänge waren im Jejunum von TLR2ΔIEC- und TLR4ΔIEC-Mäusen gegenüber ihren WT-Geschwistern signifikant höher. Während bei TLR2ΔIEC-Mäusen außer Shh alle untersuchten Hh-Zielgene vermehrt exprimiert waren, waren bei TLR4ΔIEC-Mäusen die gleichen Gene signifikant weniger exprimiert. Wurde hingegen der Hh-Signalweg in konventionell gehaltenen C57BL/6-Mäusen mit Vismodegib inhibiert, waren der Expression der Hh-Zielgene, des TLR2 und des TLR4 signifikant vermindert. Sowohl die Hemmung des Hh-Signalwegs mit Vismodegib als auch das Fehlen der epithelialen TLR2 oder TLR4 bedingte eine verminderte Expression von Tight Junction-Proteinen, die mit einer erhöhten Darmpermeabilität einherging. Konventionell gehaltene Mäuse hatten sowohl gegenüber keimfreien als auch gegenüber mit ASF besiedelten Tieren eine signifikant niedrigere Expression von Tight Junction-Proteinen, was mit einer signifikant höheren Darmpermeabilität verbunden war. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieser Studie darauf schließen, dass Darmbakterien über intestinale TLR2 und TLR4 den Hh-Signalweg regulieren und darüber die Morphologie der Dünndarmmukosa als auch deren funktionelle Eigenschaften wie die Durchlässigkeit der Darmbarriere beeinflussen. / Introduction: The intestinal microbiome, a highly complex ecosystem of microorganisms, enters into a lifelong reciprocal relationship with its host and significantly influences its intestinal maturation postpartum. To this end, intestinal bacteria interact directly and indirectly with intestinal stem cells in the crypts and regulate cell division and differentiation, although the mechanisms are not conclusively understood. The intestinal microbiome represents an important source of microbeassociated molecular patterns (MAMPs) that can be recognized by pattern recognition receptors such as Toll-like-Receptors (TLRs) on intestinal epithelial cells. Thus, TLRs on intestinal epithelial cells may represent a potential link between gut microbiome and adaptation responses of small intestinal morphology. Aims: The following hypotheses should be investigated: 1. The presence of intestinal bacteria affects the morphology of the small intestinal mucosa. 2. This effect is mediated via Toll-like-Receptors and the Hedgehog signaling pathway in epithelial cells. 3. Functional properties such as the permeability of the intestinal barrier are also altered via these signaling pathways. Animals, materials and methods: To investigate the influence of the microbiome, germ-free animals were colonized with the minimal microbial consortium Altered Schaedler Flora (ASF) in a gnotobiotic mouse model. The ASF, which is composed of eight defined bacterial species, was harvested from the caecum of ASF-colonized C3H/HeNTac mice and applied to male and female germ-free C57BL/6J mice. Bacterial species were detected from bacterial DNA isolated from fresh fecal pellets. Comparison was made between small intestines of ASF-colonized mice (n = 13), germ-free animals (n = 8), conventionally housed (n = 7), and a group of antibiotic-treated mice (n = 8). To investigate the influence of Toll-like-Receptors TLR2 and TLR4, epithelial-specific TLR2-deficient (TLR2ΔIEC) or TLR4-deficient mice (TLR4ΔIEC) were used and compared with their respective wild-type (WT) littermates. Morphometric characteristics of the small intestine were examined using histological sections stained with hematoxylin-eosin or periodic-acid-Schiff. Here, mucosa height and villus length were measured, and the number of epithelial cells and number of goblet cells per villus were counted, among other measurements. Furthermore, mRNA expression of the ligands of the Hedgehog (Hh) signaling pathway Sonic Hedgehog (Shh) and Indian Hedgehog (Ihh) as well as Hedgehog target genes such as Gliomaassociated oncogene transcription factor 1 (Gli-1), Patched-1 (Ptch-1) and Hedgehog Interacting Protein (Hhip) were examined in small intestinal tissue as well as in isolated intestinal epithelial cells by qPCR. In a subset of animals, Hedgehog signaling was inhibited by application of the inhibitor Vismodegib. A possible influence on small intestinal permeability was investigated by mRNA expression of various tight junction proteins such as Occludin or Claudin-4 and by permeability assay with FITC-dextran. Group comparisons were performed with a one-way analysis of variance (ANOVA) and Holm-Šídák post-hoc test or between the TLR2ΔIEC or TLR4ΔIEC and WT mice by two-tailed unpaired t test. Differences were considered statistically significant at P < 0.05. Results: Detection of all eight bacterial species in the fecal samples of treated mice demonstrated successful transfer of ASF to recipient animals. In terms of mucosa height, villus length, number of epithelial cells and goblet cells, germ-free mice had significantly higher values compared to conventionally housed mice. Colonization with ASF significantly decreased these characteristics to approach those of conventionally housed animals. The mRNA expression of the Hh ligands Shh and Ihh was significantly increased in the small intestine as well as in isolated intestinal epithelial cells of ASF colonized mice. The Hh target genes Gli-1, Ptch-1, and Hhip were also significantly higher expressed at the mRNA level in the small intestine of ASF-colonized mice. Mucosa height, epithelial cell number, and villus length were significantly higher in the jejunum of TLR2ΔIEC and TLR4ΔIEC mice compared with their WT littermates. Whereas in TLR2ΔIEC mice, except for Shh, all Hh target genes examined were increased in expression, the same genes were significantly less expressed in TLR4ΔIEC mice. In contrast, when the Hh pathway was inhibited with Vismodegib in conventionally maintained C57BL/6J mice, the expression of Hh target genes, TLR2, and TLR4 were significantly decreased. Both inhibition of the Hh pathway with Vismodegib and absence of epithelial TLR2 or TLR4 caused decreased expression of tight junction proteins, which was associated with increased intestinal permeability. Conventionally housed mice had significantly lower expression of tight junction proteins compared with both germ-free and ASF-populated animals, which was associated with significantly higher intestinal permeability. Conclusions: In summary, the results of this study suggest that intestinal bacteria regulate the Hh signaling pathway via intestinal TLR2 and TLR4 and thereby influence the morphology of the small intestinal mucosa as well as its functional properties such as intestinal barrier permeability.

Eine Melanomerkrankung im metastasierten Stadium ist heute noch eine nicht heilbare und in den meisten Fällen tödlich verlaufende Erkrankung. Über 50% der Patienten mit metastasierendem malignen Melanom entwickeln Lungenmetastasen. Nach dem Auftreten von Lungenmetastasen beträgt die durchschnittliche Überlebenszeit noch 7,3 Monate. Demnach ist die Entwicklung von Therapiestrategien notwendig, um das Fortschreiten von Tumormetastasen oder sogar deren Entstehung zu verhindern. Die lokale Stimulation der angeborenen Immunabwehr durch Behandlung mit Toll-like-Rezeptor-Agonisten käme hierfür in Frage. Inhalative Behandlungen mit Immunmodulatoren, wie sie für IL-2 beschrieben wurden, könnten insbesondere für die Behandlung pulmonaler Metastasen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das pulmonale angeborene Immunsystem im Mausmodell durch den TLR2/6-Agonisten MALP-2 stimuliert und die Auswirkung dieser Immunstimulation auf experimentell induzierte pulmonale Melanommetastasen untersucht. Intratracheale Instillationen von 0,5 µg MALP-2 führten zu starker Einwanderung neutrophiler Granulozyten (6-fach) und Makrophagen (3,4-fach) in die Lunge von C57/BL6-Mäusen. Innerhalb von 24 h war das Maximum der Immunzelleinwanderung erreicht. Der Leukozyteneinstrom fiel dann innerhalb von 72 h wieder auf das Ursprungsniveau zurück. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass MALP-2 auch zu einer deutlichen Steigerung der Expression von VCAM-1 in pulmonalen Blutgefäßen führt. In vitro Experimente zeigten, dass dieses Adhäsionsmolekül die Bindung von B16-F10-Melanomzellen vermitteln kann.  Außerdem führte die MALP-2-Behandlung weder in vitro noch in vivo zu einer signifikanten Steigerung der Fähigkeit von Immunzellen, B16-F10-Melanomzellen zu lysieren.  So konnte, im Gegensatz zu Rückschlüssen aus früheren Publikationen, trotz der ausgeprägten Stimulation des pulmonalen Immunsystems und unabhängig vom Applikationsregime durch MALP-2 vor oder nach Tumorinokulation im Mausmodell keine signifikante Änderung der pulmonalen Metastasen erreicht werden. Durch Markierung von Melanomzellen, die stabil mit Green fluorescent Protein transfiziert waren, war es möglich, Melanomzellen kurz nach Tumorzellaussaat zu untersuchen. Eine lokale TLR2/6-Aktivierung durch MALP-2-Instillation 24 h vor Tumorinokulation führte aber in vivo zu keiner Beeinflussung des pulmonalen Melanomzellarrests im Mausmodell. Außerdem konnte gezeigt werden, dass auch das „Boostern“ des Immunsystems durch wiederholte intratracheale MALP-2-Applikation an bereits etablierten pulmonalen Metastasen zu keiner Änderung des klinischen Gesamtresultates führt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass diese teilweise unerwarteten Ergebnisse deutlich machen, dass klinische Vorhersagen bezüglich immunmodulierender Therapien mit Vorsicht zu stellen sind, insbesondere, da multiple, sich wechselseitig beeinflussende Effekte durch die Immunstimulantien selbst das Gesamtergebnis einer Tumortherapie beeinflussen können.