La membrane cellulaire est la barrière qui sépare l'intérieur des cellules de l'environnement extérieur. Elle se compose de lipides et de protéines. Les gènes codant pour les protéines membranaires représentent environ 30% des génomes. Les protéines membranaires sont synthétisées dans le cytosol par les ribosomes, mais suivent des voies spécifiques pour s'intégrer dans la membrane cellulaire. Les ribosomes en cours de traduction de protéines membranaires sont reconnus dans le cytosol et adressés à la membrane. Par la suite, les chaînes naissantes de protéines membranaires sont insérées dans la bicouche lipidique puis repliées de façons appropriées, ce mécanisme s'appelle la translocation. Le processus d'adressage est médiée par la particule de reconnaissance du signal (SRP) et son récepteur, tandis que la translocation est effectuée par un certain nombre de complexes de protéines membranaires.Cette thèse décrit deux des complexes impliqués dans cet adressage et translocation co-traductionnelle chez Escherichia coli : Le complexe ribosome-SRP-FtsY pour l'adressage en conformation «fermé» et le complexe dans lequel le ribosome est lié à l'holo-translocon (HTL) qui se compose de sept protéines membranaires. J'ai utilisé principalement la cryo-microscopie électronique pour caractériser ces complexes. La cryo-EM permet de déterminer la structure des échantillons biologiques à une résolution supérieure au nanomètre dans leur environnement natif, sans avoir à le cristalliser. Dans ce travail, j'ai bénéficié des améliorations récentes dans l'équipementet le traitement d'image.A partir d'un ensemble de données de cryo-EM obtenu par les membres du groupe, j‘ai déterminé la structure du complexe ribosome-SRP-FtsY en conformation «fermé» avec une résolution de 5.7 Å. Différentes stratégies de tri des calculsont été appliquées pour identifier la partie la plus homogène de l'ensemble des données. La structure montre un domaine bien résolu SRP ARN et SRP M avec une séquence signal liée. L'interaction entre les SRP et le ribosome pourrait être modélisée avec une grande fidélité. Cette structure révèle également que les GTPases SRP-ftsY sont détachées de la tétra-boucle de l'ARN et sont flexibles, libérant alors le site de sortie du ribosomepermettant la liaison du translocons.Dans le second projet, différentes approches ont été poursuivis pour résoudre la structure du complexe ribosome-HTL à haute résolution. Une structure initiale à 22 Å a été obtenue en mélangeant HTL solubilisés en détergent avec des ribosomes, démontrantla possibilité de préserver le complexe dans les conditions utilisées pour la préparation des grilles. J'ai ensuite exploré l'utilisation de nanodiscs et un nouveau détergent appelé LMNG pour stabiliser HTL dans des tampons sans détergent. Un deuxième ensemble de données a ensuite été recueilli à partir d'échantillon obtenu par gradient de fixation, la structure a été résolue à 17 Å. La préparation des échantillons a été optimisée utilisant entre autre les amphipoles. On a montré que deux types d'amphipole-HTL peuvent se lier au ribosome, et des structures de plus grande résolution devrait être obtenu à partir de ces échantillons. / The cell membrane is the barrier that separates the interior of cells from the outside environment. It consists of lipids and proteins. Genes encoding membrane proteins make up about 30% of the genome. Membrane proteins are synthesized in the cytosol by ribosomes, but employ special pathways to integrate into the cell membrane. Ribosomes translating membrane proteins are recognized by special factors in the cytosol and targeted to the membrane. Subsequently, nascent chains of the membrane proteins are inserted into the lipid bilayer and are folded into their proper structures, a process termed translocation. The targeting process is mediated by the signal recognition particle (SRP) and its receptor, while the translocation is performed by a number of membrane protein complexes.This thesis describes two of the complexes involved in co-translational targeting and translocation in Escherichia coli: The ribosome-SRP-FtsY targeting complex in the “closed” conformation and the complex of a ribosome with the holo-translocon (HTL) consisting of seven membrane proteins. I mainly used electron cryo-microscopy to characterize these complexes. Cryo-EM allows structural determination of biological samples at sub-nanometer resolution in their native environment, without the need to crystallize the specimen. In this work, I took advantage of the recent advances in both the hardware and the image processing.Starting from a cryo-EM dataset obtained by group members, I have determined the structure of ribosome-SRP-FtsY complex in the “closed” conformation at 5.7 Å resolution. Different computational sorting strategies were applied to identify the most homogeneous sub-pool of the dataset. The structure shows a well-resolved SRP RNA and SRP M domain with a signal sequence bound. The interaction between SRP and ribosome could be modeled with high confidence. This structure also reveals that the SRP-FtsY GTPases are detached from the RNA tetraloop and are flexible, thus liberating the ribosomal exit site for binding of the translocation machinery.In the second project, different approaches were pursued to solve the structure of the ribosome-HTL complex at high resolution. An initial structure at 22 Å was obtained by mixing detergent-solubilized HTL with the ribosome, demonstrating that it is possible to preserve the complex under the conditions used for specimen preparation. I have then explored the use of nanodiscs and a new detergent called LMNG to stabilize HTL in detergent-free buffers. A second dataset was subsequently collected from a sample prepared by gradient-fixation, and the structure was solved at 17 Å. Sample preparation has been optimized further using amphipols. Two types of amphipol-HTL complexes were shown to bind to the ribosome, and higher resolution structures are expected to be obtained from these samples.

Le système RUSH, de l’anglais « Retention using selective hook » est un système développé récemment qui permet d'analyser et de quantifier en temps réel le transport d'une grande diversité de protéines. Le système RUSH permet, grâce à un excès de molécules de Streptavidine (Str.) dirigées dans différents compartiments cellulaires (appelées les hameçons), de retenir des protéines appelées les rapporteurs, comportant un biocapteur fluorescent tel que la GFP (« Green fluorescent protein ») fusionné avec un peptide SBP (« Streptavidin-binding peptide »). L’addition de biotine dans le milieu perturbe l’interaction entre SBP et la Streptavidine, libérant ainsi les rapporteurs de leur hameçon. Basé sur le système RUSH, nous avons établi une méthode de criblage pour identifier des agents pharmacologiques dotés de la capacité à induire la libération d’HMGB1 (« High Mobility Group Box 1 »). La translocation d’HMGB1 depuis le noyau vers le cytoplasme, ainsi que sa sécrétion ou libération passive dans l'espace extracellulaire à travers les membranes plasmiques perméabilisées, représente un signal de danger essentiel à l’activation du système immunitaire. Dans ce système RUSH modifié, une protéine de fusion du Str-NLS3 a été utilisée comme un hameçon nucléaire pour retenir la protéine chimère constituée d'HMGB1, SBP et GFP (HMGB1-SBP-GFP). Lorsque de la biotine est ajoutée en combinaison à des chimiothérapies inductrices de la mort cellulaire immunogène (ICD) telles que les anthracyclines, elle se lie de manière compétitive à Str-NLS3 et permet la libération et la translocation nucléo-cytoplasmique des rapporteurs HMGB1-SBP-GFP. Nous avons utilisé ce système pour des criblages à haut débit visant à identifier des agents induisant le relargage d’HMGB1. Les agents identifiés appartiennent à trois catégories différentes : les inducteurs connus de l’ICD, les inhibiteurs des microtubules et les modificateurs épigénétiques. Leur effet a été confirmé par des méthodes multiples de mesure de la quantité protéique d’HMGB1 nucléaire, cytoplasmique et extracellulaire dans des cellules humaines et murines in vitro ainsi que dans le plasma de souris. Nos données révèlent également que ces agents induisent la libération d’HMGB1 par des mécanismes distincts : arrêt du cycle cellulaire, acétylation des histones ou effets « on-target » par l'inhibition d’ADN méthyltransférase. Il serait alors intéressant d'étudier si les effets décrits ici peuvent contribuer aux effets immunostimulateurs des médicaments utilisés pour le traitement de cancers ou de maladies parasitaires.Le système RUSH permettant la synchronisation et la quantification de la sécrétion des protéines du réticulum endoplasmique (RE) vers l'appareil de Golgi, il permet de cribler un grand nombre de composés afin d’identifier des inhibiteurs des sécrétions candidates. Nous avons conçu et construit une lignée cellulaire humaine exprimant les chimères SBP-GFP sécrétables ainsi que les hameçons Str-KDEL ciblant l’ER ; la biotine permet donc la libération du rapporteur par les voies de sécrétion classiques. Nous avons identifié et validé plusieurs médicaments qui sont capables d’inhiber la sécrétion de protéines : les anti-angineux, les antidépresseurs, les anti-helminthiques, anti-psychotiques, anti-protozoaires, et agents immunosuppresseurs. Ces composés varient dans leur capacité à inhiber la synthèse des protéines et de compromettre la morphologie du RE ou l'intégrité du Golgi. Les données ont ensuite été soumises à une analyse bio-informatique et cette procédure a permis l'identification de quatre groupes en fonction de leur mode d'action. Cette partie démontre la faisabilité et l'utilité d'un nouvel essai de criblage phénotypique basé sur le système RUSH. Nous avons conçu des systèmes de HSC (« High Content Screening ») basés sur le système RUSH, qui ont permis l'identification d'agents pharmacologiques induisant la libération d’HMGB1, ainsi que des inhibiteurs de la sécrétion protéique. / The retention using selective hooks (RUSH) system allows withholding load cargoes with fluorescent biosensor such as green fluorescent proteins (GFP) fused to a streptavidin-binding peptide (SBP) by an excess of streptavidin (Str) molecules that are addressed to different subcellular localizations. Addition of biotin competitively disrupts this interaction, liberating the reporter from its hook. Based on the RUSH system, we developed a screening assay to identify pharmacological agents endowed with HMGB1 (high mobility group box 1) releasing capacities. The translocation of HMGB1 from the nucleus to the cytoplasm and its secretion or passive release through the permeabilized plasma membrane constitutes a major cellular danger signal. Extracellular HMGB1 can interact with specific pattern recognition receptors to stimulate pro-inflammatory and immunostimulatory pathways. In this modified RUSH system, a Str-NLS3 fusion protein was used as a nuclear hook to seize SBP fused with HMGB1 and GFP. When combined with biotin, which competitively binds to Stre-NLS3 to free the HMGB1-SBP-GFP, immunogenic cell death (ICD) inducers such as anthracyclines were able to cause the nucleo-cytoplasmic translocation of HMGB1-SBP-GFP. We used this system for high-content screenings (HCS) to identify HMGB1 releasing agents. Hits fell into three functional categories: known ICD inducers, microtubule inhibitors, and epigenetic modifiers. Their effective action was confirmed by multiple methods monitoring nuclear, cytoplasmic and extracellular HMGB1 pools, both in cultured human or murine cells, as well as in mouse plasma. These agents induced HMGB1 release through a whole set of distinct mechanisms, cell cycle arrest, histone acetylation, or on-target effect. It will be interesting to learn whether such effects may contribute to the immunostimulatory effects of drugs that are used to treat malignant disease or worm infection. For HCS of identification of pharmacological inhibitors of conventional protein secretion, we constructed a human cell line co-expressing soluble secretory-SBP-GFP (ss-SBP-GFP) and Str-KDEL hook within the endoplasmic reticulum (ER) lumen, and biotin addition releases the reporter, ss-SBP-GFP via the conventional Golgi-dependent protein secretion pathway into the culture supernatant. We identified and validated a series of molecularly unrelated drugs including antianginal, antidepressant, anthelmintic, antipsychotic, antiprotozoal and immunosuppressive agents that inhibit protein secretion. These compounds vary in their capacity to suppress protein synthesis and to compromise ER morphology and Golgi integrity, as well as in the degree of reversibility of such effects. These data was then subjected to bioinformatics analysis including correlation analyses, non-supervised hierarchical clustering, and principal component analysis and led to the identification of 4 clusters of agents. We demonstrate the feasibility and utility of a novel RUSH-based phenotypic screening assay. In summary, we built HCS systems based on the improved RUSH sysytem for identification of agents that induce HMGB1 release or inhibit conventional protein secretion.