A cruzaína, principal cisteíno protease do Trypanosoma cruzi, é um alvo terapêutico validado para o tratamento da doença de Chagas. Grande parte dos inibidores desta enzima é constituída de peptídeo-miméticos do tipo covalente irreversível cujo desenvolvimento, entretanto, tem sido evitado devido ao potencial efeito off target e ao perfil farmacocinético indesejável. O grupo de química medicinal NEQUIMED/ IQSC/USP vêm utilizando métodos avançados em quimioinformática para a identificação de inibidores reversíveis da cruzaína e de outras cisteíno proteases. Contudo, para que estes inibidores se desenvolvam a compostos matrizes mais eficientes, informações computacionais e estruturais de seus Modos de Interação (MOB) com a proteína alvo tornam-se fundamentais. Neste trabalho, a cristalografia de raios X foi utilizada para descrever em detalhes o MOB de três importantes inibidores reversíveis da cruzaína identificados pelo NEQUIMED: a dipeptidil-nitrila Neq0409 e os dois fragmentos moleculares Neq0147 e Neq0176. De modo a evitar a auto-proteólise experimentada pela cruzaína nativa que torna desafiadora a cristalização com inibidores de baixa afinidade como os fragmentos reversíveis, duas novas construções mutantes e inativas da cruzaína (a C25A e a C25S) foram desenvolvidas. A C25S foi validada como modelo cristalográfico representativo dado a coerência do MOB elucidado nesta enzima mutante e na cruzaína nativa para o inibidor mais estudado da cruzaína, o K777. A descrição da presença, orientação, conformação e modo de ação no sítio, além do completo padrão de interações fornecidos por estas estruturas cristalinas, validaram ortogonalmente os MOB preditos e os métodos de planejamento in silico usados no NEQUIMED, permitindo a identificação de inibidores muito mais potentes análogos ao Neq0147 e ao Neq0409. O grupo 2-acetamidotiofeno-3-carboxamida do Neq0176 e o anel heterocíclico de cinco membros baseado no 1,3,4-oxadiazol do Neq0147 foram identificados como alternativos aos tradicionais esqueletos peptídeo-miméticos. O impacto do efeito proteolítico na qualidade e na resolução de estruturas cristalográficas na cruzaína foi melhor compreendido a partir de duas estruturas de alta resolução obtidas para a cruzaína nativa em complexo com o metanotiossulfonato de metila (MMTS) e a iodoacetamida. Estes resultados permitiram compreender as bases experimentais para a cristalização de inibidores reversíveis de baixa afinidade. Todos os resultados estruturais obtidos via cristalografia de raios X neste trabalho são úteis para mapear as bases estruturais essenciais para o planejamento de futuros inibidores mais potentes e seletivos da cruzaína. / Cruzain, the major Trypanosoma cruzi cysteine protease, is a validated therapeutic target for the search of new medicines for the treatment of Chagas disease. A myriad of inhibitors of this enzyme consists of covalent irreversible peptidomimetics whose development has been impaired due to potential off target effect and undesirable pharmacokinetic profile. Modern cheminformatic methods employed by The Medicinal Chemistry Group (NEQUIMED/IQSC/USP) were used to identify cruzain reversible inhibitors. Their optimization for more efficient compounds can be accomplished by the use of data and information gathered from computational and structural modes of interaction (MOB). In this doctoral thesis, the X-ray crystallography was used to describe in detail the MOB of three important new cruzain reversible inhibitors: the dipeptidil-nitrile Neq0409 and the two molecular fragmentos Neq0147 and Neq0176. In order to avoid cruzain self-proteolysis during crystallization with low affinity reversible inhibitors such as the identified fragments, two new mutant and inactive constructs of cruzain (the C25S and C25A) were designed to upholding the same properties of the wild type catalytic site. The C25S was validated as representative crystallographic model given the coherence of the MOB elucidated for the best-known and studied cruzain inhibitor, the K777. The description of the presence, orientation, conformation and mode of action at the site, besides the complete pattern of bimolecular interactions, provided by these crystalline structures, orthogonally validated the predicted in silico MOB and allowed the identification of other potent inhibitors analogous to the Neq0147 and the Neq0409. The 2-acetamidothiophene-3-carboxamide moiety (Neq0176) and heterocyclic five-membered ring based on the 1,3,4-oxadiazole (Neq0147) were thereby identified as attractive alternatives to traditional peptidomimetics. The impact of proteolytic effect on the quality and resolution of crystallographic structures in cruzain was best understood from two high-resolution structures obtained for the native cruzain in complex with methyl methanethiolsulfonate (MMTS) and iodoacetamide. These results allow the understanding of experimental basis for the crystallization with reversible inhibitors of low affinity such as fragments. All structural results obtained by X-ray crystallography together with the catalytic site depiction using GRID and SuperStar methods are useful for mapping the essential structural basis for the design of future more potent and selective cruzain inhibitors.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-07-07T12:56:32Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3524208 bytes, checksum: 1dfa6b7ebfd1711a48733025c4052ee9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T12:56:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3524208 bytes, checksum: 1dfa6b7ebfd1711a48733025c4052ee9 (MD5) Previous issue date: 2017-02-13 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The human body has a large bacterial flora, but when these bacteria, the principle of commensal character, become part of site other than it's natural, they can cause some severe diseases. Researches that are based either on the search of new drugs from plants or on the improvement of phytotherapics are in prominence and continue to play an important role nowadays. In this perspective, the aim was to carry out a phytochemical study of Solanum capsicoides All. fruits to isolate and characterize the chemical substances of this species and to use in silico studies to carry out investigations of new molecules potentially active for methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Escherichia coli using a database created with secondary metabolites isolated from Solanum genus. The phytochemical study of Solanum capsicoides All. fruits resulted in the isolation of three substances: carpesterol, acetylated glucose and 4-hydroxybenzaldehyde. A review of the literature led to the creation of a database with 421 different secondary metabolites isolated from the Solanum genus. Two databases from CHEMBL were selected. The first one with activity against MRSA and another against E. coli. The compounds were classified according to the pIC50 values to generate and validate the model using "Random Forest"(RF). The structure of six new target proteins against S. aureus obtained from the PDB (Protein database) were used for virtual screening of the based on the receptor structure using docking studies by the Molegro Virtual Docker, reaching to select Solanum database molecules capable of interacting in the binding sites of proteins. The RF prediction model for MRSA obtained a percent accuracy of 81%, area under the Receiver Operating Characteristic (ROC) curve of 0.885, selecting 8 molecules with an active potential above 60%. The prediction model for Escherichia coli obtained an accuracy rate of 88%, area under ROC curve of 0.932, selecting 4 molecules with potential probability above 84%. The study of the coupling of six target enzymes to S. aureus selected an average of 50 molecules from the bank of 421 isolated molecules of the genus Solanum with an ability to interact with on active site of each enzyme. In addition, it was possible to obtain 1 molecule with active potential and interaction capacity with 5 enzymes studied, 7 molecules interacting with 3 enzymes and 6 with 2 enzymes of S. aureus. The rutin, a molecule potentially active in the in silico study for S. aureus and E. coli, together with carpesterol, were tested in vitro against these bacteria. Microbiological tests have shown that carpesterol has no antimicrobial activity for the studied strains, and that the rutin has activity only for E. coli. An interaction study with strains of S. aureus ATCC 25923, a standard strain sensitive to all antibiotics, and SAM-01, a multidrug resistant strain, was designed. There was interaction only between rutin and oxacillin, one of the three antibiotics studied in the interaction, for a strain SAM- 01, reducing the resistance of this strain. / O ser humano possui uma vasta flora bacteriana que é comensal, mas quando essas bactérias, a princípio de caráter comensal, passam a fazer parte de outro sítio que não o seu natural, podem causar graves patogenias. Pesquisas que se fundamentam na busca por novos medicamentos a partir de plantas ou no melhoramento de fitoterápicos já existentes vem se destacando e continuam a desempenhar um papel importante nos dias de hoje. Nessa perspectiva objetivou-se realizar um estudo fitoquímico dos frutos de Solanum capsicoides All. para isolar e caracterizar substâncias químicas desta espécie e, utilizando estudos in silico, realizar investigações de novas moléculas potencialmente ativas para Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) e Escherichia coli, utilizando um banco de dados criado com metabólitos secundários isolados do gênero Solanum. O estudo fitoquímico dos frutos de Solanum capsicoides All. resultou no isolamento de três substancias: carpesterol, glicose acetilada e 4-hidroxi-benzaldeído. A revisão de literatura levou à criação de um banco de dados com 421 diferentes metabólitos secundários isolados do gênero Solanum. Foram selecionados dois bancos de dados obtidos a partir do CHEMBL. O primeiro com atividade contra S. aureus multirresistente (MRSA) e o outro contra E. coli. Os compostos foram classificados de acordo com valores de pIC50 para gerar e validar o modelo utilizando “Random Forest”(RF). A estrutura de seis novas proteínas alvo contra S. aureus obtidas do Protein Data Bank (PDB) foram utilizadas para triagem virtual baseada na estrutura do receptor utilizando estudos de “docking” com o software Molegro Virtual Docker, a fim de selecionar moléculas do banco de dados de Solanum com potencial capacidade de interagir nos sítios de ligação dessas proteínas. O modelo RF de predição para S. aureus multirresistente obteve uma porcentagem de acerto de 81%, área sob a curva Receiver Operating Characteristic (ROC) de 0,885, selecionando 8 moléculas com potencial ativo superior a 60%. O modelo de predição para Escherichia coli obteve taxa de acerto de 88%, área sob curva ROC de 0,932, selecionando 4 moléculas com probabilidade de potencial ativo superior a 84%. O estudo do docking das seis enzimas alvo para S. aureus selecionou uma média de 50 moléculas do banco de 421 moléculas isoladas do gênero Solanum com a capacidade de interagir no sitio ativo de cada enzima. Analisando moléculas multitarget, foi possível obter 1 molécula com potencial ativo e capacidade de interação com 5 das 6 enzimas estudadas, 7 moléculas interagindo com 3 enzimas e 6 com 2 enzimas de S. aureus. A rutina, uma molécula potencialmente ativa no estudo in silico para S. aureus e E. coli, juntamente com o carpesterol, foram testadas in vitro contra essas bactérias. Os testes microbiológicos mostraram que o carpesterol não possui atividade antimicrobiana para as cepas estudadas, e que a rutina possui atividade apenas para a cepa de E. coli. Foi realizado ainda estudo de interação com as cepas de S. aureus ATCC 25923, uma cepa padrão sensível a todos os antibióticos, e SAM-01, uma cepa multirresistente. Houve interação apenas entre a rutina e a oxacilina, um dos três antibióticos estudados na interação, para a cepa SAM-01, diminuindo a resistência dessa cepa.

Submitted by LILIAN HERNÁNDEZ ALVAREZ null (lilianhern@gmail.com) on 2017-10-16T13:40:19Z No. of bitstreams: 1 Lilian_dissertacao_final.pdf: 8133270 bytes, checksum: ea7913c9f03bc3c89f0211896c01cc88 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-10-18T17:58:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 hernandezalvarez_l_me_sjrp.pdf: 8133270 bytes, checksum: ea7913c9f03bc3c89f0211896c01cc88 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-18T17:58:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 hernandezalvarez_l_me_sjrp.pdf: 8133270 bytes, checksum: ea7913c9f03bc3c89f0211896c01cc88 (MD5) Previous issue date: 2017-09-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Trypanosoma cruzi é o agente causal da doença de Chagas, uma infecção negligenciada que afeta milhões de pessoas nas regiões tropicais. A maioria dos fármacos empregados no tratamento desta doença são altamente tóxicos e geram resistência. Na atualidade, o descobrimento de inibidores alostéricos é um tópico emergente dentro da área de desenho computacional de fármacos, pois promove a acessibilidade a medicamentos mais seletivos e menos tóxicos. Neste trabalho foi desenvolvida uma estratégia para a descoberta computacional de inibidores alostéricos a qual foi aplicada à cruzaína, a principal cisteíno protease do T. cruzi. A caracterização molecular da forma livre e ligada da cruzaína foi investigada através do ancoramento molecular, simulações de dinâmica molecular, cálculos de energia livre de ligação e construção de redes de interações entre resíduos. A partir da análise baseada na geometria das estruturas geradas na dinâmica molecular, foram detectados dois potenciais sítios alostéricos na cruzaína. Os resultados sugerem a existência de diferentes mecanismos de regulação exercidos pela ligação de inibidores diferentes no mesmo sítio alostérico. Além disso, foram identificados os resíduos que estabelecem os caminhos de transmissão de informação entre um dos sítios alostéricos identificado e o sítio ativo da enzima. O presente estudo é a primeira aproximação de desenho de inibidores alostéricos da cruzaína e serve para futuras intervenções farmacológicas. Esses resultados constituem uma base para o desenho de inibidores específicos de cisteíno proteases homólogas da papaína. / Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease, a neglected infection affecting millions of people in tropical regions. There are several chemotherapeutic agents for the treatment of this disease, but most of them are highly toxic and generate resistance. Currently, the development of allosteric inhibitors constitutes a promising research field, since it may improve the accessibility to more selective and less toxic medicines. To date, the allosteric drugs prediction is a state-of-the-art topic in rational structure-based computational design. In this work a simulation strategy was developed for computational discovery of allosteric inhibitors, and it was applied for or cruzain, a promising target and the major cysteine protease of T. cruzi. Molecular dynamics simulations, binding free energy calculations and network-based modelling of residue interactions were combined to characterize and compare molecular distinctive features of the apo form and the cruzain-allosteric inhibitor complexes. By using geometry-based detection on trajectory snapshots we determined the existence of two main allosteric sites suitable for drug targeting. The results suggest dissimilar mechanism exerted by the same allosteric site when binding different potential allosteric inhibitors. Finally, we identified the residues involved in suboptimal paths linking the identified site and the orthosteric site. The present study constitutes the first approximation for designing cruzain allosteric inhibitors and may serve for future pharmacological intervention. These findings are particularly relevant for the design of allosteric modulators of papain-like cysteine proteases. / CAPES: 031/2013

A Doença de Alzheimer (DA) é um transtorno progressivo que acomete o Sistema Nervoso Central, causando demência em idosos. A doença leva a uma diminuição da memória, dificuldade no raciocínio e pensamento e alterações comportamentais. A fisiopatologia da doença corresponde ao aumento na concentração do peptídeo -amilóide com consequente deposição e formação da placa amiloide; e também ao aparecimento dos emaranhados neurofibrilares, que são agregados de proteína tau hiperfosforilada. A enzima glicogênio sintase cinase 3 beta (GSK-3) está diretamente envolvida nos dois processos e, por isso, a busca por novos inibidores dessa enzima é uma importante estratégia terapêutica para o tratamento da doença. Neste trabalho utilizou-se a triagem virtual em 7 bancos de dados de moléculas aplicando cinco diferentes estratégias in silico, através de planejamento de fármacos baseado em ligantes e baseado em estrutura, combinada com estudos in silico de farmacocinética, toxicidade e atividade biológica, seguido de posteriores ensaios de inibição enzimática in vitro. Obteve-se três compostos pela metodologia de farmacóforo, (Estratégia 3) dos quais dois deles demonstraram atividade inibitória interessante para GSK-3, na faixa de micromolar. A partir das outras quatro estratégias foram selecionados 16 compostos que futuramente serão também testados utilizando o mesmo protocolo de ensaio in vitro aqui utilizado. / Alzheimer\'s disease (AD) is a progressive disorder that affects the Central Nervous System, causing dementia in the elderly. The disease leads to decreased memory, difficulty in reasoning and thinking, and behavioral changes. The pathophysiology of the disease corresponds to the increase in -amyloid peptide concentration with consequent deposition and formation of the amyloid plaque and to the appearance of neurofibrillary tangles, which are aggregates of hyperphosphorylated tau protein. The enzyme glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3) is directly involved in both processes and, therefore, the search for new inhibitors of this enzyme is an important therapeutic strategy for the treatment of the disease. In this work, we used virtual screening in 7 molecule databases applying five different in silico strategies, using the ligand-based and structure-based drug design methodologies, combined with in silico studies of pharmacokinetics, toxicity and biological activity, followed by subsequent assays enzymatic inhibition in vitro. We obtained three compounds by the pharmacophore methodology (Strategy 3) of which two of them demonstrated interesting inhibitory activity for GSK-3 in the micromolar range. From the other four strategies, 16 compounds were selected which in future will also be tested using the same in vitro assay protocol used here.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-06-12T15:19:44Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vinicius de Medeiros Alves - 2014.pdf: 3082084 bytes, checksum: da4838d5fe24841429f43de84204d98a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-06-12T15:21:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vinicius de Medeiros Alves - 2014.pdf: 3082084 bytes, checksum: da4838d5fe24841429f43de84204d98a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-12T15:21:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vinicius de Medeiros Alves - 2014.pdf: 3082084 bytes, checksum: da4838d5fe24841429f43de84204d98a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-05-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction: Skin sensitization is a major environmental and human health hazard. Although many chemicals have been evaluated in humans, there have been no efforts to model these data to date. Skin sensitization is commonly evaluated using structural alerts. However, there has been a growing concern that alerts disproportionally flag too many chemicals as toxic, which questions their reliability as toxicity markers. The main goal of this thesis was to develop and apply new cheminformatics methods to predict skin sensitization of chemical compounds that lack experimental data. Methodology: It has been compiled, curated, analyzed, and compared the available human data and the murine (performed in mice) animal model data, named LLNA (local lymph node assay). Using these data, it was developed reliable computational models and applied them for virtual screening of chemical libraries to identify putative skin sensitizers. It was developed a freely accessible web-based application for the identification of potential skin sensitizers. In addition, it was demonstrated that contrary to the common perception of QSAR models as “black boxes” they can be used to identify statistically significant chemical substructures (QSAR-based alerts) that influence toxicity. Results and discussion: The overall concordance between murine LLNA and human skin sensitization responses for a set of 135 unique chemicals was low (R = 28-43%), although several chemical classes had high concordance. We have succeeded to develop predictive QSAR models of all available human data with the external correct classification rate of 71%. A consensus model integrating concordant QSAR predictions and LLNA results afforded a higher correct classification rate of 82% but at the expense of the reduced external dataset coverage (52 %). We used the developed QSAR models for virtual screening of CosIng database and identified 1,061 putative skin sensitizers; for seventeen of these compounds, we found published evidence of their skin sensitization effects. The developed Pred-Skin web app (http://www.labmol.com.br/predskin/) is based on binary QSAR models of human (109 compounds) and LLNA (515 compounds) data with good external correct classification rate (70-81% and 72-84%, respectively). It is also included a multiclass potency model based on LLNA data (accuracy ranging between 73-76%). Conclusions: Models reported herein provide more accurate alternative to LLNA testing for human skin sensitization assessment across diverse chemical data. In addition, they can also be used to guide the structural optimization of toxic compounds to reduce their skin sensitization potential. The Pred-Skin web app is a fast, reliable, and user-friendly tool for early assessment of chemically-induced skin sensitization. A new approach that synergistically integrates structural alerts and rigorously validated QSAR models for a more transparent and accurate safety assessment of new chemicals was also proposed. / Introdução: A sensibilização cutânea é um importante parâmetro de avaliação de toxicidade humana e ambiental. Embora muitos compostos tenham sido avaliados em seres humanos, não foi reportado até o momento modelos de QSAR (do inglês, quantitative structure-activity relationships) gerados com esses dados. Comumente, a sensibilização cutânea é avaliada computacionalmente usando-se alertas estruturais. No entanto, tem havido uma preocupação crescente de que alertas sinalizam a maioria dos compostos como tóxicos, o que questiona sua confiabilidade como marcadores de toxicidade. O objetivo geral do presente trabalho foi desenvolver e aplicar novos métodos de quimioinformática para predizer a sensibilização cutânea de compostos químicos que carecem de dados experimentais. Metodologia: Foram compilados, preparados, analisados e comparados os dados de sensibilização cutânea de pele humana e do modelo animal murino (realizado em camundongos), denominado LLNA (local lymph node assay). Modelos de QSAR foram desenvolvidos utilizando esses dados e aplicados para a triagem de quimiotecas virtuais para identificar potenciais sensibilizadores. Foi desenvolvido um aplicativo gratuito para a identificação de potenciais sensibilizadores cutâneos. Além disso, foi demonstrado que modelos de QSAR podem ser usados para identificar subestruturas químicas estatisticamente significativas (alertas estruturais baseados em QSAR) que influenciam a toxicidade. Resultados e discussão: A concordância global (R) entre respostas de sensibilização cutânea humana e murina para um conjunto de 135 substâncias químicas únicas foi baixa (R = 28-43%), embora várias classes químicas apresentassem alta concordância. Foi possível desenvolver modelos de QSAR preditivos com taxa de classificação correta externa de 71%. Um modelo de consenso que integrava predições concordantes de QSAR e dados de LLNA proporcionaram uma acurácia 82%. Utilizou-se os modelos de QSAR desenvolvidos para a triagem virtual da base de dados CosIng e foram identificados 1061 potenciais sensibilizadores cutâneos. Para dezessete desses compostos, encontrou-se evidências publicadas de seus efeitos de sensibilização cutânea em seres humanos. O aplicativo desenvolvido, Pred-Skin (http://www.labmol.com.br/predskin/), baseia-se em modelos de QSAR classificatórios de dados humanos (109 compostos) e murinos (515 compostos) com boa taxa de classificação correta externa (70-81% e 72-84%, respectivamente). Esse aplicativo também possui um modelo de multiclassificatório desenvolvido com dados de LLNA (precisão que varia entre 73-76%). Conclusões: Os modelos de QSAR desenvolvidos forneceram uma alternativa mais precisa do que o modelo animal para avaliação da sensibilização cutânea humana. Além disso, a interpretação dos modelos de QSAR permitem orientar a otimização estrutural de compostos tóxicos para reduzir o potencial de toxicidade. O aplicativo Pred-Skin é uma ferramenta rápida, confiável e de fácil utilização para a avaliação da sensibilização cutânea de compostos químicos. Foi também proposta uma nova abordagem que integra sinergicamente alertas estruturais e modelos de QSAR rigorosamente validados para uma avaliação de toxicidade mais transparente e precisa de novos produtos químicos.