Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T18:42:14Z No. of bitstreams: 2 Tese - Luiz Augusto Pereira - 2008.pdf: 11628724 bytes, checksum: 97ca17282a858a05078e31d8a06bfefe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T18:42:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Luiz Augusto Pereira - 2008.pdf: 11628724 bytes, checksum: 97ca17282a858a05078e31d8a06bfefe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-29T18:42:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Luiz Augusto Pereira - 2008.pdf: 11628724 bytes, checksum: 97ca17282a858a05078e31d8a06bfefe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2008-09-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides brasiliensis, an important human pathogen causative of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. Adhesion to and invasion of host cells are essential steps involved in the infection and dissemination of pathogens. Furthermore, pathogens use their surface molecules to bind to host extracellular matrix components to establish infection. An adhesin of P. brasiliensiswas isolated from two dimensional electrophoresis and characterized. Peptides obtained by partial sequencing of the isolated protein, which presenteda molecular mass of 29 kDa and pI 5.8, were subjected to sequence analysis of their amino acids, that revealed strong homology to triose phosphate isomerase (TPI) from several sources. The complete cDNA and gene encoding TPI of P. brasiliensis (PbTPI) were characterized and both contained an open reading frame predicted to encode a 249 amino acid protein that presented all the peptides characterized in the native PbTPI. The complete coding PbTPI cDNA was cloned and over expressed in Escherichia coli host. The purified recombinant TPI was used to produce polyclonal antibody in rabbit. By immunoelectron microscopy and Western blot analysis, TPI was detected in the cell wall and the cytoplasm of the yeast phase of P. brasiliensis. The expression of PbTPI was analyzed in transition from mycelia to yeast phase. The native PbTPI is preferentially expressed in the yeast parasitic phase of P. brasiliensis. The recombinant PbTPI was found to bind to laminin and fibronectin in ligand far-Western blot assays. TPI binds preferentially to laminin, as determined by peptide inhibition assays. Of special note, the treatment of P. brasiliensisyeast cells with anti-PbTPI polyclonal antibody and the incubation of pneumocytes and VERO cells with the recombinant protein promoted inhibition of adherence and internalization of P. brasiliensisto those in vitrocultured cells. These observations indicate that TPI could be contribute to the adhesion of the microorganism to host tissues and to the dissemination of infection. / Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e a invasão de células são eventos essenciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Para isso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar a componentes da matriz extracelular e estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensisfoi isolada a partir do gel de eletroforese bidimensional de proteínas totais do fungo e caracterizada. Peptídeos obtidos por sequenciamento parcial da proteína de 29 kDa e pI 5.8 mostraram homologia com triose fosfato isomerase (TPI) de diversos organismos. O cDNA e o gene completos que codificam para TPI de P. brasiliensis (PbTPI) foram caracterizados, e ambos contém uma ORF que codifica para uma proteína com 249 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbTPI nativa. O cDNA completo que codifica para PbTPI foi expresso em Escherichia coli. A proteína recombinante TPI foi utilizada para produção de anticorpo policlonal em coelho. Através de imunomicroscopia de transmissão eletrônica e análises por Western blotting, foi detectada a presença da TPI, na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e no citoplasma. A expressão da PbTPI foi analisada na transição das fases de micélio para levedura. A PbTPI nativa está preferencialmente expressa na fase parasitária de P. brasiliensis. A PbTPI recombinante foi capaz de se ligar a laminina e fibronectina em ensaios de Western blotting de afinidade. PbTPI se liga preferencialmente a laminina, como foi determinado por ensaio de inibição com peptídeos sintéticos. Uma observação importante, é que tanto o tratamento de P. brasiliensiscom anticorpo anti-PbTPI, quanto de pneumócitos e células VERO tratados com a TPI recombinante, promoveram considerável inibição da aderência e internalização de P. brasiliensisàs células cultivadas in vitro. Essas observações indicam que a TPI possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do hospedeiro e para a disseminação da infecção.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:37:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renato Ferraz Penteado.pdf: 5510615 bytes, checksum: a1e326883a6f1e7ad0decd6835add201 (MD5) Previous issue date: 2016-08-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Knowledge of protein structures is of huge importance, since this information allows to understand the mechanisms through which proteins carry out their biological functions. Lipases constitute an enzymatic family capable to perform synthesis or hydrolysis of ester bonds of triacyl glycerols (TAGs) with long chain fatty acids.These enzymes are the theme of many investigations given their potential to be used in a wide variety of apllications involving chemicals with the ester functional group,e.g., in organic synthesis. On the other hand, structural knowledge of some enzymes is important for the development of new therapeutic drugs or even to contribute for the understanding of structural evolutionary features, like those belonging to metabolic pathways. In this work were accomplished the homology modeling of the lipase from Jatropha curcas and the structure determination of the triosephosphate isomerase from Naegleria gruberi from three X ray diffraction data sets. Among three experimental structures obtained, two belong to C2 space group, with different unit cells, and one to P4122 space group. Initial phases were obtained by molecular replacement procedure using the Phaser program and all structures were refined interactively with Coot and Phenix programs. In one structure it was possible to model three molecules of the precipitant agent Jeffamine present in the crystallization solution and one molecule of Tris buffer (placed at the active site). Structural comparisons were performed among the refined and validated model and some of its homologues, taking into account the differences observed in the structural-based alignment among them and characteristics noticed during the refinement procedure. Circular dichroism experiments have shown that thermal denaturation is irreversible to triosephosphate isomerase of Naegleria gruberi. / O conhecimento da estrutura de proteínas é de grande importância, uma vez que esta informação permite o entendimento dos mecanismos pelos quais elas desempenham suas funções biológicas. Lipases constituem uma família enzimática capaz de realizar a síntese ou hidrólise de ligações éster de substratos triacilgliceróis (TAGs) contendo ácidos graxos de cadeia longa. São alvo de muitos estudos dadas suas potencialidades em um grande número de aplicações envolvendo o grupo funcional éster, por exemplo, em química orgânica síntética. Já o conhecimento estrutural de algumas enzimas é importante para o desenvolvimento de novas drogas terapêuticas ou mesmo contribuir para o entendimento de aspectos evolutivos estruturais, como daquelas pertencentes a vias metabólicas. Neste trabalho foram realizadas a modelagem por homologia da estrutura lipase da planta Jatropha curcas e a determinação experimental da estrutura da triose fosfato isomerase do microrganismo Naegleria gruberi a partir de três conjuntos de imagens de difração de Raios X. Das três estruturas experimentais obtidas, duas pertencem ao grupo de espaço C2, com células unitárias diferentes, e uma ao grupo de espaço P4122. As fases iniciais foram obtidas com o procedimento de substituição molecular utilizando o programa PHASER e todas as estruturas foram refinadas iterativamente com o auxílio dos programas COOT e PHENIX. Em uma das estruturas foi possível modelar três moléculas do agente precipitante Jeffamine® presente na condição de cristalização e uma molécula do tampão Tris (no sítio ativo do monômero B). Comparações estruturais foram realizadas entre o modelo refinado e validado e algumas das proteínas homólogas, tendo em vista diferenças observadas no alinhamento baseado em estrutura entre elas e características notadas durante o procedimento de refinamento. Experimentos de dicroísmo circular mostraram que a desnaturação térmica é irreversível para esta proteína.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-12-15T16:53:37Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Augusto Pereira - 2004.pdf: 6566857 bytes, checksum: 144c5557e8a138c6a21c528ad0262aa8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-12-15T17:01:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Augusto Pereira - 2004.pdf: 6566857 bytes, checksum: 144c5557e8a138c6a21c528ad0262aa8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-15T17:01:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Augusto Pereira - 2004.pdf: 6566857 bytes, checksum: 144c5557e8a138c6a21c528ad0262aa8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2004-05-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / An antigen of Paracoccidioides brasiliensis (Pb) was gel isolated and characterized. Endoproteinase Lys-C digested peptides of the purified protein which presented, molecular mass of 29-kDa and pI of 5.8, were subjected to sequence analysis of its amino acids. Search at databases comparing the sequence of amino acids from the three peptides of the native protein, revealed strong homology to triosephosphate isomerase (TPI: E.C. 5.3.1.1) from several sources. The complete cDNA and gene encoding PbTPI were obtained and both contained an open reading frame predicted to encode a 249 amino acid protein that presented all the peptides characterized in the native PbTPI. The Pbtpi gene contained 6 exons interrupted by 5 introns. Analysis performed with the deduced PbTPI suggested its usefulness in providing phylogenetic relatedness, as well as evidenced the correlation between the phylogeny provided by the deduced proteins and introns positions in the cognate genes. The immunological reactivity of PbTPI was examined. The complete coding cDNA of PbTPI was over expressed in an Escherichia coli host to produce high levels of recombinant fusion protein with glutathione S-transferase (GST) that has been purified by affinity chromatography. The purified recombinant TPI was recognized by sera of patients with confirmed Paracoccidioidomycosis and not by sera of healthy individuals. Thus, recombinant PbTPI can be a valuable addition to the still small arsenal of P. brasiliensis immunoreactive proteins, which could be tested for incorporation in assays for serodiagnosis of the disease. / Um antígeno de Paracoccidioides brasiliensis (Pb) foi isolado do gel e caracterizado. Os peptídeos digeridos por Endoproteinase Lys-C da proteína purificada, que apresentou uma massa molecular de 29-kDA e pI de 5.8, foram submetidos à análise da seqüência de aminoácidos. Uma busca em bancos de dados de seqüências de aminoácidos comparados com os três peptídeos da proteína nativa revelou forte homologia com triose fosfato isomerase (TPI: E.C. 5.3.1.1) de vários organismos. O cDNA e o gene completos que codificam para PbTPI foram obtidos, e ambos contém uma provável ORF que codifica para uma proteína com 249 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbTPI nativa. O gene Pbtpi apresentou 6 exons interrompidos por 5 introns. Análises realizadas com a PbTPI deduzida sugerem sua utilidade em prover relações filogenéticas, como também evidenciou a correlação entre a filogenia gerada pelas proteínas deduzidas e as posições dos introns nos genes cognatos. A reatividade imunológica da PbTPI foi examinada. O cDNA completo que codifica para PbTPI foi altamente expresso no hospedeiro Escherichia coli, produzindo altos níveis de uma proteína recombinante fundida a glutathione S-transferase (GST), que foi purificada por cromatografia de afinidade. A TPI recombinante purificada foi reconhecida por soros de pacientes com paracoccidioidomicose confirmada e não por soros de indivíduos saudáveis. Assim, PbTPI recombinante pode ser uma adição valiosa para o pequeno arsenal de proteínas imunoreativas de P. brasiliensis, que poderiam ser testadas por incorporação em ensaios de sorodiagnóstico da doença.