Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas,Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-24T19:05:26Z No. of bitstreams: 1 2014_RicardoCamargo.pdf: 4754357 bytes, checksum: 6816b37d8d754523a1dc517382a3970b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-04T18:12:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_RicardoCamargo.pdf: 4754357 bytes, checksum: 6816b37d8d754523a1dc517382a3970b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-04T18:12:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_RicardoCamargo.pdf: 4754357 bytes, checksum: 6816b37d8d754523a1dc517382a3970b (MD5) / Ao longo da evolução o Trypanosoma cruzi (agente etiológico da doença de Chagas) desenvolveu estratégias bastante eficientes para evadir-se do sistema imune de seu hospedeiro mamífero. Como consequência, a infecção por este organismo tende a ser crônica, sugerindo que o T. cruzi escapa da vigilância do sistema imune por meio da regulação negativa das vias de processamento de antígenos. Na via de apresentação de antígenos intracelulares MHC de classe I, a grande maioria dos peptídeos antigênicos é gerada pelo proteassoma, um complexo proteico multicatalítico responsável pela degradação de proteínas. Entretanto, sob estimulação com interferon-γ (IFN-γ), as subunidades catalíticas β1, β2 e β5 do proteassoma constitutivo são substituídas pelas subunidades β1i/LMP2, β2i/MECL-1 e β5i/LMP7, formando o imunoproteassoma. O imunoproteassoma tem a sua atividade proteolítica modificada e especializada na geração de peptídeos apresentados pelas moléculas de MHC de classe I. Nesse cenário, nós avaliamos se a expressão e a atividade do proteassoma constitutivo, do imunoproteassoma e também de outros componentes da via de MHC classe I são alteradas pela infecção com T. cruzi em linhagem de célula não imune. Em análises por RT-PCR e géis bidimensionais, foi demonstrado que a expressão e a composição do proteassoma constitutivo não são afetadas pelo parasita. Em contraste, nós mostramos que a biossíntese das subunidades do imunoproteassoma β1i, β2i, β5i, de PA28β, de TAP1 e da molécula de MHC de classe I foi inibida em culturas de células infectadas e tratadas com IFN-γ. Nessas culturas, as atividades proteolíticas do proteassoma também foram drasticamente reduzidas. Em experimentos de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência, nós constatamos que a infecção com T. cruzi reduz a densidade de moléculas de MHC de classe I na superfície da célula hospedeira. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que o protozoário Trypanosoma cruzi é capaz de modular especificamente a sua infecção por meio de um mecanismo pós-transcricional que inibe a expressão dos componentes da via de MHC de classe I.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-10T18:21:06Z No. of bitstreams: 1 2016_PaulaBeatrizSantiago.pdf: 14571538 bytes, checksum: e6692f71f1b3e972f9f5a7e93a8a6ea1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-10T18:22:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_PaulaBeatrizSantiago.pdf: 14571538 bytes, checksum: e6692f71f1b3e972f9f5a7e93a8a6ea1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-10T18:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_PaulaBeatrizSantiago.pdf: 14571538 bytes, checksum: e6692f71f1b3e972f9f5a7e93a8a6ea1 (MD5) Previous issue date: 2017-10-10 / Programa de apoio a Núcleos de excelência (PRONEX); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF); Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP). / A doença de Chagas é causada pelo tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi, geralmente transmitido ao hospedeiro vertebrado através do contato com as fezes do inseto vetor infectado durante o repasto sanguíneo. A lesão vascular ocasionada pela picada do triatomíneo hematófago desencadeia no hospedeiro manifestações que poderiam interferir na alimentação, tais como resposta imune, inflamação e hemostasia. No entanto, os insetos hematófagos são capazes de neutralizar essas defesas através de um complexo repertório de moléculas salivares, fundamentais para a manutenção do fluxo sanguíneo e o sucesso do repasto. No intuito de conhecer a complexidade molecular da saliva dos triatomíneos Rhodnius neglectus e Triatoma dimidiata, esta tese descreve os transcritomas de suas glândulas salivares utilizando sequenciamento de próxima geração. Foram obtidos 5.704 transcritos a partir da biblioteca de cDNA das glândulas salivares de T. dimidiata e 5.705 da biblioteca de R. neglectus, dos quais 662 e 636, respectivamente, codificam proteínas secretadas. A análise revelou a expressão de famílias gênicas já descritas na saliva de outros hematófagos, como lipocalinas, grupo abundante, antígeno-5 e apirases. Além disso, inibidores de proteases do tipo Kazal e proteases também foram encontrados. Adicionalmente, o conteúdo salivar foi submetido à análise proteômica, sendo identificadas 111 e 73 proteínas nos proteomas de T. dimidiata e R. neglectus, respectivamente. Os resultados obtidos validaram alguns transcritos putativamente secretados. Este estudo evidenciou que a saliva dos triatomíneos investigados tem característica multifuncional diretamente relacionada a diferentes atividades anti-inflamatórias, anti-hemostáticas e imunomoduladoras. O estudo dos compostos salivares auxilia a compreensão acerca da biologia dos vetores e transmissão de doenças, da evolução dos hematófagos, além de estimular a busca por novos fármacos. / Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi trypanosomatid, usually transmitted to vertebrate host through contact with faeces of infected vector insects during a blood meal. The vascular injury caused by the bite triggers symptoms capable to preventing an association with the host, such as immune response, inflammation and haemostasis. However, hematophagous arthropods are able to neutralize these defenses through a complex repertoire of salivary proteins acting as vasodilators, antiplatelets and anticoagulants. These molecules are essential for the blood flow maintenance and the success of the blood meal. In order to understand the salivary molecular complexity of Rhodnius neglectus and Triatoma dimidiata, this work describes their salivary glands (SG) transcriptome using next-generation sequencing. It was possible to obtain 5,704 transcripts from T. dimidiata and 5,705 from R. neglectus SGs, of which 662 and 636 encoded putatively secreted proteins respectively. The analysis revealed the expression of gene families already described in the saliva of other hematophagous insects, such as lipocalin, abundant protein family, antigen-5 and apyrases. Besides, Kazal type protease inhibitors and proteases were also found. In addition, the salivary content was submitted to proteomic analysis, being possible to identify 111 and 73 proteins in T. dimidiata and R. neglectus proteomes respectively. The results validated some putatively secreted transcripts. This work showed that saliva of the triatomines investigated here possess multi-functional feature directly related to different anti-inflammatory, anti-hemostatic and immunomodulatory activities. Salivary research helps the understanding of vector biology and disease transmission, hematophagous evolution, in addition to stimulating the search for new drugs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-28T16:26:07Z No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / A doença de Chagas é considerada uma das principais endemias da América Latina, existindo cerca de oito milhões de pessoas infectadas com o Trypanosoma cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. A associação entre a transferência gênica lateral de minicírculos de kDNA do T. cruzi para o genoma hospedeiro e o surgimento de manifestações clínicas da doença de Chagas está descrita na literatura. Entretanto os mecanismos que levariam ao desenvolvimento das reações autoimunes ainda precisam ser elucidados. No presente estudo, desenvolveu-se um protocolo de PCR quantitativa (qPCR) que permitiu a quantificação das integrações de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro, confirmando, dessa forma, a transferência dos minicírculos ao genoma de célula hospedeira. Verificou-se que há um acúmulo das integrações ao longo do tempo em células J774.A1. À medida que ocorre a inserção dos minicírculos de kDNA no genoma hospedeiro, observa-se alteração da temperatura de dissociação das amostras, indicando mudança na composição ou no tamanho dos fragmentos integrados. De fato, a clonagem e o sequenciamento dos amplicons demonstrou o truncamento da região variável do kDNA. O Benznidazol é capaz de eliminar a infecção, porém não previne a integração e o acúmulo das sequências de kDNA. Já o AZT, droga inibidora de retrotransposição, mostra-se efetivo no controle dos eventos de integração. Os experimentos in vivo corroboraram os achados in vitro, demonstrando uma maior quantidade de integrações em animais que se encontravam na fase crônica da doença de Chagas. Outros estudos são necessários para determinar o papel do acúmulo de integrações de kDNA e a severidade das manifestações clínicas. Entretanto, o real significado de tais mutações não fica restrito à doença de Chagas, mas, sim, estende-se ao longo do processo da evolução, em que a aquisição de DNA exógeno ajudaria a impulsionar um fluxo genético introdutor de complexidade crescente às espécies. / Chagas' disease is considered a major endemic disease in Latin America, and there are approximately eight million people infected with Trypanosoma cruzi worldwide, especially in Latin America. The association between lateral gene transfer of T. cruzi kDNA minicircle into host genome and the onset of clinical manifestations of Chagas disease is described in the literature. However, the mechanisms that lead to autoimmune reactions are to need to be elucidated. In the present study, we have developed a protocol quantitative PCR (qPCR), which permitted quantitation of kDNA minicircle integrations T. cruzi into the host genome, confirming thus the transfer of the minicircle into the genome of the host J774.A1 cells. It was found that there is an accumulation of integrations over time J774.A1 cells. As kDNA insertions occur, there is change in melting curve, indicating change in composition or size of the integrated fragments. In fact, cloning and sequencing of amplicons showed loss of nucleotides in kDNA variable region. Benznidazole is able to eliminate the infection, but does not prevent the integration and accumulation of kDNA sequences. AZT, an inhibitory drug for retro transposition, shows to be effective in controlling integration events. In vivo experiments confirmed in vitro findings, showing a greater amount of integrations in animals that were in the chronic phase of Chagas disease. Further studies are needed to determine the role of kDNA accumulation in severity of clinical manifestations. However, the real significance of such date is not restricted to Chagas disease, but rather extends throughout the evolutionary process, where the acquisition of exogenous DNA would help boost a genetic flow introducing higher complexity to species.