Els transportadors de glucosa de difusió facilitada (GLUTs) són proteïnes essencials per permetre l'entrada de glucosa dins la cèl·lula. Concretament, el GLUT4 s'ha descrit com la isoforma més important per al manteniment de la glucèmia, ja que és el mediador de l'acció de la insulina per incrementar la taxa de captació de glucosa. Fins ara en peixos només s'han identificat quatre isoformes de GLUTs, i entre elles hi destaca el GLUT4, el qual va ser clonat per primera vegada en truita comuna ("Salmo trutta"). A l'inici d'aquesta tesi ja existien algunes evidències sobre la regulació de la insulina sobre l'expressió d'aquest transportador in vivo. No obstant, es desconeixia si l'acció de la insulina era un efecte directe sobre el teixit muscular o bé actuava a través d'altres mediadors. Per altra banda, tampoc es coneixia l'acció de la insulina sobre la proteïna GLUT4 de truita. Per tant, en aquesta tesi hem intentat resoldre aquestes qüestions per poder contribuir a un millor coneixement d'un dels elements importants que intervé en el metabolisme dels carbohidrats en els peixos teleostis.En aquest estudi es va demostrar que els nivells d'insulina circulants són capaços de modular el contingut de proteïna GLUT4 in vivo en el múscul esquelètic de truita i que aquesta regulació és específica del tipus de fibra muscular. També es va demostrar que els efectes de la insulina sobre l'expressió de GLUT4 en el múscul esquelètic de truita són deguts a l'acció directa d'aquesta sobre les cèl·lules musculars. L'expressió basal de GLUT4 augmenta al llarg de la diferenciació de les cèl·lules musculars de truita i, paral·lelament, també augmenta lleugerament l'expressió de GLUT1. La insulina i l'IGF-I estimulen l'expressió de GLUT4 i els seus efectes són més evidents en miotubs. La insulina, en general, promou l'acumulació d'ARN missatger de GLUT1 en les cèl·lules musculars de truita. Per altra banda, l'IGF-I augmenta l'expressió de GLUT1 en mioblasts.En aquesta tesi també es va estudiar la regulació del tràfic del GLUT4 de truita per la insulina en cèl·lules musculars L6. Amb aquest objectiu es va generar una línia estable de cèl·lules L6 que expressaven el GLUT4 de truita amb un epítop myc a la seva porció extracel·lular (btGLUT4myc). La insulina va estimular l'aparició del btGLUT4myc a la membrana plasmàtica, augmentant així la captació de glucosa en aquestes cèl·lules. No obstant, en estat basal un major percentatge de btGLUT4myc estava ja present a la superfície cel·lular comparat amb el GLUT4myc de rata. Els experiments d'internalització de GLUT4myc van demostrar que l'endocitosi del btGLUT4myc és més lenta que la del GLUT4myc de rata. Per tant, aquests resultats suggereixen que les diferències observades entre el tràfic del GLUT4 de truita i el GLUT4 de rata poden ser degudes a diferències en alguns motius aminoacídics dels quals en mamífers s'ha demostrat que participen en la internalització i la retenció intracel·lular del transportador en estat basal. També s'ha vist que la insulina estimula la translocació de btGLUT4 en les cèl·lules musculars de truita i com a conseqüència augmenta el transport de glucosa en aquestes cèl·lules. Per altra banda, els estudis d'immunofluorescència van demostrar que en estat basal el btGLUT4 es troba a l'interior de les cèl·lules de truita i concentrat a la regió perinuclear, tal i com s'ha descrit prèviament en mamífers.En conjunt podem concloure que els mecanismes de regulació de la insulina sobre el GLUT4 en el múscul esquelètic ja existeixen en els vertebrats inferiors, malgrat que presenten algunes diferències respecte als mamífers. Així, podem veure que al llarg de l'evolució s'ha perfeccionat la regulació de la captació de glucosa fins arribar a ser un mecanisme eficient que permet una recuperació ràpida de la glucèmia. / In the present work, we demostrated that insulin plasma levels may modulate GLUT4 protein content in vivo in trout skeletal muscle, but in a fiber-type dependent manner. Furthermore, insulin stimulates GLUT4 gene expression in trout skeletal muscle by acting directly on muscle cells. Basal GLUT4 expression increases throughout differentiation of muscle cells, as well as GLUT1 expression. Insulin and IGF-I increase GLUT4 mRNA levels, but their effects are more pronounced in fully differentiated myotubes. Insulin promotes mRNA accumulation in trout muscle cells. IGF-I increases GLUT1 expression in myoblasts.We also studied the regulation of trout GLUT4 traffic by insulin in L6 muscle cells. To address this issue we generated a stable cell line of L6 cells that express the myc-tagged trout GLUT4 (btGLUT4myc). Insulin stimulates btGLUT4myc translocation to the plasma membrane, resulting in an enhanced glucose uptake in these cells. However, in the basal state a higher percentage of btGLUT4myc is already present at the cell surface compared to rat-GLUT4myc. Internalization experiments of GLUT4myc demonstrated that btGLUT4myc endocytosis is slower than that of rat-GLUT4myc. Therefore, these data suggest that these differences between mammalian and fish GLUT4 in terms of traffic could be related to differences in the sequence of certain protein motifs shown to be important for internalization and intracellular retention of GLUT4. Moreover, insulin also stimulates the translocation of endogenous GLUT4 in trout muscle cells leading to an increased glucose transport activity in these cells. On the other hand, immunofluorescence experiments revealed that under basal conditions btGLUT4 is located in the cytoplasm of trout muscle cells and concentrated in the perinuclear region.Overall, we may conclude that the mechanisms of insulin regulation on GLUT4 in skeletal muscle already exist in lower vertebrates, although they present some differences compared to mammals. Thus, glucose transport regulation has been improved through evolution to become an efficient mechanism that allows a rapid recovery of glycaemia.

L'article 2 de la tesi enviat a la revista Conservation Biology, finalment va ser publicat a la revistat Conservation Genetics 3:385:400, 2002 / L'estudi de la diversitat i la diferenciació genètiques de les poblacions de truita comuna (Salmo trutta L.) a la Península Ibèrica ha confirmat l'elevada diferenciació observada en treballs previs i la divergència, ja descrita, entre les poblacions de la vessant atlàntica i la mediterrània. El resultats obtinguts, però, ens permeten observar patrons d'estructura poblacional tant en les poblacions atlàntiques com les mediterrànies. A l'Atlàntic s'observa un marcat patró hidrogràfic en la distribució de la diferenciació genètica, que contrasta fortament amb la distribució d'aquesta diferenciació en les poblacions mediterrànies, caracteritzades pels contactes secundaris entre llinatges durant les expansions pleniglacials i una forta divergència local conseqüència de la seva marginalitat i aïllament en els períodes interglacials. El manteniment d'aquesta diferenciació i individualitat descrites en les poblacions de truita de la Península, es veu seriosament compromès per les contínues repoblacions dels rius amb exemplars exògens d'origen nord europeu. La substitució dels genomes autòctons per la introducció de gens al.lòctons provoca una erosió dels patrimonis genètics natius i una homogeneïtzació de les poblacions, destruint els patrons de diferenciació existents. Al mateix temps, els nostres resultats indiquen que les conseqüències de les repoblacions no són sempre les mateixes. Concretament, es constata un fracàs de les repoblacions en rius intensament repoblats i sotmesos a pesca intensiva, que contrasta amb una enorme erosió de les poblacions quan les repoblacions s'efectuen sobre àrees protegides i sense cap mena de pressió pesquera. Això suggereix que múltiples factors com la gestió dels rius posterior a les repoblacions, l'estat de les poblacions o les condicions de l'hàbitat són determinants de la introducció efectiva dels exemplars alliberats; fet que dificulta la predicció sobre actuacions particulars. Malgrat aquesta introgressió de gens exògens que es detecta en moltes de les poblacions analitzades, els gens natius predominen en gairebé tots els rius de la Península. La conservació d'aquesta elevada riquesa genètica que encara resta en les poblacions de truita de la Península Ibèrica ha de ser l'objectiu final de qualsevol programa de gestió. Per això, defensem una gestió basada en el propi riu mitjançant una pesca sostinguda per la reproducció natural de les poblacions salvatges, acompanyada d'una millora i recuperació d'hàbitats adequats per la truita, i evitant, per sobre de tot, la introducció en els rius d'exemplars exògens, degut als efectes nocius i incontrolables que comporta aquest procés. / Our study on the genetic diversity and differentiation of brown trout (Salmo trutta L.) population of the Iberian Peninsula confirmed the high levels of differentiation and the divergence between Atlantic and Mediterranean populations previously described. However, additional substructuring among Atlantic rivers and among Mediterranean ones has been detected. In the Atlantic, genetic diversity is related with the river network, producing a marked hydrographical pattern in sharp contrast with a mosaic distribution of genetic variation among the Mediterranean collections. In this later area, genetic resources distributed as a result of distinct colonization episodes during pleniglacial expansions, secondary contacts, and local divergence due to its marginality and isolation in the interglacial periods. Continuous stocking with hatchery-reared fish of north European origin, seriously compromises the conservation of this differentiation and individuality described in brown trout populations of the Iberian Peninsula. Replacement of the autochthonous genome due to introduction of exogenous genes is leading to an erosion of the native gene pools, a homogenisation of populations, and a destruction of the ancestral patterns of differentiation. At the same time, our results indicated that successful stocking appears to be limited to wild populations subjected to occasional releases in protected or unfished areas. Extensive stocking in fished areas result in a more limited impact on the recipient native population. These results suggest that stocking success is unpredictable and controlled by different factors including habitat and population conditions at the time of stocking, as well as post-release management actuations. Although many of the analysed populations are introgressed with exogenous genes, native gene pools predominate in almost all the Iberian rivers. Conservation of this high genetic richness that still remains in brown trout Iberian populations must be the final goal of any management program. So, our management proposal is based on fisheries sustained by natural reproduction of the respective wild populations, coupled with an improvement and recovery of habitat suitable for brown trout; avoiding stocking with exogenous fish due to the harmful and incontrollable risks that this process involves for the genetic resources of the species.

Les anàlisis realitzades en cent deu poblacions de truita comuna (Salmo trutta) que abarquen el seu rang natural de distribució indiquen que el patró filogenètic es relaciona amb les tres grans vessants on es troba distribuïda l'espècie: ponto-càspia, atlàntica i mediterrània. Aquesta diferenciació estaria associada a l'aïllament de les vessants durant el Quaternari. L'origen de l'espècie es relaciona amb la vessant ponto-càspia, d'acord amb els models biogeogràfics que postulen l'origen asiàtic de la ictiofauna europea. S'ha detectat també un segon nivell de divergència dins de cada vessant que dóna com a resultat l'existència de sis llinatges evolutius: Atlàntic i Duero a la vessant atlàntica, els llinatges Adriàtic, Mediterrani i Marmoratus als rius mediterranis, i el llinatge Danubi a la zona ponto-càspia.Les glaciacions del Pleistocè han modificat profundament el rang de distribució de la truita comuna, especialment a la vessant atlàntica, on s'han proposat quatre grans refugis glacials: a l'est de la capa de gel, a Europa central, a l'entorn del canal de la Mànega i a l'entorn del golf de Biscaia; tot i que només els tres primers haurien participat en la recolonització del nord d'Europa al final de l'última glaciació. El quart refugi, que inclou el sud de França i el Cantàbric hauria estat l'origen de l'expansió cap al sud durant el Pleistocè Superior d'un grup de poblacions distribuïdes actualment a la vessant atlàntica ibèrica, i també hauria servit de base per a l'expansió cap al nord d'altres grups de truita durant interglacials anteriors.A la vessant atlàntica de la peninsula Ibèrica, l'estructura poblacional es troba associada a la xarxa hidrogràfica i es determinen fins a cinc unitats poblacionals: les truites dels rius Cantàbrics, les del Miño, les del Duero, les del Tajo i les del Guadalquivir. Les poblacions del Guadalquivir pertanyerien a un grup d'influència mediterrània. Els marcadors d'al·lozims i de DNA mitocondrial es troben fortament correlacionats en aquesta vessant, on apunten cap als mateixos grups de poblacions. Per contra, els rius de la vessant mediterrània haurien estat colonitzats pels llinatges Adriàtic i Mediterrani i s'hauria produït una intensa intergradació secundària entre aquests llinatges durant els períodes glacials a partir de l'expansió de les poblacions retingudes a les capçaleres durant els interglacials. Els grups de hibridació, l'aïllament i la deriva en el període interglacial fa que els grups de poblacions identificats pels marcadors d'al·lozims i de DNA mitocondrial no coincideixin. / The analyses performed in one hundred and ten brown trout (Salmo trutta) populations that cover its native European distribution, shows that the phylogenetic pattern is associated with the three major basins occupied by the species: Ponto-Caspian, Atlantic and Mediterranean. This differentiation is related with basin isolations during the Quaternary. The origin of the species is placed in the Ponto-Caspian region, in clear agreement with biogeographic models that postulates the Asian origin of European ichthyofauna. Further divergence occurred in the mid-lower Pleistocene generated the actual lineages: Atlantic and Duero in the Atlantic basin, Adriatic, Mediterranean and Marmoratus lineages in the Mediterranean rivers and the Danubian lineage in the Ponto-Caspian area.Pleistocene glacial periods have deeply modified the distribution range of brown trout, mainly in the Atlantic basin, where four major glacial refugia have been proposed: (i), at the East side of the ice sheet, (ii), in Central Europe, (iii), around the English Channel and (iv), around the Bay of Biscay. Only the three first seem to be involved in the recolonization of North Europe at the end of the last glacial period. The fourth glacial refugia, placed in Southern France and the Cantrabrian Sea area, would have been the origin of a southern expansion during Late Pleistocene. Nowadays, those trout populations are distributed in the Atlantic basin of the Iberian Peninsula. This glacial refugia could also be involved in older recolonizations of North-Europe previous to last glacial process.Brown trout population structure in areas at the Atlantic basin of the Iberian Peninsula is associated with river network. Thus, five trout population groups could be determined: trout from the Cantabrian Rivers, from the Miño River, from the Duero River, from the Tajo River and trout populations from the Guadalquivir basin. These last populations show a strong Mediterranean influence. In this basin, comparisons involving allozyme and mitochondrial DNA data are strongly correlated and points towards the same population groups. The rivers in the Mediterranean basin have been colonized by Adriatic and Mediterranean lineages, and strong secondary intergradations are reported among them during glacial periods. Population groups identified by allozyme and mitochondrial DNA do not agree as a consequence of this intergradation, as well as isolation and genetic drift during interglacial periods.

Se ha analizado las causas de la distribución espacial de la variabilidad genética del ADN mitocondrial en poblaciones de trucha común de la cuenca del Duero y de los Pirineos Orientales. En total se han analizado de novo 49 localidades, 13 en la cuenca del río Duero y 36 en los principales ríos del Pirineo oriental. Además se analizaron las fluctuaciones temporales en 14 de las localidades del Pirineo Oriental. Estudios previos indican un marcado contraste de los patrones de diversidad entre ambos territorios.En la cuenca del río Duero los análisis confirmaron la presencia de los dos linajes matriarcales descritos previamente, el linaje Atlántico (AT) y el linaje Duero (DU). Los análisis de la varianza molecular (AMOVA) siguiendo una jerarquía hidrográfica sugirieron una alta estructuración de las poblaciones coincidente con los patrones ictiológicos observados en la cuenca. El linaje DU parece haber estado presente permanentemente en la cuenca interior del Duero, mientras que las zonas más próximas a la desembocadura han padecido diversas colonizaciones de trucha del linaje AT, que reflejarían los cambios climáticos ocurridos en el Cuaternario. Se ha detectado una discrepancia en el límite entre ambos grupos definidos por genes nucleares (alozimas) y el ADN mitocondrial. Estas discrepancias pueden ser debidas a un efecto más severo de la deriva genética en el ADN mitocondrial que en los marcadores nucleares. Sin embargo, en este trabajo se han observado evidencias a favor de selección en el ADN mitocondrial del linaje DU que también explicaría estas discrepancias.El análisis más exhaustivo en las cuencas de los Pirineos orientales, permitió detectar nuevos haplotipos mitocondriales de los linajes Adriático (AD) y Mediterráneo (ME). En esta región, los AMOVAs confirmaron que las diferencias entre poblaciones dentro de río son más importantes que las diferencias entre ríos. No obstante se observó un patrón de aislamiento por distancia en toda la zona, reflejo de la estructuración de las poblaciones en la cuenca del río Ebro. Además, aunque los AMOVAs mostraron que el componente temporal de la variación es inferior al espacial, las fluctuaciones temporales en la comparación matriarcal de las poblaciones resultaron estadísticamente significativas. Estas fluctuaciones están asociadas tanto a la deriva genética como a procesos de flujo génico entre poblaciones próximas. Dentro de las cuencas, los componentes de diferenciación entre afluentes son, en general, superiores a los obtenidos dentro de cada afluente, patrón que parece estar extendido en la trucha común. Los estudios a escala microgeográfica en la Noguera Vallferrera y Noguera Cardós (afluentes del Noguera Pallaresa) reprodujeron este patrón de diferenciación. Los tamaños efectivos y la tasa de migración entre ambos ríos fueron similares a los descritos en poblaciones noratlánticas. Los tamaños efectivos de las hembras (Nef), calculados a partir del ADN mitocondrial fueron menos de la mitad del tamaño efectivo total tanto en la Noguera Vallferrera como en el resto de localidades pirenaicas estudiadas. Estos bajos tamaños efectivos de las hembras serían también responsables de las fluctuaciones temporales observadas. Los ejemplares repoblados parecen hibridar poco con los nativos, pero su presencia podría intensificar indirectamente los procesos de deriva genética y complicar la conservación de los patrimonios genéticos nativos.Con la salvedad de la existencia de selección que favorece a los haplotipos del linaje DU, los procesos poblacionales que regulan la distribución de la variabilidad genética en la cuenca del Duero y en los Pirineos Orientales podrían ser parecidos y caracterizados por la existencia de múltiples demes interconectados a lo largo del curso fluvial. / Brown trout populations from the River Duero basin and from Eastern Pyrenees rivers were analyzed to assess the reasons for contrasting patterns of genetic diversity. Altogether genetic diversity has been analyzed in 49 new collections, 13 from the River Duero basin and 36 from the main rivers of Eastern Pyrenees. Moreover, temporal samples from 14 Pyrenean locations were sampled to analyse temporal stability of the described structure. In these two areas previous studies indicated a strong contrast among diversity patterns in both territories. Results in the Duero basin confirmed the presence of the Atlantic (AT) and the Duero (DU) matriarchal lineages both previously described in this river basin. The analyses of molecular variance (AMOVA) based on the hydrographical hierarchy indicated a high level of population structuring, in accordance with the icthiological pattern observed in this basin. The DU lineage permanently occupied the internal area of the River Duero basin, whereas zones close to the mouth of the river have suffered diverse waves of colonisations of trout belonging to the AT lineage, which would reflect the changes happened in the Quaternary. Discrepancies in the limits between both groups defined by nuclear genes (allozymes) and mitochondrial DNA have been detected. These discrepancies could be due to a more intense effect of genetic drift in mitochondrial DNA than in nuclear markers. Nevertheless, evidences in favour of selection in the mitochondrial DNA of the DU lineage have been described in this work, which also would explain this discrepancy. A detailed analysis of brown trout populations from rivers in the Eastern Pyrenees detected new mitochondrial haplotypes of the Adriatic (AD) and the Mediterranean (ME) lineages. In this region, the AMOVAs indicated that differences between populations within river were larger than differences between rivers. Nevertheless, a pattern of isolation by distance was observed in the whole zone, reflecting population structure within the River Ebro. The AMOVAs showed that the temporal component of the variation is lower than the spatial component, but the temporal fluctuations in the matriarchal comparison of the populations were statistically significant. These fluctuations were associated to both genetic drift and gene flow among close populations. Generally in the river basins, higher differentiation between than within stream was observed. This pattern seems to be widespread in brown trout. The studies on microgeographical scale undertaken in the Noguera Vallferrera and Noguera Cardós (tributaries of Noguera Pallaresa) reproduced the above pattern of differentiation. Effective population sizes and migration rate between both rivers were similar to those described in North-Atlantic populations. In the Noguera Vallferrera as well as in the rest of Pyrenean populations, the female effective sizes (Nef), calculated from mitochondrial DNA were less than a half of the total effective sizes detected. These low female effective sizes also contribute to the observed temporal fluctuations. Hatchery individuals hybridise poorly with the native one, but its presence could indirectly intensify genetic drift and complicate the conservation of the native genetic resources.In spite of selection favouring haplotypes of the DU lineage, population processes controlling the distribution of genetic variability in the Duero and the Eastern Pyrenees river basins could be similar and characterized by the existence of interconnected multiple demes throughout the fluvial course.

Durant anys, el principal mètode de gestió de les poblacions de truita comuna (Salmo trutta L.) ha estat la repoblació amb exemplars exògens. El seguiment genètic de les poblacions de truita comuna dels Pirineus orientals, realitzat en aquest tesi, indica que els al.lels procedents d'aquestes repoblacions estan conduint a una homogeneització de les poblacions naturals i a la pèrdua de la seva història evolutiva. D'aquí la importància de la detecció de la introgressió en el desenvolupament de noves estratègies de gestió i conservació de les poblacions d'aquesta espècie. En aquest treball, s'ha avaluat l'eficàcia de diferents marcadors i mètodes que ens ofereix la genètica de poblacions en la detecció de la introgressió present a les poblacions naturals. Alhora que s'ha analizat la influència que han tingut les reserves genètiques, aplicades amb posterioritat a les repoblacions, i que intenten equilibrar l'explotació i la conservació dels recursos genètics de les poblacions natives. / For many years, the primary strategy to maintain or increase brown trout (Salmo trutta L.) population size has been stocking with exogenous individuals. Results on genetic monitoring of brown trout populations in the eastern Pyrenees, carried out in this thesis, indicates that hatchery alleles are diluting native gene pools, leading to a genetic homogenization of native populations and the loss of evolutionary history of this specie. In this context, it is very important the continuous monitoting of the levels of introgression in wild populations to properly develop management and conservation strategies for populations of this specie. In this work, the efficiency of different genetic markers and methods for detecting introgression in natural populations has been evaluated. Moreover, we evaluated the influence of the new management approaches, genetic refuges, aimed to avoid introgression and preserve native genetic diversity remaining in wild populations.