As regiões costeiras estão sendo ameaçadas por apresentarem uma exploração desordenada e predatória de seus recursos naturais alterando a biodiversidade. Leveduras fazem parte do ecossistema marinho, entretanto algumas espécies estão associadas à micoses superficial, subcutânea e/ou sistêmicas. O objetivo deste estudo foi quantificar leveduras, isolar e caracterizar Trichosporon spp., em amostras água de mar e areia em três regiões costeiras do estado de São Paulo: Baixada Santista, Canal de São Sebastião e Ubatuba. Foram coletadas 126 amostras de água de mar e areia. As áreas foram caracterizadas usando parâmetros microbiológicos. A contagem de leveduras variou de <1 a 1.300UFC/100mL em água de mar e <1 a 3.200UFC/g em areia. As leveduras isoladas foram identificadas usando a metodologia tradicional e testes genotípicos. De um total de 102, 30,5% foi confirmado pelo API ID 32C, 40,2% pelo auxanograma e 63,7% pelo PCR. Os isolados identificados pelo PCR foram seqüenciados e 41,5% foram Trichosporon spp. / Coastal regions are being threatened because they have a predatory and uncontrolled exploitation of natural resources by changing biodiversity. Yeasts are part of the marine ecosystem, though some species are associated with superficial mycoses, subcutaneous and / or systemic. The objective of this study was to quantify yeast, isolation and Trichosporon spp. In samples of sea water and sand in three regions of the state of São Paulo: Santos, Canal de São Sebastião and Ubatuba. We collected 126 samples of sea water and sand. The areas were characterized by microbiological parameters. Yeast counts ranged from <1 to 1.300UFC/100mL in sea water and <1 to 3.200UFC / g in sand. The yeasts were identified using the traditional methods and genotypic tests. From a total of 102, 30.5% was confirmed by API ID 32C, by 40.2% and 63.7% auxanograma PCR. The isolates identified by PCR were sequenced and 41.5% were Trichosporon spp.

As regiões costeiras estão sendo ameaçadas por apresentarem uma exploração desordenada e predatória de seus recursos naturais alterando a biodiversidade. Leveduras fazem parte do ecossistema marinho, entretanto algumas espécies estão associadas à micoses superficial, subcutânea e/ou sistêmicas. O objetivo deste estudo foi quantificar leveduras, isolar e caracterizar Trichosporon spp., em amostras água de mar e areia em três regiões costeiras do estado de São Paulo: Baixada Santista, Canal de São Sebastião e Ubatuba. Foram coletadas 126 amostras de água de mar e areia. As áreas foram caracterizadas usando parâmetros microbiológicos. A contagem de leveduras variou de <1 a 1.300UFC/100mL em água de mar e <1 a 3.200UFC/g em areia. As leveduras isoladas foram identificadas usando a metodologia tradicional e testes genotípicos. De um total de 102, 30,5% foi confirmado pelo API ID 32C, 40,2% pelo auxanograma e 63,7% pelo PCR. Os isolados identificados pelo PCR foram seqüenciados e 41,5% foram Trichosporon spp. / Coastal regions are being threatened because they have a predatory and uncontrolled exploitation of natural resources by changing biodiversity. Yeasts are part of the marine ecosystem, though some species are associated with superficial mycoses, subcutaneous and / or systemic. The objective of this study was to quantify yeast, isolation and Trichosporon spp. In samples of sea water and sand in three regions of the state of São Paulo: Santos, Canal de São Sebastião and Ubatuba. We collected 126 samples of sea water and sand. The areas were characterized by microbiological parameters. Yeast counts ranged from <1 to 1.300UFC/100mL in sea water and <1 to 3.200UFC / g in sand. The yeasts were identified using the traditional methods and genotypic tests. From a total of 102, 30.5% was confirmed by API ID 32C, by 40.2% and 63.7% auxanograma PCR. The isolates identified by PCR were sequenced and 41.5% were Trichosporon spp.

O gênero Trichosporon é composto por leveduras artrosporadas do Filo Basidiomycota e é conhecido agente de infecção fúngica invasiva (IFI) em pacientes imunodeprimidos ou com outros fatores de risco. Em pacientes onco-hematológicos é a principal levedura responsável por IFI depois do gênero Candida. Entre as espécies responsáveis por infecções no homem encontram-se: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. A tecnologia de identificação de fungos por espectrometria de massa (SM) MALDI-TOF ainda carece de padronização para identificação de fungos do gênero Trichosporon, mas a literatura mostra resultados encorajadores. O objetivo deste estudo é padronizar a técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF para a identificação das espécies do gênero Trichosporon de importância médica. O estudo foi realizado em cooperação entre a Divisão de Laboratório Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (DLC, HC-FMUSP), Instituto de Medicina Tropical da USP (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) e Laboratoire de Parasitologie-Mycologie do Hospital Saint Antoine de Paris, vinculado ao grupo de pesquisa INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\" Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie de Paris. Noventa e três cepas/isolados foram analisado(a)s, sendo dezenove cepas de referência adquiridas junto à coleção holandesa Centraalbureau Schimmelcultures (CBS), 19 isolados do HC-FMUSP e IAL, e 55 isolados de diferentes hospitais franceses. A identificação molecular foi realizada através do sequenciamento da região IGS1 do rDNA e foi considerada como método de referência. O protocolo de extração de proteínas foi estabelecido através da comparação do desempenho de três metodologias (Bruker®, Cassagne et al., Sendid et al.). Os espectros de massa foram obtidos no laboratório de bacteriologia do Hospital Saint Antoine de Paris através do aparelho Microflex LT®. A interpretação dos resultados qualitativos e quantitativos (logscore) foi realizada através do Software Biotyper 3.0®. O desempenho de identificação do banco de espectros de referência Biotyper 3.0® foi comparado a outros cinco bancos criados a partir de espectros de referência (ERs) derivados de 18 cepas de referência CBS, sete isolados clínicos e 11 ERs do banco Biotyper 3.0. O protocolo de extração de proteínas descrito por Sendid et al. foi escolhido como protocolo de referência pois os espectros produzidos tiveram logscore superiores àqueles obtidos através do método do fabricante. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou 32,3% de identificações corretas das espécies, sendo que o banco de ERs in house (número 5, constituído cepas CBS e isolados clínicos) apresentou 98,5% de identificações de espécies. Espectros de referência do banco de dados Biotyper 3.0® foram submetidos à identificação com a utilização dos ERs criados a partir de cepas CBS e isolados clínicos e foram evidenciados com erros de identificação: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). Após padronização do protocolo de extração e criação de banco de ERs com cepas CBS e isolados clínicos caracterizados pelo sequenciamento da região IGS, a SM por MALDI-TOF apresentou-se como potente uma ferramenta para a identificação de fungos do gênero Trichosporon. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou um fraco desempenho, relacionado a ERs que foram criados a partir de cepas mal identificadas / Trichosporon spp. are arthrospored yeasts from the Filum Basidiomycota that are known to produce invasive fungal infection (IFI) in patients with immunosupression or other risk factors. After Candida, Trichosporon is the second genus of yeasts responsible for IFI in patients with onco-hematological diseases. The most important species related to human infection are: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. The technology of mass spectrometry (MS) for identification of Trichosporon species has not yet been standardized. However, preliminary promising results can be found in the literature. The objective of this study is to analyse and validate MS MALDI-TOF for the identification of Trichosporon species of medical relevance. This was a multicentric study with collaboration from the Central Laboratory Section from Clinics Hospital of the Medical School from the University of São Paulo (DLC-HCFMUSP), Tropical Medicine Institute from the University of São Paulo (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) and Laboratoire de Parasitologie-Mycologie from the Hospital Saint Antoine of Paris and INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\", Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie of Paris. Ninety three strains/isolates belonging to sixteen Trichosporon species were analysed. Nineteen were purchased from Centraalbureau Schimmelcultures (CBS) yeast collection, 19 belonged to HC-FMUSP and IAL collections, 55 belonged to different French collections. The reference identification method was the IGS1 rDNA sequencing. A protein extraction protocol was first established after comparing the performance of three different methodologies (Bruker(TM), Cassagne et al., Sendid et al.). The mass spectra were obtained through a Microflex LT(TM) mass spectrometer located at the bacteriology laboratory from Saint Antoine Hospital, Paris. Mass spectra, qualitative and quantitative results were produced through the software Biotyper 3.0(TM). The performance of the original main spectrum (MSP) library was compared to other 5 in house libraries built with the combination of MSPs derived from CBS strains (18), clinical strains (7) or (Bruker Daltonics/BD, Germany/USA) (11). The extraction protocol described by Sendid et al. showed better performance when compared to the manufacturer\'s one and was chosen for the subsequent extractions. Among the 6 different reference spectra databases tested, a specific one composed of 18 reference strains plus 7 clinical isolates (database 5) allowed the correct identification of 66 amongst 67 clinical isolates (98,5%). Biotyper 3.0 library produced only 32,3% of correct identifications. Biotyper\'s MSPs were submitted to cross-identification with MSPs derived from CBS strains and clinical isolates and misidentified original MSPs were identified: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). While until now less widely applied to basidiomycetous fungi, MALDI-TOF appears to be a valuable tool for identifying clinical Trichosporon isolates at the species level. The MSP library Biotyper 3.0 showed a poorer performance which was due to misidentified strains utilized as reference for the MSPs

O gênero Trichosporon é composto por leveduras artrosporadas do Filo Basidiomycota e é conhecido agente de infecção fúngica invasiva (IFI) em pacientes imunodeprimidos ou com outros fatores de risco. Em pacientes onco-hematológicos é a principal levedura responsável por IFI depois do gênero Candida. Entre as espécies responsáveis por infecções no homem encontram-se: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. A tecnologia de identificação de fungos por espectrometria de massa (SM) MALDI-TOF ainda carece de padronização para identificação de fungos do gênero Trichosporon, mas a literatura mostra resultados encorajadores. O objetivo deste estudo é padronizar a técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF para a identificação das espécies do gênero Trichosporon de importância médica. O estudo foi realizado em cooperação entre a Divisão de Laboratório Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (DLC, HC-FMUSP), Instituto de Medicina Tropical da USP (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) e Laboratoire de Parasitologie-Mycologie do Hospital Saint Antoine de Paris, vinculado ao grupo de pesquisa INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\" Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie de Paris. Noventa e três cepas/isolados foram analisado(a)s, sendo dezenove cepas de referência adquiridas junto à coleção holandesa Centraalbureau Schimmelcultures (CBS), 19 isolados do HC-FMUSP e IAL, e 55 isolados de diferentes hospitais franceses. A identificação molecular foi realizada através do sequenciamento da região IGS1 do rDNA e foi considerada como método de referência. O protocolo de extração de proteínas foi estabelecido através da comparação do desempenho de três metodologias (Bruker®, Cassagne et al., Sendid et al.). Os espectros de massa foram obtidos no laboratório de bacteriologia do Hospital Saint Antoine de Paris através do aparelho Microflex LT®. A interpretação dos resultados qualitativos e quantitativos (logscore) foi realizada através do Software Biotyper 3.0®. O desempenho de identificação do banco de espectros de referência Biotyper 3.0® foi comparado a outros cinco bancos criados a partir de espectros de referência (ERs) derivados de 18 cepas de referência CBS, sete isolados clínicos e 11 ERs do banco Biotyper 3.0. O protocolo de extração de proteínas descrito por Sendid et al. foi escolhido como protocolo de referência pois os espectros produzidos tiveram logscore superiores àqueles obtidos através do método do fabricante. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou 32,3% de identificações corretas das espécies, sendo que o banco de ERs in house (número 5, constituído cepas CBS e isolados clínicos) apresentou 98,5% de identificações de espécies. Espectros de referência do banco de dados Biotyper 3.0® foram submetidos à identificação com a utilização dos ERs criados a partir de cepas CBS e isolados clínicos e foram evidenciados com erros de identificação: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). Após padronização do protocolo de extração e criação de banco de ERs com cepas CBS e isolados clínicos caracterizados pelo sequenciamento da região IGS, a SM por MALDI-TOF apresentou-se como potente uma ferramenta para a identificação de fungos do gênero Trichosporon. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou um fraco desempenho, relacionado a ERs que foram criados a partir de cepas mal identificadas / Trichosporon spp. are arthrospored yeasts from the Filum Basidiomycota that are known to produce invasive fungal infection (IFI) in patients with immunosupression or other risk factors. After Candida, Trichosporon is the second genus of yeasts responsible for IFI in patients with onco-hematological diseases. The most important species related to human infection are: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. The technology of mass spectrometry (MS) for identification of Trichosporon species has not yet been standardized. However, preliminary promising results can be found in the literature. The objective of this study is to analyse and validate MS MALDI-TOF for the identification of Trichosporon species of medical relevance. This was a multicentric study with collaboration from the Central Laboratory Section from Clinics Hospital of the Medical School from the University of São Paulo (DLC-HCFMUSP), Tropical Medicine Institute from the University of São Paulo (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) and Laboratoire de Parasitologie-Mycologie from the Hospital Saint Antoine of Paris and INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\", Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie of Paris. Ninety three strains/isolates belonging to sixteen Trichosporon species were analysed. Nineteen were purchased from Centraalbureau Schimmelcultures (CBS) yeast collection, 19 belonged to HC-FMUSP and IAL collections, 55 belonged to different French collections. The reference identification method was the IGS1 rDNA sequencing. A protein extraction protocol was first established after comparing the performance of three different methodologies (Bruker(TM), Cassagne et al., Sendid et al.). The mass spectra were obtained through a Microflex LT(TM) mass spectrometer located at the bacteriology laboratory from Saint Antoine Hospital, Paris. Mass spectra, qualitative and quantitative results were produced through the software Biotyper 3.0(TM). The performance of the original main spectrum (MSP) library was compared to other 5 in house libraries built with the combination of MSPs derived from CBS strains (18), clinical strains (7) or (Bruker Daltonics/BD, Germany/USA) (11). The extraction protocol described by Sendid et al. showed better performance when compared to the manufacturer\'s one and was chosen for the subsequent extractions. Among the 6 different reference spectra databases tested, a specific one composed of 18 reference strains plus 7 clinical isolates (database 5) allowed the correct identification of 66 amongst 67 clinical isolates (98,5%). Biotyper 3.0 library produced only 32,3% of correct identifications. Biotyper\'s MSPs were submitted to cross-identification with MSPs derived from CBS strains and clinical isolates and misidentified original MSPs were identified: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). While until now less widely applied to basidiomycetous fungi, MALDI-TOF appears to be a valuable tool for identifying clinical Trichosporon isolates at the species level. The MSP library Biotyper 3.0 showed a poorer performance which was due to misidentified strains utilized as reference for the MSPs

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As leveduras do gênero Trichosporon surgem como patógenos emergentes com altas taxas de morbidade e mortalidade em uma população de imunocomprometidos em crescente expansão. O aumento expressivo de relatos de casos de tricosporonose invasiva e a identificação controversa desse gênero implicam em um déficit epidemiológico que por sua vez, dificulta a compreensão da história natural dessas infecções. Isso conduz a atrasos no diagnóstico e, conseqüentemente, na terapia antifúngica apropriada. A presente investigação teve como objetivos avaliar os aspectos epidemiológicos relacionados à colonização e infecção humana por leveduras do gênero Trichosporon através de metodologias fenotípicas e genotípicas e sua correlação com fatores de virulência in vitro. Avaliamos 112 isolados de pele de indivíduos sadios e 26 isolados de urina (22) e cateter (4) identificados pelo método fenotípico. Dos isolados colonizantes (112) as seguintes espécies foram identificadas: T. cutaneum (29,46%), T. asteroides (20,53%), T. ovoides (15,17%), T. inkin (10,71%), T. mucoides (8,92%) e T. asahii (6,25%). Dentre os isolados de urina e cateter as espécies identificadas foram T. asahii, a espécie mais isolada (n = 23; 76,66%), seguido por T. inkin (n = 5; 16,66%) e T. asteroides (n = 2; 6,6%). Na identificação genotípica das leveduras do gênero Trichosporon utilizamos as regiões ITS e IGS do DNA ribossômico. Após a análise filogenética constatamos que a região que melhor discrimina as espécies é a IGS, assim o padrão ouro para nossa investigação foi baseado nessa região. Nos isolados de urina e cateter a espécie T. asahii foi predominante, sendo identificada em 22 isolados (84,6%), seguida por dois isolados de T. inkin (7,69%). T. coremiiforme e T. debeurmannium foram isolados em uma amostra cada (3,84%). Quando comparamos os dados obtidos pela identificação molecular e fenotípica observamos que apenas em 30% dos isolados (21/70), a identificação fenotípica foi capaz de identificar corretamente os isolados de Trichosporon spp. Como ferramenta epidemiológica analisamos o polimorfismo das sequências de T. asahii, segundo a classificação em genótipos. A análise bayesiana classificou o isolado 062 pertencente ao genótipo 3, o isolado 002 pertencente ao genótipo 4 e nenhum isolado pertencente aos genótipos 5, 6 e 7. Da mesma forma não podemos afirmar com qual genótipo, 1 ou 2, o restante dos isolados mais se assemelha devido à grande politomia e a baixa probabilidade a posteriori dos ramos. Avaliamos como fatores de virulência a produção de exoenzimas (Proteinase, Fosfolipase e DNAse) e Índice de adesão desses isolados, sendo possível observar que existe dois padrões distintos: isolados colonizantes com baixa produção de exoenzimas e pouco aderentes e isolados de urina e cateter com produção pronunciada de exoenzimas e com índice de aderência elevados. / Yeasts of the genus Trichosporon appear as emerging pathogens with high rates of morbidity and mortality in immunocompromised patients and is becoming increasingly widespread. The significant increase of invasive tricosporonose and the controversial identification of this kind imply an epidemiological deficit which in turn complicates the understanding of the natural history of these infections, leading to delays in diagnosis and, consequently, appropriate antifungal therapy. The present study aimed to evaluate the epidemiological aspects related to human colonization and infection by Trichosporon spp. through phenotypic and genotypic methods and its correlation with virulence factors in vitro. We evaluated 112 isolates from skin of healthy individuals and 26 isolates from urine (22) and catheter (4) identified by the phenotypic method. Among the colonizing isolates (112) the following species were identified: T. cutaneum (29.46%), T. asteroides (20.53%), T. ovoides (15.17%), T. inkin (10.71%), T. mucoid (8.92%) and T. asahii (6.25%). Among the isolates from urine and catheter the species identified were T. asahii the most species isolated (n = 23; 76.66%), followed by T. inkin (n = 5; 16.66%) and T. asteroides (n = 2, 6.6%). For the genotypic identification of yeasts Trichosporon, the ITS and IGS regions of ribosomal DNAwere used. After phylogenetic analysis, the region that better discriminates the species is IGS, and the gold standard for our investigation was based in that region. In isolates from urine and catheter the T. asahii was the predominant species, being identified in 22 isolates (84.6%), followed by two T. inkin (7.69%). T. coremiiforme and T. debeurmannium were isolated in one sample each (3.84%). When comparing the data obtained by molecular and phenotypic identifications it was observed that only in 30% of the isolates (21/70), the phenotypic identification was able to correctly identify isolates of Trichosporon spp. The polymorphism of the sequences of T. asahii, was analyzed according to the classification of genotypes. Bayesian analysis classified the 062 isolate belonging to genotype 3, the isolated 002 belonging to genotype 4 and no isolate belonging to genotypes 5, 6 and 7. Likewise we cannot say with which genotype 1 or 2, the remainder of the isolates most closely because of the large polytomous and low posterior probability of the branches. Evaluated as virulence factors of production of exoenzymes (proteinase, phospholipase and DNase) and index of adhesion of these isolates and it was observed that there are two distinct patterns: isolates colonizing lowexoenzymes and loosely adhering, and isolated from urine and catheter pronounced production of exoenzymes and high rate of adherence. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações