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Hintergrund: Die bakterielle Meningitis hat eine Letalität von 10-20%. Das Hirnödem stellt bei ca. 14 % der Erkrankten eine prognosebestimmende Komplikation dar. Ein aktueller Forschungsansatz umfasst die Bedeutung der Aquaporine für die Entwicklung, Aufrechterhaltung und Resorption der verschiedenen Hirnödemformen, insbesondere des zytotoxischen und des vasogenen Hirnödems. In dieser Arbeit wird untersucht, ob Aquaporin 1 und Aquaporin 4 im Liquor von Patienten mit bakterieller und viraler Meningitis, im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe, nachweisbar sind. Zudem sollte geklärt werden, ob sich hieraus eine differenzialdiagnostische Einordnung ergibt und sich Rückschlüsse auf das Ausmaß eines Hirnödems und das Outcome schließen lassen. Methode: Aquaporin 1 und 4 wurde im Liquor und im Serum von Patienten mit bakterieller (nCSF = 35 , nSerum = 20) und viraler  (nCSF = 22) Meningitis sowie in einer Kontrollgruppe (nCSF = 27 , nSerum = 12) mittels eines (kommerziell erhältlichen) ELISAs bestimmt. Klinische Daten und Routinelaborparameter wurden verglichen und in Korrelation zu den Aquaporinkonzentrationen gesetzt. Ergänzend wurde bei einer Untergruppe der Patienten mit bakterieller Meningitis (n = 8) eine neuropsychologische Testung durchgeführt. Ergebnisse: Aquaporin 1 und 4 ließen sich in allen Gruppen nachweisen, ca. 40% der Aquaporin 4 Konzentrationen lagen unterhalb der Nachweisgrenze des ELISAs. Im Gruppenvergleich aller drei Gruppen unterschieden sich die Aquaporin 1-Konzentrationen (p = 0,0001) und die Aquaporin 4-Konzentrationen (p = 0,035) im Liquor signifikant voneinander. In der Gruppe der Patienten mit bakterieller Meningitis ließ sich eine negative Korrelation zwischen Aquaporin 1 und 4 im Liquor feststellen (r = - 0,519, p = 0,002). Aussagekräftige Korrelationen der klinischen Daten, der liquor- und laborchemischen Parameter sowie der neuropsychologischen Testergebnisse zu den Aquaporin 1- und Aquaporin 4-Konzentrationen fanden sich nicht.  Diskussion: In dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass Aquaporin 1 und Aquaporin 4 im Liquor (und Serum) von Patienten mit einer bakteriellen und viralen Meningitis sowie in einer Kontrollgruppe nachweisbar sind. Für Aquaporin 1 und Aquaporin 4 im Liquor fanden sich signifikante Unterschiede im Vergleich aller Gruppen im Kruskal-Wallis-Test. Rückschlüsse bezüglich einer differenzial-diagnostischen Einordnung zur viralen Meningitis konnten nicht gezogen werden. Aussagen zur Schwere eines Hirnödems und zur Prognose können mit den vorliegenden Daten nicht getroffen werden. Der Ursprung der gemessenen Aquaporine bei Patienten mit Meningitis lässt sich in dieser Arbeit nicht abschließend klären und bedarf weiterer Grundlagenforschung.

Die bakterielle Meningitis ist trotz der Anwendung modernster Antibiotika mit einer hohen Letalität und neurologischen Spätkomplikationen verbunden. Ein entscheidendes Ereignis ist dabei der Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die genauen Mechanismen, die zu ihrer Schädigung führen, sind bis heute unklar. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob lebende Pneumokokken in einem Zellkulturmodell der BHS zu einer apoptotischen Zellschädigung von zerebralen Endothelzellen, als wichtigstem zellulären Bestandteil der BHS, führen und damit zu ihrer strukturellen Schädigung beitragen. Mittels verschiedener Detektionsmethoden (TUNEL, Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie) konnte nachgewiesen werden, daß Streptococcus pneumoniae zu einem apoptotischen endothelialen Zelltod führt. Eine Beteiligung von Caspasen konnte weder mit direkter Aktivitätsmessung noch mittels Inhibitionsexperimenten oder dem Nachweis von Caspase-spezifischen Substraten gezeigt werden. Insgesamt sind die Morphologie der Zellkerne und die spezifische Degradation der endothelialen DNS hinweisend für einen Apoptosis-Inducing-Factor-vermittelten Zelltod ohne Caspasenbeteiligung. Diese Form des Zelltodes ist bereits in anderen Zellmodellen, bisher jedoch nicht bei zerebralen Endothelzellen beschrieben worden. Auf Seiten des Bakteriums konnten Wasserstoffperoxid und Pneumolysin als Auslöser der Apoptose identifiziert werden. Die zytotoxische Potenz des Pneumolysins ist dabei an dessen Poren-formende Aktivität gebunden. Die Ergebnisse sind von potentieller klinischer Relevanz, da es bei einer Bakteriämie und während der Invasion der Pneumokokken in das ZNS zu einem direkten Kontakt zwischen Bakterien und zerebralen Endothelzellen kommt und sich daraus eine Möglichkeit zur Entwicklung adjuvanter Therapien ergeben könnte. / Despite sufficient antibiotic treatment, pneumococcal meningitis has remained a disease associated with high mortality and neurological sequelae. The disruption of the blood brain barrier (BBB) is regarded a key event in the initial phase of pneumococcal meningitis. However, the exact molecular mechanisms involved in this process are still unknown. The aim of this study was to determine if living pneumococci are able to induce apoptosis in cerebral endothelial cells - the main cellular component of BBB - and therefore might contribute to its damage. Using several different detection methods (TUNEL, fluorescence and electron microscopy), induction of apoptotic cell death of endothelial cells by pneumococci could be verified. An accompanying activation of caspases was not detectable, despite the use of specific detection techniques such as inhibition experiments, direct enzyme measurements and detection of caspase-specific protein cleavage. These results as well as the specific nuclear morphology and degradation of endothelial DNA suggest an involvement of the mitochondrial protein Apoptosis inducing factor (AIF). This is the first time this specific form of apoptotic, AIF-driven cell death has been described to be engaged in endothelial cells. On the part of the bacterium, pneumolysin and hydrogen peroxide were identified as the two main inducers of apoptosis. The cytotoxic potency of pneumolysin is related to its pore-forming activity. These results are of clinical relevance since pneumococci are known to reside in close proximity to cerebral endothelial cells during bacteriemia and their entry into the CNS. These findings could contribute to the development of adjuvant treatment of bacterial meningitis.

Toll-like Rezeptoren (TLR) und Nod-like Rezeptoren (NLR) sind Muster-erkennende Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die bakterielle Zellwandbestandteile erkennen können. Interleukin (IL)-1beta ist ein streng reguliertes Zytokin. Durch eine erste Stimulation wird der TLR-Rezeptor ausgelöst und führt zur Expression des Vorläuferproteins proIL-1beta. Durch einen zweiten Stimulus wird ein zytoplasmatischer NLR-Rezeptor zur Caspase1-Aktivierung angeregt. Dies führt zur post-translationalen Reifung von proIL-1beta zu reifem IL-1beta und zur Aktivierung weiterer Mechanismen der Pathogen-Eliminierung während einer bakteriellen Meningitis. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die synergistische Beziehung zwischen TLRs und NOD2 in Bezug auf die IL-1beta-Sekretion in Astrozyten und Mikroglia untersucht. Primäre murine WT-Astrozyten und eine humane Zelllinie, die mit Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipopeptid sowie Muramyldipeptid (MDP) stimuliert wurden, zeigten signfikant erhöhte IL-1beta-Werte. IL-1beta war in NOD2-/- Astrozyten nicht erhöht. NOD2 trägt demnach als MDP-ausgelöster Rezeptor in Astrozyten, vermutlich zusammen mit dem Inflammasom-Komplex, zur Caspase-1-Aktivierung bei. In Mikrogliazellen lässt sich der bei Astrozyten gezeigte Effekt nicht reproduzieren. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass die TLR-abhängige IL-1beta-Antwort durch NOD2-Beteiligung in murinen und humanen Astrozyten synergistisch erhöht wird. In einem weiteren Versuchsteil wurde in primären murinen Peritonealmakrophagen von adulten Mäusen der TLR/NLR-Synergismus untersucht. Es stellte sich überraschenderweise heraus, dass weibliche NOD2-/- Mäuse zu einer synergistisch erhöhten IL-1beta-Sekretion fähig waren. SiRNA-Versuche mit in Östrogen vorinkubierten RAW264.7-NOD2-/- Zellen zeigten eine eindeutige Synergie der TLR4- und NOD2-Rezeptoren in der IL-1beta-Ausschüttung. Östrogen scheint weiblichen Individuen einen protektiven Vorteil vor Infektionen bei NOD2-Defizienz zu verschaffen. / Toll-like receptors (TLR) and nod-like receptors (NLR) are pattern-recognition receptors that recognize lipopolysaccharide (LPS), lipopeptides and myramyldipeptide (MDP) derived from bacterial cell wall. We focus our question on the regulation of the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-1beta during bacterial meningitis in primary murine astrocytes and microglia as well as cell lines and the synergism of TLR4 or TLR2 and NOD2 to amplify IL-1beta-expression. ProIL-1beta is expressed by TLR-stimulation and activation of NF-kB signal transduction. Through the activation of Caspase-1, possibly through NOD2 and the inflammasome, proIL-1beta is cleaved on post-translational level and obtains its activated status, leading to pathogen elimination during bacterial meningitis. Primary murine WT-astrocytes and a human cell line primed with LPS or lipopeptide and stimulated with MDP show significantly increased IL-1beta levels in the supernatant. NOD2-/- astrocytes do not show elevated IL-1beta levels. After screening of cytoplasmic proCaspase-1 and activated Caspase-1 by Western blot it became clear, that stimulation of NOD2 with MDP led to Caspase-1 activation and thus to IL-1beta maturation in primary murine WT-astrocytes. We demonstrate for the first time that the synergism between TLR4 and NOD2 leads to significantly elevated IL-1beta levels and that NOD2 is capable of activating caspase-1 in primary murine astrocytes. Another part of the work was to test the TLR/NLR-synergism on primary peritoneal macrophages from adult mice. Surprisingly, female NOD2-/- mice showed significantly elevated IL-1beta levels. SiRNA- and stimulation-experiments with RAW264.7-NOD2-/- cells pre-incubated in estrogen show a clear synergy in IL-1beta secretion through TLR4 and NOD2 receptors. Estrogen seems to protect females from infection when having a NOD2 deficiency.

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Die bakterielle Meningitis (BM) ist trotz antibiotischer Therapie eine Erkrankung mit einer hohen Mortalität und Morbidität. Kopfschmerzen und Meningismus sind Hauptsymtome und ein klinischer Hinweis für die Aktivierung trigeminaler Fasern. Ziel dieser Arbeit war es zu prüfen ob die freigesetzten Neuropeptide einen proinflammatorischen Effekt auf zerebrale Endothelzellen, einen wesentlichem Bestandteil der Blut-Hirn-Schranke haben. Wir verwendeten primär kultivierte zerebrale Kapillarendothelzellen (BMEC) der Ratte und als Stimulus Neuropeptide und/oder Pneumokokkenzellwände (PCW). Beide Neuropeptide, CGRP mehr als SP, verstärken den Effekt von PCW auf die mRNA Expression und Freisetzung von TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-10 und MIP-2 aus den BMEC. CGRP und SP haben nur eine geringe Wirkung. PCW regulieren die Dichte der CRLR (CGRP1-R) bzw. NK-1 Rezeptoren und erklären damit die kostimulatorische Wirkung. Zudem untersuchten wir den Effekt von PCW und/oder CGRP auf die Adrenomedullin (AM)- Synthese. AM ist ein vasodilatorisch wirkendes Peptid, dass vorwiegend in Endothelzellen konstitutiv gebildet wird und am CRLR Rezeptor wirkt. PCW und CGRP verstärken die Synthese von AM. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PCW zur Hochregulation von Neuropeptidrezeptoren führt und CGRP und SP über diese Rezeptoren einen modulatorischen Effekt auf die Zytokinproduktion in BMEC haben. Ein genaues Verständnis dieser Interaktionen könnte die Entwicklung immunmodulatorischer Interventionen und damit eine Verbesserung der Prognose der bakteriellen Meningitis bewirken. / Despite antibiotic treatment bacterial meningitis is still associated with a high mortality and morbidity. Headache and meningismus as key symptoms, provide clear evidence for the activation of trigeminal nerve fibers. Aim of the study was to test whether the released neuropeptides have a proinflammatory effect in cerebral endothelial cells the major compartment of the blood brain barrier. We used primary brain microvascular endothelial cells of the rat (BMEC) which were stimulated with CGRP, SP and/or pneumococcal cell walls (PCW). Both neuropeptides CGRP more than SP enhanced PCW-induced mRNA expression and the release of TNF-alpha, IL-1-beta, IL-6, IL-10 and MIP-2. Neuropeptides alone were not able to induce these cytokines. PCW upregulate the density of CRLR receptor and regulate the NK-1 receptor and therefore may explain the costimulatory effect. Furthermore the effect of PCW and/or CGRP on adrenomedullin synthesis in BMEC was investigated. Adrenomedullin is a vasodilatatory peptide, which is constitutivly produced by endothelial cells and act on the CRLR receptor. PCW as well as CGRP enhance the synthesis of AM. Our data suggest that PCW upregulate neuropeptide receptors and modulate via these specific receptors the cytokine production. A detailed understanding of these interactions may open new immunmodulatory interventions and therefore may contribute to a better prognosis of bacterial meningitis.

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