La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) de l’adulte constituent des affections sévères du poumon distal, avec un pronostic sombre pour les patients. A ce jour, aucun traitement n’est réellement efficace. De manière intéressante, une hypoxie alvéolaire est retrouvée dans ces pathologies.La thérapie cellulaire utilisant des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) pourrait représenter un intérêt thérapeutique chez l’Homme. Cependant, leurs mécanismes d’action sont multiples et encore mal définis. Aussi, nous avons testé in vitro l’hypothèse selon laquelle les CSMh pourraient exercer un effet cytoprotecteur paracrine sur les cellules épithéliales alvéolaires (CEA) soumises à l’hypoxie.Dans une première étude, nous avons montré qu’une exposition prolongée à l’hypoxie telle que celle rencontrée au cours de la FPI induisait des modifications phénotypiques des CEA primaires de rat, évocatrices d’une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). On observe une perte progressive d’expression des marqueurs épithéliaux (TTF1, AQP5, ZO-1 et E-Cadhérine), couplée à l’apparition tardive de marqueurs mésenchymateux (α-SMA et Vimentine). Ces modifications phénotypiques s’accompagnent de l’expression dès les premières heures d’hypoxie de facteurs de transcription impliqués dans la TEM (SNAI1, TWIST1 et ZEB1) ou induits par l’hypoxie (HIF-1α et HIF-2α), et de protéines induisant la TEM (TGF-β1 et CTGF). La co-culture des CEA avec des CSMh en fond de puits prévient les modifications phénotypiques induites par l’hypoxie ainsi que l’expression des facteurs pro-TEM TWIST1, ZEB1, TGF-β1 et CTGF. Cet effet bénéfique des CSM est en partie expliqué par la sécrétion d’un facteur de croissance épithélial, le KGF.Dans une deuxième étude, nous avons confirmé que les CEA entraient en apoptose en condition hypoxique, via l’induction de deux voies de signalisations hypoxiques pro-apoptotiques. D’une part, les facteurs de transcription induits par l’hypoxie HIF sont stabilisés, et une cible pro-apoptotique, Bnip3, est induite. D’autre part, l’hypoxie induit une accumulation d’espèces réactives à l’oxygène délétère pour la cellule, perturbant l’équilibre redox de la cellule, endommageant l’ADN, et conduisant à l’apoptose. Cette accumulation pourrait résulter notamment d’une diminution de l’activité des enzymes anti-oxydantes SOD, en hypoxie. Le manque d’oxygène entraine également l’expression de CHOP, facteur de transcription pro-apoptotique impliqué dans le stress du réticulum endoplasmique, qui va13inhiber l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. Nous avons montré que la culture des CEA en présence de milieu conditionné de CSMh (mc-CSMh) permet de prévenir partiellement l’apoptose des CEA en hypoxie, en modulant la voie de signalisation HIF, et en prévenant l’accumulation et les effets délétères des ROS. L’effet protecteur des CSM impliquerait le KGF comme observé lors de la première étude, mais également le HGF.Ces deux études indiquent que les CSMh sont susceptibles d’exercer des effets cytoprotecteurs paracrines vis-à-vis des CEA soumises à l’hypoxie aiguë ou prolongée, en limitant d’une part les modifications phénotypiques évocatrices de TEM, et d’autre part l’apoptose des CEA via la modulation des voies de signalisations hypoxiques. La sécrétion par les CSMh de KGF et de HGF, facteurs de croissance épithéliaux connus pour leurs effets bénéfiques sur les CEA, explique en partie les effets protecteurs paracrines des CSMh. Nos résultats suggèrent que les effets cytoprotecteurs des CSMh vis-à-vis des CEA pourraient contribuer aux effets bénéfiques des CSMh observés in vivo dans différents modèles animaux de fibrose induite, ou lors d’agressions alvéolaires aiguës. / Acute or chronic alveolar injuries provoke massive apoptosis of alveolar epithelial cells (AEC) that compromises an efficient repair of the alveolar epithelium and leads to lung diseases such as ARDS or IPF. These disorders are commonly associated with local alveolar hypoxia aggravating their progression through the stimulation of AEC apoptosis. Administration of allogenic mesenchymal stem cells (MSCs) has been shown to limit lung inflammation and fibrosis in murine models of alveolar injury, through a still poorly understood paracrine mechanism. In a first study, we showed that long term exposure of AEC in hypoxia leads to phenotypic alterations which looks like epithelio-mesenchymal transition (EMT). Co-culture with MSCs prevent hypoxia-induced EMT.In a second work, we studied whether MSC could protect AEC from hypoxia-induced apoptosis and the mechanisms involved. hMSC-conditioned media (hMSC-CM) significantly reduced hypoxia-induced apoptosis of AEC. Such a anti-apoptotic effect was also obtained with ROS scavenger N-acetylcystein or HIF1a inhibitor YC-1. hMSC-CM decreased the protein expression of HIF1α and HIF2α and of their pro-apoptotic target Bnip3 in hypoxic AEC. hMSC-CM also reduced ROS accumulation in hypoxic AEC by enhancing the activity of anti-oxidant enzymes and prevented the induction of CHOP, a pro-apoptotic factor induced by ROS signaling. The paracrine effect of hMSC was partly dependent on KGF and HGF secretion. hMSC prevent via a paracrine effect hypoxia-induced apoptosis of AEC by modulating hypoxic and ROS signaling.These two studies show that MSCs exert cytoprotective effects in vitro against hypoxia-induced apoptosis and EMT in AEC

The amphibian species Xenopus laevis, along with mouse and chicken is a very important model system, used widely to dissect the molecular intricacies of various aspects of vertebrate development. Study with Xenopus has clear advantages in terms of various technical considerations including the ease of handling early stage of embryos and due to the remarkable documentation of several early molecular events during development. The concept of inductive interactions between various cell types during early development was first revealed by the studies performed in Xenopus, and among the various factors proposed for mesoderm induction, the members of transforming growth factor-β (TGF- β) superfamily have been considered to be the most probable candidates. About forty different members of the TGF-β superfamily have been cloned and characterized from various organisms. The superfamily members like activins and BMPs have been studied extensively with respect to their functional role during development. While BMPs were assigned as candidates for inducing ventral mesoderm, activins oppose the role of BMPs by inducing dorsal mesoderm. Studies that helped in delineating their roles were performed using three approaches that utilized the ligands, receptors or down stream signaling components (Smads). All the three components were studied with respect to their endogenous expression pattern and effects of ectopic expressions of the wild type or dominant negative mutants. These approaches led to the accumulation of evidences supporting the importance of these signaling molecules. All the above mentioned studies were only possible due to the cloning and characterization of cDNAs of the various proteins involved in the signaling pathway including the ligands. TGF-β2 and 5 are the two isoforms of TGF-β cloned from the amphibian system. We have earlier cloned and characterized the promoter for TGF-β5 gene, which suggested possible regulation of this factor by tissue specific transcription factors. Messenger RNA in situ hybridization analysis to study the TGF-β5-expression pattern during Xenopus development, showed spatial and temporal expression pattern. The expression was confined to specific regions that include notochord, somites, and tail bud among others, in the various stages analyzed. This suggested a possible role for TGF-β5 in organogenesis during the amphibian development. To better understand the role of TGF-β in Xenopus development, studies to examine the specific receptor expression pattern for this growth factor is very essential. With the lack of any reports on cloning of TGF-β receptors from this system, the aim of the present study was to isolate and characterize the receptors for TGF-β from Xenopus laevis. PCR cloning using degenerate primers based on the conserved kinase domains of this class of receptors, coupled to library screenings enabled the identification of two novel receptor cDNAs of the TGF-β receptor superfamily. Characterization of the isolated cDNAs suggested that one of them codes for a type II receptor for TGF-β. Further the cDNAs were found to be ubiquitously expressed during development, as judged by RT-PCR analysis. The cloned cDNAs can now be employed as tools, to study the expression pattern by means of mRNA in situ hybridization, on the various developmental stage embryos and to perform studies using antisense and dominant negative mRNA injection experiments in vivo. Such studies will greatly assist in delineating the role of TGF-β ligands and receptors during amphibian development.

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Einleitung: Osteoarthrose (OA) ist eine der häufigsten muskuloskelettalen Erkrankungen beim Hund und wird definiert durch einen fortschreitenden Verlust der Knorpelschicht auf den Gelenksflächen. Therapeutika erster Wahl, wie nichtsteroidale Antiphlogistika, wirken rein palliativ und haben insbesondere bei der Langzeitgabe schädliche Nebenwirkungen. Bei der Suche nach Alternativen rückten Ergänzungsfuttermittel in den Focus der Forschung. Dabei zeigten mehreren Studien, dass eine Fütterung von Fischöl die klinischen Symptome von OA bei Hunden verbessert. Der dahinterliegende Wirkmechanismus ist jedoch beim Hund nicht erforscht. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Studie war demnach, den genauen Wirkmechanismus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) auf ausgewählte Schlüsselfaktoren der Knorpeldegeneration in einem Modellsystem der caninen OA zu untersuchen. Material und Methoden: Wir etablierten ein Protokoll zur Isolierung von caninen Chondrozyten, kultivierten die Zellen erfolgreich bis zur Konfluenz und kryokonservierten sie für die weiteren Versuche. Um die Ansprechbarkeit der Zellen auf verschiedene Zytokine zu untersuchen, wurden die Zellen über 24 h mit 10 ng/ml Interleukin‑1β (IL‑1β) und mit 1 bis 10 ng/ml Transforming Growth Faktor‑β (TGF‑β) stimuliert und die Genexpression von Matrixproteinasen, induzierbarer Stickstoffmonoxid Synthase (iNOS) und Cyclooxygenase‑2 (COX‑2) sowie die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) und Prostaglandin E (PGE) gemessen (4 Spender, N=3). Auf Basis des etablierten Models wurden in einer zweiten Versuchsreihe die Zellen über 6 Tage mit n-3 Eicosapentaensäure (EPA), n-3 Docosahexaensäure (DHA) oder n-6 Arachidonsäure (AA) kultiviert und anschließend über 48 h mit IL‑1β stimuliert. Die Veränderung der IL‑induzierte Genexpression von Matrixproteinasen, iNOS und COX‑2 sowie die Produktion von PGE und NO unter Einfluss der Fettsäuren wurde analysiert (6 Spender, N=4). Darüber hinaus wurde die Fettsäureaufnahme und der Fettsäuremetabolismus via Gaschromatographie überprüft. Um die Wirkungen der Fettsäuren und Stimulantien zu verifizieren, wurden die Daten einer zweifachen Varianzanalyse (AV) unterzogen. Bei signifikanten Einflüssen der Faktoren folgte ein Post-hoc-Test (Dunnett’s Test für die PUFA bzw. ein Bonferroni Test für die Stimulanzien). Die Signifikanzniveaus für AV- und die Post-hoc Tests wurden auf α = 0,01 eingestellt. Ergebnisse: Unter der Stimulation mit IL‑1β kam es zu einem signifikanten Anstieg von degenerativen und entzündlichen Markern. Das Muster der Marker entsprach dabei dem Muster, welches unter natürlichen Bedingungen in erkrankten Gelenken vorzufinden ist. Somit haben wir ein simples und dennoch repräsentatives Modell für die canine OA etabliert. Im Gegensatz zu IL‑1β reduzierte TGF‑β konzentrationsabhängig signifikant den von IL‑1β induzierten Anstieg der inflammatorischen Marker und stellt sich somit als Gegenspieler zu diesem proinflammatorischen Zytokin dar. Die gegensätzliche Antwort der Zellen auf beide Zytokine bewies, dass die Chondrozyten in unserem Modell Charakteristika von differenzierten Zellen aufweisen. Alle Fettsäuren wurden konzentrationsabhängig in die Zellen aufgenommen und metabolisiert. EPA reduzierte die IL‑induzierte Expression von iNOS und die damit im Zusammenhang stehende Produktion von NO signifikant. AA reduzierte ebenfalls iNOS und NO und außerdem die Expression von Matrixmetalloproteinase‑3 signifikant. Auf der anderen Seite steigerte AA signifikant die Produktion von PGE und die Expression von Aggrecanase ADAMTS‑5. DHA hatte auf keinen der untersuchten Marker einen Effekt. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Studie die in Fütterungsversuchen dokumentierte positive Wirkung von n-3 PUFAs bei der caninen OA und bieten zudem eine Erklärung für die dahinterliegenden Mechanismen. Hervorzuheben ist, dass in dieser Studie nicht nur EPA, sondern auch AA eine positive Wirkung auf einzelne Marker erzielen. EPA scheint von allen untersuchten Fettsäuren die höchste Effektivität zu haben. Eine geringe Dosis an Fettsäuren über einen längeren Zeitraum führte nicht zu einer Akkumulation der Fettsäuren und hatte daher auf einige untersuchte Marker nur eine geringe Wirkung. Insgesamt lässt sich schlussfolgern, dass eine ausreichende Menge und ausgewogenes Verhältnis von n‑3 und n‑6 PUFA als unterstützende Therapie bei chronischen Gelenkserkrankungen beim Hund von großer Wichtigkeit ist. Besonders ein hoher Gehalt an EPA scheint dabei eine hohe Bedeutung für die Effektivität zu haben.:INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Physiologie und Anatomie des hyalinen Knorpels 3 2.1.1 Feinstruktur des Gewebes 3 2.1.2 Bedeutung der Chondrozyten 4 2.1.3 Aufbau der Extrazellulären Matrix (ECM) 5 2.2 Osteoarthrose (OA) 6 2.2.1 Pathogenese 6 2.2.1.1 Kausale Pathogenese 6 2.2.1.2 Formale Pathogenese 7 2.2.2 Die Rolle der Zytokine 9 2.2.2.1 Interleukin-1β (IL-1β) 9 2.2.2.2 Transforming Growth Factor-β (TGF-β) 10 2.2.3 Rolle der Matrixproteinasen MMP und ADAMTS 12 2.2.4 Rolle der Entzündungsmediatoren 14 2.2.4.1 Stickstoffmonoxid (NO) 14 2.2.4.2 Prostaglandin E2 (PGE2) 15 2.3 Zellkulturmodelle für OA 16 2.4 Die canine OA 17 2.4.1 Ätiologie und Diagnose 17 2.4.2 Therapieansätze in der caninen OA 18 2.5 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) als Ergänzungsfuttermittel 20 2.5.1 Grundlagen des Fettsäurestoffwechsels 20 2.5.2 Fettsäurestoffwechsel im Knorpelgewebe 21 2.5.3 n-3 PUFAs als Therapieoption bei caniner OA 22 3 Ziel der Arbeit 25 4 Ergebnisse 26 4.1 Publikation 1 26 4.2 Publikation 2 36 5 Diskussion 47 5.1 Isolation und Anzucht von caninen Chondrozyten 47 5.2 IL-stimulierte canine Chondrozyten als Osteoarthrosemodell 51 5.3 TGF‑β als Gegenspieler von IL-1β 52 5.4 Fettsäuremetabolismus der Chondrozyten 54 5.5 Fettsäuren als Therapieoption bei der caninen OA 59 6 Schlussfolgerung 65 7 Zusammenfassung 66 8 Summary 68 9 Literaturverzeichnis 70 10 Danksagung 90 / Introduction: Osteoarthrosis (OA) is one of the most common musculoskeletal diseases in dogs and is defined by the progressive loss of the protective joint cartilage layer. First-choice treatments, like nonsteroidal anti-inflammatory drugs, act palliative only and are known to have harmful side effects especially in long-term usage. The urge to find alternative treatments moved nutraceuticals into the focus of research. In multiple trials, feeding fish oil improved the clinical symptoms of osteoarthritis in dogs. However, the underlying molecular mechanisms have not been investigated in dogs. Aim of the Study: The aim of this study was therefore to further clarify how polyunsaturated fatty acids affect key factors of cartilage degeneration in a cell culture model for canine OA. Materials and methods: We established a protocol for the isolation of canine chondrocytes, cultivated them successfully until confluency and cryoconservated them for further experiments. To examine the response of the cells to different cytokines, cells were stimulated for 24 h with 10 ng/ml Interleukin‑1β (IL‑1β) or 1 to 10 ng/ml Transforming Growth Factor‑β (TGF‑β). The gene expression of matrix proteinases, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase‑2 (COX‑2), the production of nitric oxide (NO) and prostaglandin E (PGE) were measured (4 donors, N=3). Using the established model, cells in the second trial were incubated with eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA) and arachidonic acid (AA) for 6 days and subsequently stimulated with IL‑1β for another 48 h. The change in IL‑induced gene expression of matrix proteinases, iNOS and COX‑2 as well as the production of NO and PGE under the influence of n‑3 EPA, n‑3 DHA and n‑6 AA was analysed (6 donors, N=4). To verify the effects of the fatty acids and the stimulants, data were analysed with a two‑factorial analysis of variance (ANOVA). When there was a significant effect of the factors, a post-hoc test was performed (Dunnett’s test for PUFA, Bonferroni test for stimulants). Significance level for ANOVA- and the post hoc test was set at α = 0.01. Results: Stimulation with IL-1β led to a significant increase of degenerative and inflammatory markers. This pattern of responsiveness was comparable to the events in naturally occurring OA. We therefore have established a simple yet representative model for canine OA. In contrast to IL‑1β, TGF‑β significantly decreased the IL‑induced inflammatory markers in a dose-dependent manner and therefore could counteract IL‑1β. The response of the cells to the cytokines indicates, that in our model, the chondrocytes have characteristics of differentiated cells. All fatty acids were incorporated in a dose-dependent manner and metabolized. EPA decreased the IL-induced gene expression of iNOS and reduced the concomitant production of NO significantly. AA also decreased iNOS and NO significantly and downregulated the gene expression of matrix metalloproteinase‑3 significantly. On the other hand, AA significantly increased the production of PGE and the gene expression of the aggrecanase ADAMTS‑5. DHA had no effect on any of the markers. Conclusions: Taking together, the results of this study add further weight to the beneficial effect of n‑3 PUFAs in canine OA and furthermore provide an explanation for the underlying mechanism. It is of importance, that not only the n‑3 fatty acid EPA but also the n‑6 fatty acid AA could provide beneficial effects on several markers. EPA seems to be the most effective of all fatty acids included in this study. A low concentration of fatty acids over a long period of time did not lead to an accumulation of fatty acids and therefore had a rather small impact on some of the investigated markers. Therefore, an optimal ratio between n‑3 and n‑6 and the adequate amount of fatty acids seems to be of high importance when treating chronic degenerative joint disease in dogs. However, a high content of EPA seems to be particularly effective.:INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Physiologie und Anatomie des hyalinen Knorpels 3 2.1.1 Feinstruktur des Gewebes 3 2.1.2 Bedeutung der Chondrozyten 4 2.1.3 Aufbau der Extrazellulären Matrix (ECM) 5 2.2 Osteoarthrose (OA) 6 2.2.1 Pathogenese 6 2.2.1.1 Kausale Pathogenese 6 2.2.1.2 Formale Pathogenese 7 2.2.2 Die Rolle der Zytokine 9 2.2.2.1 Interleukin-1β (IL-1β) 9 2.2.2.2 Transforming Growth Factor-β (TGF-β) 10 2.2.3 Rolle der Matrixproteinasen MMP und ADAMTS 12 2.2.4 Rolle der Entzündungsmediatoren 14 2.2.4.1 Stickstoffmonoxid (NO) 14 2.2.4.2 Prostaglandin E2 (PGE2) 15 2.3 Zellkulturmodelle für OA 16 2.4 Die canine OA 17 2.4.1 Ätiologie und Diagnose 17 2.4.2 Therapieansätze in der caninen OA 18 2.5 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) als Ergänzungsfuttermittel 20 2.5.1 Grundlagen des Fettsäurestoffwechsels 20 2.5.2 Fettsäurestoffwechsel im Knorpelgewebe 21 2.5.3 n-3 PUFAs als Therapieoption bei caniner OA 22 3 Ziel der Arbeit 25 4 Ergebnisse 26 4.1 Publikation 1 26 4.2 Publikation 2 36 5 Diskussion 47 5.1 Isolation und Anzucht von caninen Chondrozyten 47 5.2 IL-stimulierte canine Chondrozyten als Osteoarthrosemodell 51 5.3 TGF‑β als Gegenspieler von IL-1β 52 5.4 Fettsäuremetabolismus der Chondrozyten 54 5.5 Fettsäuren als Therapieoption bei der caninen OA 59 6 Schlussfolgerung 65 7 Zusammenfassung 66 8 Summary 68 9 Literaturverzeichnis 70 10 Danksagung 90

Vascular remodelling due to excessive proliferation and apoptosis resistance of pulmonary arterial smooth muscle (PASMCs) and endothelial cells (ECs) has been attributed to the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension (PAH). It is an incurable cardiovascular disorder, which leads to right heart failure and death, if left untreated. Heterozygous germline mutations in the bone morphogenetic protein receptor type II (BMPR2) have been linked with the majority (~75%) of the familial form of the disease (HPAH). Mutations in the BMPR2 gene impinge upon the BMP signalling which perturbs the balance between BMP and TGF-β pathways leading to the clinical course of the disease. Current therapies were discovered prior to the knowledge that PAH has substantial genetic components. Hence, this study aims to identify novel therapeutic intervention and provide novel insights into how the dysfunctional BMPRII signalling contributes to the pathogenesis of PAH. This work demonstrates that cryptolepines and FDA approved drugs (doxorubicin, taxol, digitoxin and podophyllotoxin) inhibit the excessive proliferation and induce apoptosis in BMPR2 mutant PASMCs by modulating the BMP and TGF-β pathways. Moreover, established drug PTC124 has also been tested but has failed to promote translational readthrough. I have also shown that dysregulated apoptosis of PASMCs and HPAECs is mediated through the BMPRII-ALK1-BclxL axis. Finally, the siRNA screen targeting approximately 1000 genes has identified novel proteins including PPP1CA, IGF-1R, MPP1, MCM5 and SRC each capable of modulating the BMPRII signalling. Taken together, this study for the very first time has identified novel compounds with pro-BMP and anti-TGFβ activities which may provide therapeutic intervention prior to or after the onset of PAH. / Commonwealth Scholarship Commission in the UK / The full text will be available at the end of the embargo period, 31st July 2024.