Proteínas são heteropolímeros lineares essenciais à vida, responsáveis pela estruturação dos organismos e pela maioria dos processos bioquímicos que os mantêm vivos e permitem sua reprodução. Essa variedade de funções é refletida na diversidade estrutural encontrada no universo das proteínas, já que sua função é intrinsecamente ligada à sua rigorosa conformação espacial. A partir dos experimentos de Anfinsen (1973), ficou demonstrado que o enovelamento dessas moléculas (folding) se dá essencialmente por meio de um processo físico-químico guiado pela interação entre os aminoácidos da cadeia protéica e entre estes e o meio solvente, quando sob condições fisiológicas (temperatura, pressão, pH). O completo entendimento do mecanismo de folding tem também importância médica, pois várias doenças como mal de Alzheimer, diabetes tipo II, encefalite bovina espongiforme e várias formas de câncer estão relacionadas com falhas estruturais das proteínas. Neste trabalho, por meio de experimentação computacional por dinâmica molecular (DM) em diferentes condições térmicas, estudamos inicialmente o papel das pontes dissulfeto (S-S) e das ligações de hidrogênio (LH) na estabilidade da proteína. Em seguida, adotando exclusivamente o regime de alta temperatura (T = 448K) em combinação com simulações de longa duração (até ~100ns), no intuito de expandir a exploração do espaço configuracional, verificamos a premissa de que as forças entrópicas, geradas pelo efeito hidrofóbico, seriam dominantes no processo de busca pela estrutura nativa. Neste trabalho foi utilizada como um protótipo de proteína pequena e com pontes S-S, a toxina Ts Kappa (MM=3,8 Kda; pdb id: 1tsk), que é dotada de três pontes S-S. A estabilidade conformacional foi analisada por meio de uma série de simulações de DM em temperaturas crescentes e em duas situações: com e sem os cross-links S-S. Nossos resultados indicam que para incrementos nas temperaturas significativamente elevadas, como 50K acima da temperatura em que a estrutura nativa foi determinada por NMR (283K), a remoção das S-S não compromete a estabilidade conformacional da proteína. De fato, a ausência dos cross-links elimina certas restrições geométricas permitindo agora que diferentes combinações de LH sejam feitas, inclusive entre resíduos adjacentes à cisteína, os quais de certa forma substituem as pontes S-S em seus papeis conformacionais pois a estrutura nativa é essencialmente mantida. No segundo experimento o espaço configuracional foi varrido extensamente durante 100ns e à temperatura de 398K. No caso da Ts Kappa com suas pontes dissulfeto intactas, a desestruturação da proteína é limitada pelas fortes pontes covalentes S-S, mas com a remoção delas, a proteína se desnaturou completamente ao longo dos primeiros 50ns. Contudo, a partir deste ponto a cadeia desnaturada passou a seguir, de forma espontânea e sistemática, uma rota de re-estruturação em direção à nativa, com o reestabelecimento de todas suas estruturas secundárias. Ao redor de 100ns a cadeia atingiu um estado de grande identidade estrutural com sua correspondente estrutura nativa. Em conclusão, os presentes resultados corroboram as premissas de que o folding de proteínas ocorre por meio de um processo em duas etapas, temporalmente separadas: no início, as forças entrópicas são dominantes e são as que induzem a cadeia para a conformação nativa. Então, uma vez na vizinhança da estrutura nativa, as pontes de hidrogênio (agora protegidas da competição com o meio solvente), juntamente com um mais eficiente empacotamento estrutural das cadeias laterais devido às complementaridade estéricas das mesmas (e assim otimizando as interações de van der Waals), iniciam a etapa de estabilização energética da proteína. / Proteins are linear heteropolymers essential for life; they are responsible for many distinct functions as the structural components of organism, and for most of the biochemical processes to maintain a reproductive life. Such diversity of functions is correlated with the extremely large accessible conformational space, since function and spatial structure are interdependent. After Anfinsen experiments (1973), it becomes clear that the protein folding is essentially a physical-chemical process guided by interactions among the chain constituents (amino acid sequence) and interactions between the chain and the solvent, under physiological conditions (temperature, pressure, pH). Because miss-folded proteins are related with diseases (Alzheimer, type II diabetes, several forms of cancer, etc.) the full understanding of the folding mechanism has also significant medical interest. In this work, by means of molecular dynamics (MD) simulations under distinct thermal conditions, we first consider the role of disulfide cross-links (S-S) and hydrogen bonds (HB) with respect to the protein thermal stability. Then, using exclusively high temperature regime (T = 448K) combined with extended time simulations (up to ~100ns), in order to fully span of configurational space, we analyzed the hypothesis that the entropic forces, generated by the hydrophobic effect, are dominant in the search process for the native structure. The protein Ts Kappa was used a prototype for small proteins having S-S bridges (MM=3,8Kda; 3 S-S - pdb id: 1tsk). The thermal conformational stability was analyzed from a series of MD simulations under growing temperatures, using two distinct cases: with and without cross-links S-S. Our results suggest that for significant temperature increments, such as 50K above the temperature used in the Ts Kappa structure determination (by NMR at 283K), the thermal conformational stability of the proteins is not affected if the S-S bridges are removed. Indeed, cutting of the cross-links eliminates certain geometrical constraints, what permits the formation of new combinations of HB, which in some way take the place of the S-S bridges on its conformational role since the native structure is essentially maintained. In the second computational experiment, the configurational space was extensively swapped during 100ns at a fixed temperature T=398K. In the case with preserved S-S bridges, the structural unpacking is limited by the three covalent cross-links, but without the S-S bridges the protein denaturation was complete after 50ns. However, after this point the chain started spontaneous and systematically a configurational rote that finally, after about 100ns, reached a conformation very similar with the native (RMSD » 0.5nm), reestablishing all its secondary structure. Concluding, the present results corroborate the hypothesis that the protein folding is a process in two stages temporally separated: first, entropic forces are dominant and guide the chain into the native structure, and then, once in the native neighborhood, the HB (now protected from competition with the solvent), altogether with a more efficient structural specificity of the side chains (optimizing the van de Walls interactions), start the energetic stabilization of the protein.

Proteínas são heteropolímeros lineares essenciais à vida, responsáveis pela estruturação dos organismos e pela maioria dos processos bioquímicos que os mantêm vivos e permitem sua reprodução. Essa variedade de funções é refletida na diversidade estrutural encontrada no universo das proteínas, já que sua função é intrinsecamente ligada à sua rigorosa conformação espacial. A partir dos experimentos de Anfinsen (1973), ficou demonstrado que o enovelamento dessas moléculas (folding) se dá essencialmente por meio de um processo físico-químico guiado pela interação entre os aminoácidos da cadeia protéica e entre estes e o meio solvente, quando sob condições fisiológicas (temperatura, pressão, pH). O completo entendimento do mecanismo de folding tem também importância médica, pois várias doenças como mal de Alzheimer, diabetes tipo II, encefalite bovina espongiforme e várias formas de câncer estão relacionadas com falhas estruturais das proteínas. Neste trabalho, por meio de experimentação computacional por dinâmica molecular (DM) em diferentes condições térmicas, estudamos inicialmente o papel das pontes dissulfeto (S-S) e das ligações de hidrogênio (LH) na estabilidade da proteína. Em seguida, adotando exclusivamente o regime de alta temperatura (T = 448K) em combinação com simulações de longa duração (até ~100ns), no intuito de expandir a exploração do espaço configuracional, verificamos a premissa de que as forças entrópicas, geradas pelo efeito hidrofóbico, seriam dominantes no processo de busca pela estrutura nativa. Neste trabalho foi utilizada como um protótipo de proteína pequena e com pontes S-S, a toxina Ts Kappa (MM=3,8 Kda; pdb id: 1tsk), que é dotada de três pontes S-S. A estabilidade conformacional foi analisada por meio de uma série de simulações de DM em temperaturas crescentes e em duas situações: com e sem os cross-links S-S. Nossos resultados indicam que para incrementos nas temperaturas significativamente elevadas, como 50K acima da temperatura em que a estrutura nativa foi determinada por NMR (283K), a remoção das S-S não compromete a estabilidade conformacional da proteína. De fato, a ausência dos cross-links elimina certas restrições geométricas permitindo agora que diferentes combinações de LH sejam feitas, inclusive entre resíduos adjacentes à cisteína, os quais de certa forma substituem as pontes S-S em seus papeis conformacionais pois a estrutura nativa é essencialmente mantida. No segundo experimento o espaço configuracional foi varrido extensamente durante 100ns e à temperatura de 398K. No caso da Ts Kappa com suas pontes dissulfeto intactas, a desestruturação da proteína é limitada pelas fortes pontes covalentes S-S, mas com a remoção delas, a proteína se desnaturou completamente ao longo dos primeiros 50ns. Contudo, a partir deste ponto a cadeia desnaturada passou a seguir, de forma espontânea e sistemática, uma rota de re-estruturação em direção à nativa, com o reestabelecimento de todas suas estruturas secundárias. Ao redor de 100ns a cadeia atingiu um estado de grande identidade estrutural com sua correspondente estrutura nativa. Em conclusão, os presentes resultados corroboram as premissas de que o folding de proteínas ocorre por meio de um processo em duas etapas, temporalmente separadas: no início, as forças entrópicas são dominantes e são as que induzem a cadeia para a conformação nativa. Então, uma vez na vizinhança da estrutura nativa, as pontes de hidrogênio (agora protegidas da competição com o meio solvente), juntamente com um mais eficiente empacotamento estrutural das cadeias laterais devido às complementaridade estéricas das mesmas (e assim otimizando as interações de van der Waals), iniciam a etapa de estabilização energética da proteína. / Proteins are linear heteropolymers essential for life; they are responsible for many distinct functions as the structural components of organism, and for most of the biochemical processes to maintain a reproductive life. Such diversity of functions is correlated with the extremely large accessible conformational space, since function and spatial structure are interdependent. After Anfinsen experiments (1973), it becomes clear that the protein folding is essentially a physical-chemical process guided by interactions among the chain constituents (amino acid sequence) and interactions between the chain and the solvent, under physiological conditions (temperature, pressure, pH). Because miss-folded proteins are related with diseases (Alzheimer, type II diabetes, several forms of cancer, etc.) the full understanding of the folding mechanism has also significant medical interest. In this work, by means of molecular dynamics (MD) simulations under distinct thermal conditions, we first consider the role of disulfide cross-links (S-S) and hydrogen bonds (HB) with respect to the protein thermal stability. Then, using exclusively high temperature regime (T = 448K) combined with extended time simulations (up to ~100ns), in order to fully span of configurational space, we analyzed the hypothesis that the entropic forces, generated by the hydrophobic effect, are dominant in the search process for the native structure. The protein Ts Kappa was used a prototype for small proteins having S-S bridges (MM=3,8Kda; 3 S-S - pdb id: 1tsk). The thermal conformational stability was analyzed from a series of MD simulations under growing temperatures, using two distinct cases: with and without cross-links S-S. Our results suggest that for significant temperature increments, such as 50K above the temperature used in the Ts Kappa structure determination (by NMR at 283K), the thermal conformational stability of the proteins is not affected if the S-S bridges are removed. Indeed, cutting of the cross-links eliminates certain geometrical constraints, what permits the formation of new combinations of HB, which in some way take the place of the S-S bridges on its conformational role since the native structure is essentially maintained. In the second computational experiment, the configurational space was extensively swapped during 100ns at a fixed temperature T=398K. In the case with preserved S-S bridges, the structural unpacking is limited by the three covalent cross-links, but without the S-S bridges the protein denaturation was complete after 50ns. However, after this point the chain started spontaneous and systematically a configurational rote that finally, after about 100ns, reached a conformation very similar with the native (RMSD » 0.5nm), reestablishing all its secondary structure. Concluding, the present results corroborate the hypothesis that the protein folding is a process in two stages temporally separated: first, entropic forces are dominant and guide the chain into the native structure, and then, once in the native neighborhood, the HB (now protected from competition with the solvent), altogether with a more efficient structural specificity of the side chains (optimizing the van de Walls interactions), start the energetic stabilization of the protein.

Utilizando simulação de dinâmica molecular estudamos as propriedades termodin âmicas da água em um sistema com macromoléculas hidrofóbicas e hidrofílicas. Em um primeiro momento utilizamos um sistema com uma proteína imersa em água. Os dois modelos atomísticos utilizados foram o modelo SPC/E e o modelo TIP4P-2005 e a proteína utilizada foi a toxina oriunda do escorpião brasileiro, TS-Kappa. Observamos para o sistema bulk e para o sistema com a proteína hidratada um máximo valor de densidade. Porém, analisando a densidade próximo à superfície da proteína, o comportamento anômalo não está mais presente. Para baixas temperaturas densidade da água próximo à proteína é maior do que no bulk. Nossos resultados mostram que o número de ligações de hidrogênio entre as moléculas de água na camada de hidratação da proteína, é menor que o número de ligações de hidrogênio para o sistema puro. A água na primeira camada de hidratação conecta-se com a superfície da proteína, além de ligar-se com outras moléculas de água vizinhas. medida que a temperatura diminui as moléculas de água tornam-se mais estruturadas próximo à região hidrofílica, e a densidade da água nessa região é maior do que a densidade da água na região hidrofóbica. Os resultados para a difusão nos mostram que a água diminui sua mobilidade na superfície da proteína, indicando uma maior conexão com sua superfície. Com o objetivo de estudar o comportamento da água em um sistema com interações hidrofílicas e hidrofóbicas, usamos um modelo mínimo com duas placas paralelas imersas em um uido do tipo-água. Nossos resultados indicam que a densidade da água aumenta com a diminuição da temperatura e a água torna-se mais estruturada a medida que a temperatura diminui. / Using a molecular dynamics simulation we studied the thermodynamic properties of water in a system with a hydrophilic and hydrophobic macromolecule. At rst, we used a system with a protein immersed in water. The models used were the SPC/E and the TIP4P-2005 water model and the chosen protein was the Brazilian scorpion toxin TS-Kappa. For bulk system and the protein hydrated system, the maximum value of density is present. However, the density of water near to the protein surface, the anomalous behavior is no longer veri ed. At lower temperatures the density of water near to protein surface is higher than the bulk. Our results show that the number of hydrogen bonds between water molecules in the hydration shell is lower than the number of hydrogen bonds in bulk water. The water in the rst hydration shell connect with the hydrophilic protein surface besides the hydrogen bonds with other water molecules. As the temperature is decreased the water is more structured near the hydrophilic amino acid and the density in this region is higher than the density of water in the hydrophobic region. The di usion values of water shows that hydration water is more connected with the protein surface, so the di usion coe cient decreases in this region. In order to investigate the behavior of water in a hydrophobic and a hydrophilic system, we used a simple model of parallel plates immersed in a water-like uid. Our results suggests the density of water increases with the decrease of temperature and the water is more structured as the temperatures is decreased.

Utilizando simulação de dinâmica molecular estudamos as propriedades termodin âmicas da água em um sistema com macromoléculas hidrofóbicas e hidrofílicas. Em um primeiro momento utilizamos um sistema com uma proteína imersa em água. Os dois modelos atomísticos utilizados foram o modelo SPC/E e o modelo TIP4P-2005 e a proteína utilizada foi a toxina oriunda do escorpião brasileiro, TS-Kappa. Observamos para o sistema bulk e para o sistema com a proteína hidratada um máximo valor de densidade. Porém, analisando a densidade próximo à superfície da proteína, o comportamento anômalo não está mais presente. Para baixas temperaturas densidade da água próximo à proteína é maior do que no bulk. Nossos resultados mostram que o número de ligações de hidrogênio entre as moléculas de água na camada de hidratação da proteína, é menor que o número de ligações de hidrogênio para o sistema puro. A água na primeira camada de hidratação conecta-se com a superfície da proteína, além de ligar-se com outras moléculas de água vizinhas. medida que a temperatura diminui as moléculas de água tornam-se mais estruturadas próximo à região hidrofílica, e a densidade da água nessa região é maior do que a densidade da água na região hidrofóbica. Os resultados para a difusão nos mostram que a água diminui sua mobilidade na superfície da proteína, indicando uma maior conexão com sua superfície. Com o objetivo de estudar o comportamento da água em um sistema com interações hidrofílicas e hidrofóbicas, usamos um modelo mínimo com duas placas paralelas imersas em um uido do tipo-água. Nossos resultados indicam que a densidade da água aumenta com a diminuição da temperatura e a água torna-se mais estruturada a medida que a temperatura diminui. / Using a molecular dynamics simulation we studied the thermodynamic properties of water in a system with a hydrophilic and hydrophobic macromolecule. At rst, we used a system with a protein immersed in water. The models used were the SPC/E and the TIP4P-2005 water model and the chosen protein was the Brazilian scorpion toxin TS-Kappa. For bulk system and the protein hydrated system, the maximum value of density is present. However, the density of water near to the protein surface, the anomalous behavior is no longer veri ed. At lower temperatures the density of water near to protein surface is higher than the bulk. Our results show that the number of hydrogen bonds between water molecules in the hydration shell is lower than the number of hydrogen bonds in bulk water. The water in the rst hydration shell connect with the hydrophilic protein surface besides the hydrogen bonds with other water molecules. As the temperature is decreased the water is more structured near the hydrophilic amino acid and the density in this region is higher than the density of water in the hydrophobic region. The di usion values of water shows that hydration water is more connected with the protein surface, so the di usion coe cient decreases in this region. In order to investigate the behavior of water in a hydrophobic and a hydrophilic system, we used a simple model of parallel plates immersed in a water-like uid. Our results suggests the density of water increases with the decrease of temperature and the water is more structured as the temperatures is decreased.

Utilizando simulação de dinâmica molecular estudamos as propriedades termodin âmicas da água em um sistema com macromoléculas hidrofóbicas e hidrofílicas. Em um primeiro momento utilizamos um sistema com uma proteína imersa em água. Os dois modelos atomísticos utilizados foram o modelo SPC/E e o modelo TIP4P-2005 e a proteína utilizada foi a toxina oriunda do escorpião brasileiro, TS-Kappa. Observamos para o sistema bulk e para o sistema com a proteína hidratada um máximo valor de densidade. Porém, analisando a densidade próximo à superfície da proteína, o comportamento anômalo não está mais presente. Para baixas temperaturas densidade da água próximo à proteína é maior do que no bulk. Nossos resultados mostram que o número de ligações de hidrogênio entre as moléculas de água na camada de hidratação da proteína, é menor que o número de ligações de hidrogênio para o sistema puro. A água na primeira camada de hidratação conecta-se com a superfície da proteína, além de ligar-se com outras moléculas de água vizinhas. medida que a temperatura diminui as moléculas de água tornam-se mais estruturadas próximo à região hidrofílica, e a densidade da água nessa região é maior do que a densidade da água na região hidrofóbica. Os resultados para a difusão nos mostram que a água diminui sua mobilidade na superfície da proteína, indicando uma maior conexão com sua superfície. Com o objetivo de estudar o comportamento da água em um sistema com interações hidrofílicas e hidrofóbicas, usamos um modelo mínimo com duas placas paralelas imersas em um uido do tipo-água. Nossos resultados indicam que a densidade da água aumenta com a diminuição da temperatura e a água torna-se mais estruturada a medida que a temperatura diminui. / Using a molecular dynamics simulation we studied the thermodynamic properties of water in a system with a hydrophilic and hydrophobic macromolecule. At rst, we used a system with a protein immersed in water. The models used were the SPC/E and the TIP4P-2005 water model and the chosen protein was the Brazilian scorpion toxin TS-Kappa. For bulk system and the protein hydrated system, the maximum value of density is present. However, the density of water near to the protein surface, the anomalous behavior is no longer veri ed. At lower temperatures the density of water near to protein surface is higher than the bulk. Our results show that the number of hydrogen bonds between water molecules in the hydration shell is lower than the number of hydrogen bonds in bulk water. The water in the rst hydration shell connect with the hydrophilic protein surface besides the hydrogen bonds with other water molecules. As the temperature is decreased the water is more structured near the hydrophilic amino acid and the density in this region is higher than the density of water in the hydrophobic region. The di usion values of water shows that hydration water is more connected with the protein surface, so the di usion coe cient decreases in this region. In order to investigate the behavior of water in a hydrophobic and a hydrophilic system, we used a simple model of parallel plates immersed in a water-like uid. Our results suggests the density of water increases with the decrease of temperature and the water is more structured as the temperatures is decreased.