SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatases, SHIP2, has been established as a regulator of the insulin cascade, of cell adhesion and spreading, actin structures, remodelling and cytoskeletal organization. However, the molecular mechanisms underlying these processes still needed additional investigations. Among different regulatory mechanisms, protein-protein interaction play an essential role. To better understand the molecular mechanism of SHIP2 in signalling pathway as well as to reveal novel roles of SHIP2, a two-hybrid was performed to search for SHIP2 protein interactors. JNK-interacting protein 1 (JIP1) and intersectin 1 (ITSN1) were two of the newly identified protein partners of SHIP2. In this thesis, we characterized the associations of SHIP2 with JIP1 and ITSN1 in different aspects as identifying the interacting domain involved, biochemical function regulations and cellular biological roles.<p><p>The JIP scaffold family of proteins associate with MAPK, MAPKK and MAPKKK creating functional signaling modules to control the specificity of signal transduction. JIP1 is characterized as a scaffold protein assembling JNK, MAPK kinase 7 (MKK7), mixed lineage kinase (MLK), dual leucine zipper-bearing kinase (DLK). It thus enhances the selectivity and effectiveness of kinase activation during JNK signaling. In this thesis, the SHIP2-JIP1 interaction has been confirmed both in overexpression system in COS-7 and CHO-IR cells, and in native cells of COS-7. Both the proline-rich (PR) domain (residues 359-487) and PTB domain of JIP1 participated in this interaction. Overexpression of SHIP2 in COS-7 cells up-regulated JIP1-mediated JNK activation and the tyrosine phosphorylations of both JIP1 and MLK3. These effects were independent of SHIP2 catalytic activity. By the use of kinase inhibitors, we showed that Abl and Src family tyrosine kinases might be implicated in the regulation of JIP1 tyrosine phosphorylation. The residue Y270 of JIP1, a potential target of Abl tyrosine kinase, was shown to be involved in SHIP2-increased JIP1 tyrosine phosphorylation. In an in vitro assay, JIP1 negatively regulated the catalytic activity of SHIP2. In addition, upon the stimulation of okadaic acid, the overexpression of SHIP2 caused less viability of COS-7 cells. These data provide a new molecular link between SHIP2 and JIP1-mediated JNK pathway, and may help explain the biochemical mechanisms of SHIP2 in cellular apoptosis, as well as in insulin pathway.<p> <p>Another protein partner, ITSN1, is a multi-domain protein which plays a role in endocytosis, MAPK signalling and actin cytoskeleton. The interaction between SHIP2 and ITSN1 was confirmed in overexpression systems in COS-7 cells, as well as at the physiological concentration with the endogenously expressed proteins in C2C12 and COS-7 cells. EGF stimulation did not modulate the association of SHIP2 and ITSN1. ITSN1-SH3D, A, C and E domains interacted with the C-terminal part of SHIP2 with the binding affinity as SH3D>SH3A>SH3C>SH3E. Upon the stimulation of EGF, the expression of SHIP2 may recruit ITSN1 short form (ITSN1-S) to cell membrane. The ITSN-mediated ERK1/2 and JNK activations in response to EGF were not modulated when SHIP2 or catalytic mutant of SHIP2 or TSHIP2 was overexpressed. The link between SHIP2 and ITSN may provide one of the molecular mechanisms used by SHIP2 to participate in receptor endocytosis regulation.<p><p>In conclusion, our data of the associations of SHIP2 with JIP1 and ITSN1 provide evidence for potential novel biochemical mechanisms of SHIP2 to be implicated in JNK pathway as well as EGF receptor endocytosis. JIP1 and ITSN1, which are both implicated in the JNK pathway, may also have a link through the common protein partner SHIP2, giving rise to potential interesting study goal. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans le thyrocyte normal, la TSH active une voie dépendante de l’adénylyl cyclase/AMPc, qui représente l’une des trois voies mitogéniques de la thyroïde. La cascade de signalisation de la TSH diffère des deux autres voies dans sa capacité à induire à la fois la prolifération et la différenciation, comprenant la synthèse et la sécrétion des hormones thyroïdiennes. Identifier les acteurs de cette cascade de signalisation, ainsi que les interactions entre effecteurs, est donc très important pour la compréhension de la fonction de la cellule thyroïdienne. C’est dans ce cadre que s’insère notre travail au cours duquel nous nous sommes intéressés au récepteur de la TSH ainsi qu’à une protéine récemment identifiée dans le laboratoire et dont l’expression est modulée en réponse à la TSH dans la thyroïde :C3VS. <p>C3VS est une protéine qui présente six motifs ankyrine et une tirette à leucine et dont la fonction était inconnue à l'époque. Dans un premier temps, nous avons contribué à l’obtention de la séquence codante complète du C3VS de chien, puis, l'identification des partenaires d'une protéine pouvant aider à caractériser sa fonction, nous nous sommes proposé de rechercher les partenaires potentiels de la région N-terminale de C3VS par la méthode double-hybride. Nous avons étudié la distribution tissulaire et la régulation par la TSH de différents partenaires isolés. Parmi eux, SUG1, une ATPase du protéasome 26S, a été étudiée plus avant mais l’interaction n’a pas pu être confirmée par "GST-pulldown assay". Simultanément, une remise en question de la position de la méthionine initiale de C3VS, couplée à une impossibilité d’exprimer la protéine en cellules COS par transfection mettait en péril le travail. En l’absence de plus d’arguments fonctionnels permettant d’orienter l’étude des positifs, cette partie du travail a été suspendue au profit de notre étude sur le récepteur de la TSH. L'activation de cascades différentes dans le thyrocyte humain et canin pouvant être due à l'action de protéines intracellulaires, nous avons tenté de rechercher par double-hybride des partenaires protéiques autres que les protéines G pour le récepteur de la TSH. Nous avons ainsi identifié PRA1 mais nous n’avons pas pu confirmer l'interaction entre les deux protéines par "GST-pulldown assay". Pour tenter de comprendre le rôle de cette interaction, nous avons réalisé des essais fonctionnels en transfectant des cellules pour évaluer l'implication de PRA1 sur la synthèse d’AMPc. Ces expériences ne nous ont pas permis de montrer un rôle pour PRA1 au niveau de la cascade, mais en revanche, nous avons mis en évidence le fait que la co-transfection de deux ADNc codant pour des protéines membranaires sature la machinerie de traduction et diminue l'expression du RTSH. <p>Dans une deuxième partie de notre travail, nous avons étudié la 5-phosphatase SHIP2, dont l’implication dans la cascade de réponse à l’insuline était suggérée, entre autres, par le travail d’Isabelle Vandenbroere qui avait montré l’interaction de cette protéine avec CAP et c-Cbl. Nous avons développé au laboratoire la culture de la lignée pré-adipocytaire 3T3-L1 et étudié la localisation de SHIP2 au niveau des rafts de ces cellules. Nous avons montré que SHIP2 n’y est pas recrutée. CAP et c-Cbl ne semblent pas non plus y être recrutées, tandis que nous y avons détecté le récepteur de l'insuline. La localisation de différentes protéines impliquées dans la cascade de l'insuline dans les rafts est une question controversée à l’heure actuelle et notre étude montre que l’implication fonctionnelle de SHIP2 dans la cascade de l'insuline n'est probablement pas dépendante des rafts.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Deux symbioses végétales partagent la même niche écologique, leur hôte, une légumineuse. Ces deux associations mutualistes sont la mycorhize arbusculaire (MA) et la symbiose Rhizobium/légumineuse. Chacune de ces relations symbiotiques, prise individuellement, peuvent contrôler leur propre colonisation par des mécanismes d'autorégulation. Ce contrôle exclusif s'effectue par rétroaction systémique et parviendrait à limiter le coût en carbone pour l'hôte. En vue d'étudier la restriction exercée par une plante hôte sur le degré de colonisation mycorhizienne et rhizobienne, la légumineuse Medicago sativa a été cultivée en chambre bicompartimentée (Split-Roots). Ce dispositif expérimental a permis de séparer en deux parties distinctes le système racinaire de M. sativa. Le but recherché par ces expérimentations était de vérifier à distance l'autorégulation au sein d'une symbiose sur la seconde partie du système racinaire et de mettre en évidence une régulation négative croisée entre deux symbioses différentes. En effet pour la première fois, il est démontré que l'autorégulation systémique n'est pas l'action d'une seule symbiose sur elle-même, mais que par des signaux communs entre les deux symbioses, il existe une régulation négative croisée entre elles. Cette approche permet d'examiner, sous un nouvel angle, la régulation de l'établissement d'une symbiose par une autre symbiose. Dans ces conditions, nos résultats montrent l'existence d'un lien évident de signalisation entre les deux symbioses végétales. Dans le cas précis d'une pré-colonisation de M. sativa par Sinorhizobium meliloti, les facteurs Nod se sont révélés impliqués au niveau de l'autorégulation. Dans cet exemple, les flavonoïdes exsudés par M. sativa sont non seulement reconnus par les Rhizobia mais aussi par le Glomus mosseae. Ces résultats représentent un acquis important pour l'interprétation de la signalisation au niveau de l'autorégulation des deux symbioses à l'étude. Par ailleurs, l'analyse des exsudats racinaires de M. sativa par chromatigraphie liquide à haute performance (HPLC) montre une modification significative du patron des isoflavonoïdes lorsque cette plante est soumise à différents contrôles dérivant d'autorégulations et de régulations négatives croisées. De plus il est loisible d'observer une variation similaire de patrons de flavonoïdes suite à l'application de facteurs Nod. En soi, d'une façon plus exacte, tous ces traitements provoquent une réduction marquée de la formononétine et de l'ononine. Ces deux isoflavonoïdes semblent être d'excellents candidats comme molécules ± signal ¿ dans la régulation à distance pour les deux symbioses végétales. De plus, l'application externe de ces deux isoflavonoïdes peut normalement restaurer la nodulation et la mycorhization. Les flavonoïdes jouent un rôle clef dans la formation de la symbiose MA chez M. sativa. Lors d'expériences avec diverses souches de G. mosseae nous avons cherché à montrer qu'il y avait bien une régularité et une constance dans le patron de flavonoïdes considérés comme molécule signal et cela peu importe les besoins métaboliques divergents associés à ces souches de G. mosseae. Selon cette prémisse nous concluons que leur production n'est pas subordonnée aux besoins métaboliques des souches fongiques. La constance de l'augmentation ou la réduction du patron de ces flavonoïdes pourraient bien être le résultat du rôle de flanovoïdes impliqués pour des mécanismes de signalisations qui accompagnent nécessairement l'établissement de la symbiose MA.

La signalisation cellulaire regroupe l'ensemble des mécanismes biologiques permettant à une cellule de répondre de façon adaptée à son microenvironnement. Pour ce faire, de nombreuses réactions biologiques entrent en jeux avec un important enchevêtrement, créant ainsi un réseau dont le comportement s'apparente à un système complexe. Le compréhension de la réponse cellulaire à une stimulation passe par le développement conjoint des techniques d'acquisition de données, et des méthodes permettant de formaliser ces données dans un modèle. C'est sur ce dernier point que s'inscrivent les travaux exposés dans cette thèse. Nous présentons ici deux approches visant à répondre à des questions de natures différentes sur la signalisation cellulaire. Dans la première nous utilisons un modèle différentiel pour étudier le rôle d'un nouvel interactant dans la voie canonique du TGF-beta. Dans la seconde nous avons exploré la combinatoire de la signalisation cellulaire en développant un formalisme discret basé sur les transitions gardées. Cette approche regroupe l'interprétation de la base de données Pathway Interaction Database dans un unique modèle dynamique de propagation du signal. Des méthodes de simulations et d'analyses inspirées des techniques de vérification de modèles telles que l'atteignabilité et l'invariance ont été développées. En outre, nous avons étudié la régulation du cycle cellulaire en réponse à la signalisation, ainsi que la régulation des gènes de notre modèle en comparaison avec des données d'expressions.