A sequência de 35 aminoácidos da alça V3 da gp120 do gene env do HIV-1 é o principal determinante do tropismo viral pelos correceptores CCR5 ou CXCR4, utilizados pelo HIV-1 para a entrada na célula. O desenvolvimento de estratégias antirretrovirais baseadas no uso dos correceptores representa um avanço importante para o controle da progressão da infecção. Entretando, o uso clínico dos antagonistas de CCR5 implica na determinação do tropismo das cepas virais do indivíduo infectado e os programas preditores de bioinformática para a determinação do tropismo poderiam ser uma alternativa mais acessível para a triagem dos candidatos ao uso dos antagonistas de CCR5. Este estudo teve como objetivo utilizar ferramentas de bioinformática para a predição de tropismo e avaliar sua aplicabilidade na prática clínica. Foram coletadas amostras de sangue periférico de 101 indivíduos infectados pelo HIV-1 e sob acompanhamento clínico, dos quais foram extraídas amostras de DNA proveniente de PBMCs. As amostras de DNA foram amplificadas por PCR para a região da alça V3, das quais foram obtidas 94 sequências. Os sistemas preditivos foram avaliados utilizando 185 sequências com tropismo conhecido provenientes de banco de dados. Com base nesta análise foi possível elaborar um algoritmo para a predição do tropismo com 94% de confiabilidade. Assim, a predição das 94 amostras demonstrou uma prevalência de 80% (n=75) de cepas R5 e 20% (n=19) de cepas X4. Os sistemas preditivos de tropismo podem representar uma importante estratégia para a triagem dos candidatos ao uso dos antagonistas de coreceptor, porém, não são capazes de substituir completamente os ensaios padrão-ouro para a determinação do tropismo. / The 35 amino acids of the V3-gp120 of HIV-1 env gene is the main determinant of viral tropism by the coreceptors CCR5 and CXCR4 used for HIV-1 cell entry. The development of antiretroviral strategies based on the coreceptor usage represents an important step to control the infection progression. However, the clinical application of CCR5 antagonists involves the coreceptor usage determination of viral strains in the infected individual. The bioinformatics predictive programs for coreceptor usage determination could be a more available alternative for screening candidates to receive CCR5 antagonists. This study aimed to employ bioinformatics tools to predict tropism and assess its applicability in clinical practice. Peripheral blood samples were collected from 101 individuals infected with HIV-1 and under clinical follow-up. DNA samples were extracted from PBMCs. The DNA samples were amplified by PCR and 94 V3 sequences were obtained. The predictive systems were evaluated using 185 sequences of known tropism from a database. This analysis provides the construction of an algorithm showing 94% of reliability. Thus, the 94 sample prediction showed a prevalence of 80% (n=75) of R5 strain and 20% (n=19) of X4 strain. The predictive systems could be an important strategy in the screening of the tropism. Nonetheless, they are not able to fully replace the coreceptor usage gold-standard assays.

A sequência de 35 aminoácidos da alça V3 da gp120 do gene env do HIV-1 é o principal determinante do tropismo viral pelos correceptores CCR5 ou CXCR4, utilizados pelo HIV-1 para a entrada na célula. O desenvolvimento de estratégias antirretrovirais baseadas no uso dos correceptores representa um avanço importante para o controle da progressão da infecção. Entretando, o uso clínico dos antagonistas de CCR5 implica na determinação do tropismo das cepas virais do indivíduo infectado e os programas preditores de bioinformática para a determinação do tropismo poderiam ser uma alternativa mais acessível para a triagem dos candidatos ao uso dos antagonistas de CCR5. Este estudo teve como objetivo utilizar ferramentas de bioinformática para a predição de tropismo e avaliar sua aplicabilidade na prática clínica. Foram coletadas amostras de sangue periférico de 101 indivíduos infectados pelo HIV-1 e sob acompanhamento clínico, dos quais foram extraídas amostras de DNA proveniente de PBMCs. As amostras de DNA foram amplificadas por PCR para a região da alça V3, das quais foram obtidas 94 sequências. Os sistemas preditivos foram avaliados utilizando 185 sequências com tropismo conhecido provenientes de banco de dados. Com base nesta análise foi possível elaborar um algoritmo para a predição do tropismo com 94% de confiabilidade. Assim, a predição das 94 amostras demonstrou uma prevalência de 80% (n=75) de cepas R5 e 20% (n=19) de cepas X4. Os sistemas preditivos de tropismo podem representar uma importante estratégia para a triagem dos candidatos ao uso dos antagonistas de coreceptor, porém, não são capazes de substituir completamente os ensaios padrão-ouro para a determinação do tropismo. / The 35 amino acids of the V3-gp120 of HIV-1 env gene is the main determinant of viral tropism by the coreceptors CCR5 and CXCR4 used for HIV-1 cell entry. The development of antiretroviral strategies based on the coreceptor usage represents an important step to control the infection progression. However, the clinical application of CCR5 antagonists involves the coreceptor usage determination of viral strains in the infected individual. The bioinformatics predictive programs for coreceptor usage determination could be a more available alternative for screening candidates to receive CCR5 antagonists. This study aimed to employ bioinformatics tools to predict tropism and assess its applicability in clinical practice. Peripheral blood samples were collected from 101 individuals infected with HIV-1 and under clinical follow-up. DNA samples were extracted from PBMCs. The DNA samples were amplified by PCR and 94 V3 sequences were obtained. The predictive systems were evaluated using 185 sequences of known tropism from a database. This analysis provides the construction of an algorithm showing 94% of reliability. Thus, the 94 sample prediction showed a prevalence of 80% (n=75) of R5 strain and 20% (n=19) of X4 strain. The predictive systems could be an important strategy in the screening of the tropism. Nonetheless, they are not able to fully replace the coreceptor usage gold-standard assays.

A descoberta do tropismo do Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) pelos correceptores CCR5 e CXCR4 propiciou o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas com alvo nestes correceptores. Os antagonistas de CCR5 são fármacos que bloqueiam o correceptor CCR5, impedindo a entrada do (HIV) na célula, levando a uma diminuição significativa da viremia. Porém, a administração deste medicamento depende da determinação do tropismo dos vírus do indivíduo infectado antes e ao longo do uso desta estratégia terapêutica. A alça V3 da gp120 do envelope do HIV-1 é considerada o principal determinante do tropismo, mas outros fatores como diferenças intrínsecas entre as variantes do HIV-1, o número de sítios de N-glicosilação, variações no comprimento de determinadas regiões e a carga elétrica global da gp120 também podem afetar o tropismo viral. Este estudo apresenta a caracterização molecular da gp120 e a relação dos fatores moleculares com o tropismo pelos correceptores CCR5 e CXCR4. Foram incluídos no estudo 283 indivíduos infectados pelo HIV-1, dos quais foi possível obter 265 sequências da alça V3, resultados de tropismo fenotípico para 78 amostras e 20 sequências da gp120 completa. O tropismo fenotípico demonstrou a prevalência de vírus R5 (70,5%) e a presença de apenas uma amostra contendo exclusivamente vírus X4. O tropismo genotípico classificou 71,7% das sequências como vírus R5 e 28,2% como capazes de utilizar o correceptor CXCR4. A concordância entre os resultados de tropismo fenotípico e genotípico foi de 74,5%. Houve a prevalência do subtipo B (82%), sendo que a variante B\'(GWGR) esteve presente em 34,5% dos casos. Em média, as sequências da gp120 apresentaram 22 sítios de N-glicosilação, concentrados nas regiões C2 e C4. A carga elétrica líquida apresentou médias semelhantes entre vírus R5 e X4 tanto para a alça V3 quanto para a gp120. As características moleculares descritas neste estudo apresentaram distribuição semelhante entre vírus R5 e X4, não sendo possível estabelecer relações entre estes fatores a determinação do tropismo. / The tropism of Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV - 1) for CCR5 and CXCR4 coreceptors has provided the development of new therapeutic strategies targeting these coreceptors. CCR5 antagonists are able to prevent the HIV cell entry by blocking the CCR5 coreceptor, improving the viremia decreasing. However, this drug administration depends on viral tropism determination before and during the use of this therapeutic strategy. The V3 loop of the HIV-1 gp120 envelope is the major tropism determinant, but other factors such HIV-1 genetic variability, number of potential N-linked glycosylation sites, length variations in some protein domains and the gp120 global net charge may also affect the viral tropism. This study presents the molecular characterization of gp120 and the relationship between molecular factors and the tropism for CCR5 and CXCR4 coreceptors. A total of 283 HIV-1 infected subjects were included in this study. It was possible to obtain 265 V3 loop sequences, 78 results of phenotypic tropism and 20 sequences of the whole gp120. Phenotypic tropism showed the prevalence of R5 viruses (70.5%) while exclusively X4 viruses were found in only one sample. Genotypic tropism classified 71.7% of the sequences as R5 and 28.2% as virus able to use the CXCR4 correceptor. The agreement between phenotypic and genotypic tropism results was 74.5%. There was a prevalence of subtype B (82%), and the B\' (GWGR) variant was present in 34.5% of the cases. gp120 showed a mean of 22 N-linked glycosylation sites, which were more frequent in the C2 and C4 regions. The net charge showed similar means between R5 and X4 viruses for both V3 loop and gp120. The molecular characteristics described in this study showed similar distribution between R5 and X4 viruses and it was not possible to establish relationships between these factors the tropism determination.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-08-13T16:57:51Z No. of bitstreams: 1 Tese_ISC_Alex José Leite Torres.pdf: 1506694 bytes, checksum: 5e8d47ad1e02ea0fc8fe10e9e6543865 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-13T16:57:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ISC_Alex José Leite Torres.pdf: 1506694 bytes, checksum: 5e8d47ad1e02ea0fc8fe10e9e6543865 (MD5) / Departamento Nacional DST e AIDS e Hepatites Virais / RACIONAL: Tropismo viral e carga proviral do HIV possuem papel fundamental para o auxílio da introdução de terapia e avaliação da patogênese do vírus, respectivamente, os quais são determinados, atualmente, por técnicas de genotipagem e fenotipagem. Outro importante parâmetro para monitoramento laboratorial do sistema imune do paciente HIV positivo é a determinação de valores de referências dos linfócitos T, dados esses inexistente para a população brasileira que é caracterizada por uma grande diversidade étnica e cultural. OBJETIVOS: Determinar a sensibilidade e especificidade da citometria de fluxo para detecção intracitoplasmática do HIV-1, identificando o tropismo viral e carga proviral deste vírus e estabelecer valores de referências das subpopulações dos linfócitos T na população brasileira. MÉTODOS: Para a detecção do vírus intracelular, foram avaliados 102 pacientes soropositivos para o HIV-1, atendidos no Hospital Universitário Professor Edgard Santos, estratificado em estágios de viremia diferenciados e para a determinação dos valores de referências das células T, foram triados 645 doadores de sangue de 03 hemocentros e 02 hospitais universitários, das cinco regiões brasileiras, além de 280 crianças atendidas em dois hospitais universitários, um no Rio de Janeiro e outro na Bahia. Amostras foram submetidas a marcação através de anticorpos monoclonais anti-CD3+, anti-CD4+, anti-CD8+, anti-CD45+, anti-CCR5+ e anti- CXCR4 e probe complementar das regiões gag e pol do HIV para a avaliação da imunofenotipagem celular.RESULTADOS: A determinação do tropismo viral por imunofenotipagem obteve uma elevada correlação com os resultados comparados com geno2pheno representando 97.2% de especificidade e 95% de intervalo de confiança com variação entre 85.8%-99.5%. Pacientes controladores de elite apresentaram uma siginificante diferença da carga proviral em comparação com pacientes com cargas virais plasmáticas indetectáveis e detectáveis em terapia. Pacientes com tropismo CCR5 e carga viral indetectável há menos de cinco anos apresentaram carga proviral mais elevada em comparação aos indetectáveis há mais de cinco anos. Os valores de referência dos linfócitos T CD4+ na população brasileira mostraram-se variáveis entre as regiões, sendo São Paulo e Rio Grande do Sul superiores em comparação às demais regiões, o que caracteriza a importância da influência étcnica e cultural entre a diversidade das populações. CONCLUSÃO: Os testes de tropismo viral e carga proviral por citometria de fluxo apresentaram-se como importantes ferramentas tendo significante diminuição do custo e do tempo de procedimento e também devem ser adotados valores de referências diferenciados nas regiões do Brasil, devido a características peculiares regionais em suas populações. / Salvador

Submitted by Ana Paula Macedo (ensino@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:29:19Z No. of bitstreams: 1 NOEMIA SANTANA LIMA.pdf: 3498499 bytes, checksum: a5726622efcddf45a18f49e17d2f093f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:29:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NOEMIA SANTANA LIMA.pdf: 3498499 bytes, checksum: a5726622efcddf45a18f49e17d2f093f (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Febre Amarela, uma doença causada por um representante do gênero Flavivírus, é caracterizada principalmente por grave injúria hepática que pode levar ao óbito. Há 70 anos, esta doença tem sido controlada por uma vacina constituída do vírus atenuado cepa 17D, que apresenta raríssimos casos de efeitos adversos. O vírus vacinal exibe replicação limitada no hospedeiro, porém com significativa disseminação da massa viral, levando a uma resposta imune forte e de longa duração. Devido a estas qualidades, o uso do vírus FA 17D como um vetor de expressão mostra-se atraente para desenvolvimento de novas vacinas humanas. Apenas recentemente a vacina contra a febre amarela vem sendo estudada para esclarecimento dos mecanismos da imunidade gerada pelo vírus 17D e pouco é sabido sobre o tropismo e sítios de proliferação viral. Este trabalho investigou o potencial proliferativo do vírus FA 17D como modelo para o estudo de outros vírus recombinantes produzidos no laboratório, com o objetivo de caracterizar o grau de dispersão viral em diferentes órgãos. Para tanto, camundongos isogênicos (BALB/c) foram inoculados por via subcutânea na região dorsal com 105 ou 2 x 106 PFU do vírus 17DD. Após 1, 2, 4, 7 e 11 dias foram colhidos o soro, a pele do sítio de inoculação, os linfonodos drenantes, o fígado e o baço para detecção do RNA viral por RT-PCR semi-nested e quantificação da carga viral por qRT-PCR. Verificou-se que com a dose maior mais camundongos apresentaram RNA viral nos órgãos e o vírus atingiu fígado e baço mais precocemente, sendo detectado também no soro a partir do 1º dia pós-inoculação. Pele e linfonodo drenante do local da inoculação parecem ser sítios de replicação primária, onde o RNA viral foi detectado nos primeiros dias de infecção, com queda da carga viral após o 7º dia. Foram dosados alguns marcadores de função hepática (AST, ALT e bilirrubina) para verificar se a imunização com o vírus 17DD poderia induzir disfunções ou lesões hepáticas, porém os resultados não mostraram diferença significativa entre o grupo vacinado e o grupo controle, mostrando que a vacina não afeta o funcionamento do fígado. Tentamos ainda avaliar alterações no perfil de citocinas séricas após imunização com o vírus 17DD através do ensaio de detecção múltipla, porém a técnica não foi sensível o suficiente para detectar qualquer alteração. O modelo estabelecido neste trabalho poderá servir como base de comparação para avaliação de novos candidatos vacinais constituídos de vírus FA recombinantes. / The Yellow Fever, a disease caused by a virus of the genus Flavivirus, is mainly characterized by severe liver injury that can lead to death. For 70 years, this disease has been controlled by a vaccine consisting of attenuated virus strain 17D, which features rare cases of adverse effects. The vaccine virus shows limited replication in the host, but with significant spread of the viral mass, leading to a strong and long lasting immune response. Because of these qualities, the use of FA 17D virus as an expression vector has been attractive for developing new human vaccines. Only recently the vaccine against yellow fever has been studied to elucidate mechanisms of immunity activated by FA 17D virus and little is known about viral tropism and its sites of proliferation. This study investigated the proliferative potential of FA 17D virus as a model for studying other recombinant viruses produced in the laboratory with the aim of characterizing the degree of viral spread in different organs. Inbred mice (BALB/c) were inoculated subcutaneously in the dorsal region with 105 or 2 x 106 PFU of 17DD virus. After 1, 2, 4, 7 and 11 days, we harvested serum, the skin of the inoculation site, draining lymph node, liver and spleen for detection of viral RNA by semi-nested RT-PCR and viral load quantification by qRT-PCR. It was found that with higher doses it is possible to detect more viral RNA in organs. Hence, since the first day post-vaccination, we could detect the virus in liver, spleen and serum. Furthermore, skin and draining lymph node of the site of inoculation seem to be primary sites of replication, where the viral RNA was detected in the first days of infection, with a drop in viral load after 7 days. We measured some markers of liver function (AST, ALT and bilirubin) to verify if the immunization with 17DD virus could induce dysfunction or liver injury, but the results showed no significant difference between vaccinated and control groups, showing that the vaccine does not affect liver function. We also tried to evaluate changes in serum cytokine profile after immunization with 17DD virus by multiple detection assay, but the technique was not sensitive enough to detect any change. The model established in this work can serve as a basis of comparison for evaluation of new recombinant YF 17D virus vaccine candidates.

A descoberta do tropismo do Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) pelos correceptores CCR5 e CXCR4 propiciou o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas com alvo nestes correceptores. Os antagonistas de CCR5 são fármacos que bloqueiam o correceptor CCR5, impedindo a entrada do (HIV) na célula, levando a uma diminuição significativa da viremia. Porém, a administração deste medicamento depende da determinação do tropismo dos vírus do indivíduo infectado antes e ao longo do uso desta estratégia terapêutica. A alça V3 da gp120 do envelope do HIV-1 é considerada o principal determinante do tropismo, mas outros fatores como diferenças intrínsecas entre as variantes do HIV-1, o número de sítios de N-glicosilação, variações no comprimento de determinadas regiões e a carga elétrica global da gp120 também podem afetar o tropismo viral. Este estudo apresenta a caracterização molecular da gp120 e a relação dos fatores moleculares com o tropismo pelos correceptores CCR5 e CXCR4. Foram incluídos no estudo 283 indivíduos infectados pelo HIV-1, dos quais foi possível obter 265 sequências da alça V3, resultados de tropismo fenotípico para 78 amostras e 20 sequências da gp120 completa. O tropismo fenotípico demonstrou a prevalência de vírus R5 (70,5%) e a presença de apenas uma amostra contendo exclusivamente vírus X4. O tropismo genotípico classificou 71,7% das sequências como vírus R5 e 28,2% como capazes de utilizar o correceptor CXCR4. A concordância entre os resultados de tropismo fenotípico e genotípico foi de 74,5%. Houve a prevalência do subtipo B (82%), sendo que a variante B\'(GWGR) esteve presente em 34,5% dos casos. Em média, as sequências da gp120 apresentaram 22 sítios de N-glicosilação, concentrados nas regiões C2 e C4. A carga elétrica líquida apresentou médias semelhantes entre vírus R5 e X4 tanto para a alça V3 quanto para a gp120. As características moleculares descritas neste estudo apresentaram distribuição semelhante entre vírus R5 e X4, não sendo possível estabelecer relações entre estes fatores a determinação do tropismo. / The tropism of Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV - 1) for CCR5 and CXCR4 coreceptors has provided the development of new therapeutic strategies targeting these coreceptors. CCR5 antagonists are able to prevent the HIV cell entry by blocking the CCR5 coreceptor, improving the viremia decreasing. However, this drug administration depends on viral tropism determination before and during the use of this therapeutic strategy. The V3 loop of the HIV-1 gp120 envelope is the major tropism determinant, but other factors such HIV-1 genetic variability, number of potential N-linked glycosylation sites, length variations in some protein domains and the gp120 global net charge may also affect the viral tropism. This study presents the molecular characterization of gp120 and the relationship between molecular factors and the tropism for CCR5 and CXCR4 coreceptors. A total of 283 HIV-1 infected subjects were included in this study. It was possible to obtain 265 V3 loop sequences, 78 results of phenotypic tropism and 20 sequences of the whole gp120. Phenotypic tropism showed the prevalence of R5 viruses (70.5%) while exclusively X4 viruses were found in only one sample. Genotypic tropism classified 71.7% of the sequences as R5 and 28.2% as virus able to use the CXCR4 correceptor. The agreement between phenotypic and genotypic tropism results was 74.5%. There was a prevalence of subtype B (82%), and the B\' (GWGR) variant was present in 34.5% of the cases. gp120 showed a mean of 22 N-linked glycosylation sites, which were more frequent in the C2 and C4 regions. The net charge showed similar means between R5 and X4 viruses for both V3 loop and gp120. The molecular characteristics described in this study showed similar distribution between R5 and X4 viruses and it was not possible to establish relationships between these factors the tropism determination.

Com o objetivo de estudar a interação do HAdV-41 com células permissivas, primeiramente foi observada a cinética de infecção do HAdV-41 em células HEK-293, durante 7 dias. A seguir, as culturas foram analisadas por MCVL e por MET. O HAdV-41 apresentou um ciclo replicativo lento com liberação da progênie viral por mecanismo não lítico. A seguir, com o intuíto de verificar a participação da proteina FC do HAdV-41 nas etapas de entrada nas células HEK-293 e CaCo2, obteve-se os dodecaedros recombinantes (DR) em células High five (base-Ad3, base-Ad3+FC-Ad41, base-Ad3+FL-Ad41, baseRGEHS-Ad3+FCAd41 e base-Ad3+FAd3). Esses dodecaedros foram inoculados em células HEK-293 e CaCo2. Após a análise por MCVL, observou-se que a proteína FC talvez não desempenhe função na entrada do DR nas células estudadas. A seguir, uma alíquota do DR base-Ad3+FC-Ad41 foi digerida com a enzima pepsina e analisada por WB. Notou-se que a FC sofreu proteólise. Acredita-se que essa proteólise seja necessária para o reconhecimento de receptores no trato gastro-intestinal. Esses resultados fornecerão subsídeos para o desenvolvimento de vetores de terapia gênica direcionada para o epitélio intestinal e vetores vacinais administrados por via oral. / Our objective was study the interaction between HAdV-41 and permissive cells. First, it was observed the kinetic of infection between HAdV-41 and HEK-293 cells, for 7 days. Second, the cultures were analyzed by CLSM and by TEM. The HAdV-41 showed a slower replicative cycle with release of viral progeny by non-lytic mechanisms. In order to verify the participation of SF protein of the HAdV-41 during the phases of entry in HEK-293 and CaCo2 cells, we producted recombinant dodecahedrons (DR) in high five cells (base-Ad3, base-Ad3+SF-Ad41, base-Ad3+SF-Ad41, baseRGEHS-Ad3+SFAd41 and base-Ad3+FAd3). These decahedrons were inoculated in HEK-293 and CaCo2 cells. After analysis with CLSM, observed that SF protein may not have a role in dodecahedron entry in the cells studied. Next, recombinant dodecahedrons base-Ad3+SF-Ad41 and base-Ad3 were digested with pepsin and analyzed by WB. We observed proteolysis of the SF. We believe that this proteolysis may be necessary for the recognition of receptors in intestinal cells. The results obtained will be the base for the development of gene-therapy vectors directed to intestinal epithelium, as well as orally administered vaccine vectors.

Com o objetivo de estudar a interação do HAdV-41 com células permissivas, primeiramente foi observada a cinética de infecção do HAdV-41 em células HEK-293, durante 7 dias. A seguir, as culturas foram analisadas por MCVL e por MET. O HAdV-41 apresentou um ciclo replicativo lento com liberação da progênie viral por mecanismo não lítico. A seguir, com o intuíto de verificar a participação da proteina FC do HAdV-41 nas etapas de entrada nas células HEK-293 e CaCo2, obteve-se os dodecaedros recombinantes (DR) em células High five (base-Ad3, base-Ad3+FC-Ad41, base-Ad3+FL-Ad41, baseRGEHS-Ad3+FCAd41 e base-Ad3+FAd3). Esses dodecaedros foram inoculados em células HEK-293 e CaCo2. Após a análise por MCVL, observou-se que a proteína FC talvez não desempenhe função na entrada do DR nas células estudadas. A seguir, uma alíquota do DR base-Ad3+FC-Ad41 foi digerida com a enzima pepsina e analisada por WB. Notou-se que a FC sofreu proteólise. Acredita-se que essa proteólise seja necessária para o reconhecimento de receptores no trato gastro-intestinal. Esses resultados fornecerão subsídeos para o desenvolvimento de vetores de terapia gênica direcionada para o epitélio intestinal e vetores vacinais administrados por via oral. / Our objective was study the interaction between HAdV-41 and permissive cells. First, it was observed the kinetic of infection between HAdV-41 and HEK-293 cells, for 7 days. Second, the cultures were analyzed by CLSM and by TEM. The HAdV-41 showed a slower replicative cycle with release of viral progeny by non-lytic mechanisms. In order to verify the participation of SF protein of the HAdV-41 during the phases of entry in HEK-293 and CaCo2 cells, we producted recombinant dodecahedrons (DR) in high five cells (base-Ad3, base-Ad3+SF-Ad41, base-Ad3+SF-Ad41, baseRGEHS-Ad3+SFAd41 and base-Ad3+FAd3). These decahedrons were inoculated in HEK-293 and CaCo2 cells. After analysis with CLSM, observed that SF protein may not have a role in dodecahedron entry in the cells studied. Next, recombinant dodecahedrons base-Ad3+SF-Ad41 and base-Ad3 were digested with pepsin and analyzed by WB. We observed proteolysis of the SF. We believe that this proteolysis may be necessary for the recognition of receptors in intestinal cells. The results obtained will be the base for the development of gene-therapy vectors directed to intestinal epithelium, as well as orally administered vaccine vectors.

O HPgV (Pegivirus Humano), conhecido anteriormente por GBV-C, causa infecção assintomática, persistente e com alta carga viral. Sendo o vírus de RNA sem patologia associada mais prevalente no mundo até os dias de hoje, os estudos in vitro ainda não foram capazes de mimetizar a replicação in vivo, permanecendo pouco esclarecidos vários aspectos de sua biologia. Estudos em macacos mostraram que os órgãos responsáveis pela maior replicação viral são o baço e a medula óssea, no entanto as células específicas permissíveis à infecção ainda não foram determinadas. Na década de 90, o HPgV ganhou notoriedade por diminuir os efeitos patológicos do HIV e aumentar a sobrevida de pacientes coinfectados HIV/HPgV, através da diminuição da ativação do sistema imune. Devido a essa característica, diversos estudos tentaram associar a presença de viremia a doenças hematológicas e um deles mostrou que a viremia de HPgV parece estar associada com o desenvolvimento de linfoma não- Hodgkin, porém muitas variáveis de confusão parecem influenciar esse resultado. Em conjunto, os dados mostram que o HPgV pode ter influência sobre a maturação e liberação de células progenitoras da medula óssea e, portanto, tornou-se primordial avaliar o impacto da viremia em pacientes com doenças hematológicas e definir o tropismo viral. Para tanto, o presente trabalho analisou a dinâmica de exposição à viremia de HPgV em pacientes submetidos ao transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT), em cadáveres autopsiados pelo Sistema de Verificação de Óbitos da Capital de São Paulo (SVOC-SP) e em pacientes submetidos à cirurgia de artroplastia pelo Instituto de Ortopedia e Traumatologia (IOT) do HCSP. A carga viral de HPgV foi mensurada por qRT-PCR em Tempo Real levando em consideração valores adquiridos com um curva padrão desenvolvida para este trabalho. Para os pacientes HSCT, o efeito da presença de viremia antes e após o procedimento foi avaliada quanto aos principais desfechos do transplante: doença enxerto-hospedeiro aguda (aGVHD), recaída da doença hematológica primária e mortalidade. Para amostras SVOC e IOT, células específicas dos tecidos (cérebro, fígado, baço, linfonodo, medula óssea e sangue) foram avaliadas quanto à quantidade de RNA viral de polaridade positiva e negativa, a fim de quantificar a replicação e definir o tropismo do vírus. Os resultados mostraram que a prevalência de HPgV encontrada nos pacientes HSCT foi maior do que em estudos similares: 42% para as amostra pré- HSCT e 31% para as amostras pós-HSCT; porém, para as amostras SVOC, a prevalência foi menor do que o esperado: 1,2%. A presença de alta carga viral de HPgV em pacientes HSCT foi associada com aumento da taxa de incidência de aGVHD (95% CI 1,05-5,37, p=0,038). Dada a alta prevalência de HPgV na população brasileira, é essencial confirmar esse achado em outras coortes, de modo a determinar se o monitoramento do HPgV pode beneficiar o cuidado a esses pacientes. Nas amostras SVOC e IOT, a medula óssea apresentou maior número de populações celulares com replicação viral, com destaque para as células B progenitoras e para as células dendríticas. Porém, devido às condições da coleta e do processamento das amostras, o tipo celular permissível à infecção não pôde ser identificado com clareza, portanto fazendo-se necessária a coleta de um número maior de amostras SVOC / HPgV (Human Pegivirus), previously known as GBV-C, causes asymptomatic, persistent and high viral load infection. To date, it is the most prevalent RNA virus without associated pathologies in the world, yet in vitro studies have not yet been able to mimic the in vivo replication, consequently many aspects of its biology remaining unclear. Studies in non-humam primatas have shown that the organs responsible for the greatest viral replication are spleen and bone marrow, however the specific cells permissible for infection have not yet been determined. In the 1990s, HPgV gained notoriety by decreasing the pathological effects of HIV and increasing the survival of coinfected HIV/HPgV patients, by decreasing the activation of the immune system. Because of this characteristic, several studies have attempted to associate the presence of viremia with haematological diseases, and one has shown that HPgV appears to be associated with the development of non-Hodgkin\'s lymphoma, but many confounding variables still seems to influence this outcome. Together, the data show that HPgV may influence the maturation and release of bone marrow progenitor cells and therefore it has become crucial to evaluate the impact of HPgV viremia in patients with haematological diseases and to define viral tropism. Therefore, the present study analyzed the dynamics of HPgV viremia exposure in patients submitted to hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), in cadavers autopsied by the São Paulo City Death Verification System (SVOC-SP) and in patients submitted to arthroplasty surgery by the Orthopedics and Traumatology Institute (IOT) of the Clinics Hospital of Sao Paulo. The HPgV was identified by real-time qRT-PCR and the viral load quantification was estimated by a standard curve developed for this work. For HSCT patients, the effect of viremia before and after the procedure was evaluated for the main transplant outcomes: acute graft vs host disease (aGVHD), relapse of primary haematological disease and mortality. For SVOC and IOT samples, tissue-specific cells (brain, liver, spleen, lymph node, bone marrow and blood) were evaluated for the amount of viral positive and negative RNA strains, in order to quantify replication and define virus tropism. The results showed that the prevalence of HPgV found in HSCT patients was higher than in similar studies: 42% for pre-HSCT samples and 31% for post-HSCT samples; however, for SVOC samples, the prevalence was lower than expected: 1.2%. The presence of high viral load of HPgV in HSCT patients was associated with an increase in the incidence rate of aGVHD (95% CI 1.05-5.37, p = 0.038). Given the high prevalence of HPgV in the Brazilian population, it is essential to confirm this finding in other cohorts, in order to determine if HPgV monitoring can improve the care of these patients. In the SVOC and IOT samples, the bone marrow presented a higher number of cell populations with viral replication, especially the progenitor B cells and the dendritic cells. However, due to the conditions of specimen collection and processing, the major permissible cell could not be clearly identified, thus making it necessary to collect a larger number of SVOC samples