Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseLTGS.pdf: 4761977 bytes, checksum: fd63c5cb5025f3d28cda158a969b6afd (MD5) Previous issue date: 2001-06-21 / Financiadora de Estudos e Projetos / The parasitic Trypanosoma brucei is the causative agent of African Trypanosomiasis (sleeping sickness) in humans, and nagana in animals and is responsible for heavy socioeconomic losses in most countries of sub-Saharan Africa. Therapy against sleeping sickness is unsatisfactory because the toxicity and arising of the drug resistant parasites. Trypanosomatids contain a single mitochondrion, the kinetoplast, whose genetic code deviates from the universal code where a UGA stop codon is used as a Trp codon. A single nuclear-encoded tRNATrp(CCA), that can decode the canonical Trp codon, is used by both the nucleus and mitochondria genes. A C to U editing event at position 34 of tRNATrp(CCA) changes the anticodon from CCA to UCA allowing the decoding of the UGA stop codon to Trp from the mitochondrial genes. We have identified two different nuclear-encoded tryptophanyl-tRNA-synthetase (WARSs) genes (one cytoplasmic (WARS1) and the other to the kinetoplast (WARS2)) in both Leishmania and Trypanosoma cells. With the purpose to validate the mitochondrial WARS enzymes of trypanosomatids, as potential drug targets, we performed gene silencing (RNAi) experiments with both WARSs forms from T. brucei. In the conditions tested, the expression of dsRNA from a dual promoter system generated potent RNA silencing, leading to clear phenotypes characterized by morphologic alterations, severe growth inhibition, reduction in the levels of oxygen consumed (only TbWARS2) and cellular death. The efficiency and specificity of silencing were estimated by quantitative PCR and significant modifications of the specific amount of TbWARSs mRNA were evidenced. / O parasita Trypanosoma brucei é o agente causal da Tripanossomíases Africana (doença do sono) em humanos e nagana em animais, cujo impacto socioeconômico é devastador nos paises sub-Saharianos da África. Atualmente, as terapias existentes contra esta doença são insatisfatórias, devido a sua toxicidade e ao surgimento de linhagens resistentes. Tripanosomatídeos contem uma simples mitocôndria, o kinetoplasto, cujo código genético desvia do código universal, onde o códon de parada UGA é usado como códon para Trp. Um simples tRNATrp(CCA) codificado no núcleo, decodifica o códon canônico Trp, usado para a tradução dos genes nucleares e mitocondriais. O evento de editoramento C por U na posição 34 do tRNATrp(CCA) muda o anticódon de CCA para UCA, permitindo a decodificação do códon de parada UGA para Trp, nos genes mitocondriais. No genoma de Leishmania e Trypanosoma, foram identificados dois genes nucleares para Triptofanil-tRNA sintetases (WARSs), uma citoplasmática (WARS1) e outra mitocondrial (WARS2). Com o propósito de validar a WARS mitocondrial de tripanosomatídeos, como um potencial alvo farmacológico, foi realizado o silenciamento gênico (RNAi) de ambos genes WARSs de T. brucei. Nas condições testadas, a expressão do dsRNA gerou um potente silenciamento, levando ao desenvolvimento de um fenótipo caracterizado por alterações morfológicas, drástica inibição do crescimento, redução nos níveis de oxigênio consumido (somente na TbWARS2) e morte celular. A eficiência e especificidade do silenciamento foram estimadas por PCR quantitativo e foram evidenciadas significativas modificações na quantidade de mRNA específico para as TbWARSs.