Potato production in tropical and subtropical countries suffers from damage caused by the potato tuber moth (PTM), Phthorimiaea operculella. Development of a germline transformation system and the identification of genes that are differentially expressed within the PTM midgut are the main goals of this research. We tested three components that are critical to genetic transformation systems for insects; promoter activity, marker gene expression, and transposable element function. We compared the transcriptional activities of five different promoters, hsp70, hsp82, actin5C, polyubiquitin and ie1, within PTM embryos. The ie1 promoter flanked with the enhancer element, hr5, showed a very high level of transcriptional activity compared with the other promoters. The expression of the enhanced green fluorescent protein (EGFP) was detected under UV-illumination within the embryonic soma demonstrating that it can be used as an effective marker gene for PTM. The transpositional activities of the Hermes, mariner and piggyBac transposable elements were tested in interplasmid transposition assays. The piggyBac element was shown mobile within the embryonic soma with a transposition frequency of 4.2 X 10-5 transposition/donor plasmid. The piggyBac mobility has been enhanced by incorporating a transactivator plasmid expressing the IE1 protein from the bacoluvirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Seven transformation experiments were performed. The experiments failed to produce a transgenic PTM. The insect midgut is a rich region of molecular targets involved in food processing that could be potentially used to design a new control strategy. The suppression subtractive hybridization (SSH) method was used to identify differentially expressed genes from the PTM midgut. From this subtracted library, 2984 clones were collected and screened. Of these clones, 637 clones are candidate differentially expressed genes within the PTM midgut. Sixty-nine cDNA clones were randomly selected for DNA sequencing. Tweleve clones were selected for further analysis using RT-PCR and Northern blot techniques. Eleven of the clones resulted in positive results for midgut expression. Five clones, showing homology with insect immune peptides, were used in the challenge experiment which revealed that these cDNAs are constitutively expressed in the midgut, as well as being up-regulated due to bacterial or viral challenge.

Please read the abstract in the section 00front of this document. Also note that an abstract is provided for each chapter as well / Thesis (DPhil (Entomology))--University of Pretoria, 2005. / Zoology and Entomology / unrestricted

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) apresentar revisão bibliográfica abordando as principais referências presentes na literatura sobre a cultura da batata, Solanum tuberosum L. (Solanaceae), os aspectos bioecológicos da traça-da- -batatinha, Phthorimaea operculella (Zeller) (Lepidoptera: Gelechiidae), os hormônios no desenvolvimento dos lepidópteros e a atuação de alguns reguladores de crescimento de insetos (RCIs); (ii) avaliar a ingestão dos carboidratos por adultos de P. operculella e sua influência na reprodução da espécie; (iii) testar parâmetros reprodutivos devido à ingestão de alguns ingredientes ativos presentes em RCIs; (iv) avaliar a ingestão de carboidratos aplicados sobre plantas de batata de maneira a ser possível a aplicação de RCIs como método de redução populacional da praga. Inicialmente, para comprovação da ingestão dos carboidratos, foi utilizada a técnica de marcadores coloridos, em que se ofereceu, por capilaridade via rolete dental, solução de mel a 10% contendo corante líquido artificial de coloração azul anis. Os insetos foram confinados em um recipiente cilíndrico construído com tubo de PVC rígido. Após três dias de oferecimento da alimentação, analisou-se a presença do corante no sistema digestivo dos insetos. Para verificação da ingestão de carboidrato em condições mais próximas ao ambiente das culturas agrícolas, foi realizada nova avaliação em recipientes com diferentes dimensões: 0,0018; 0,054 e 9,6 m3. Posteriormente, simulando um borrifamento na cultura, foi realizada uma terceira avaliação no ambiente de 9,6 m3, na qual a solução de mel foi oferecida aos insetos em gotas grandes no limbo foliar de plantas de batata. Para análise da influência dos carboidratos na reprodução da espécie, foram verificados os seguintes parâmetros reprodutivos: ritmo de postura, fecundidade, viabilidade dos ovos e índice de ovigenia. Para análise dos efeitos dos RCIs, foram utilizados quatro compostos com diferentes ingredientes ativos: azadiractina, lufenurom, metoxifenozida e piriproxifem. Estes compostos foram oferecidos aos insetos em solução de mel a 10%, nas concentrações de 5, 10 e 20 ppm. Durante 10 dias após o acasalamento, foram analisados os parâmetros reprodutivos. O corante colorido mostrou-se adequado para os estudos visuais do sistema digestivo de P. operculella. A ingestão dos carboidratos pelos insetos ocorreu somente quando estes foram confinados em ambientes menores, 0,0018 e 0,054 m3. No ambiente maior, de 9,6 m3, a ingestão ocorreu somente quando a solução foi oferecida via gotas em plantas de batata. Quanto aos efeitos dos RCIs, verificou-se diminuição significativa na fecundidade das fêmeas de P. operculella que ingeriram solução de mel contendo azadiractina e lufenurom à concentração de 5 ppm e piriproxifem à concentração de 20 ppm. Quanto aos parâmetros viabilidade dos ovos e período embrionário não foram verificadas diferenças significativas entre os tratamentos. Este fato sugere que a fertilidade não foi alterada, demonstrando que os RCIs não afetam os machos. A comprovação da ingestão dos carboidratos oferecido via gotas no limbo foliar de plantas de batata e os resultados obtidos na redução da fecundidade de P. operculella indicaram que esta técnica pode ser utilizada em programas de manejo integrado da traça-da-batatinha. / The present work has been subdivided into four chapters, with the following objectives: (i) to present a bibliographic review of the main aspects related to the potato crop, Solanum tuberosum L. (Solanaceae), the bioecological aspects of potato tuber moth, Phthorimaea operculella (Zeller) (Lepidoptera: Gelechiidae), the hormones related to lepidopterans development and the role of some insect growth regulators (IGRs); (ii) to evaluate the carbohydrate intake by P. operculella adults and its influence on the species reproduction; (iii) to test the effects of active ingredients of IGRs on reproductive parameters; (iv) to evaluate the ingestion of carbohydrates applied on potato plants, in order to allow IGRs application as a population reduction strategy for this pest. Initially, confirmation of carbohydrate consumption was by a means colored marker technique, which offers a 10% honey solution containing an artificial liquid food dye, blue anise, by capillarity via a dental roll wick. The insects were caged in a cylindrical container made of a rigid PVC tube. After three days of food offering, dye presence was analyzed within the insects digestive system. For confirmation of carbohydrate intake under simulated field conditions, an additional evaluation was conducted in containers with different sizes: 0.0018, 0.054 and 9.6 m3. Later, a third evaluation was carried out in the 9.6 m3 container, in which the honey solution was offered to insects as big drops applied on the leaf blade of potato plants, simulating a spray application. To analyze carbohydrate influence on species reproduction, the following reproductive parameters were assessed: oviposition rate, fertility, egg viability and ovigeny index. Four compounds with different active principles were utilized to analyze IGR effects: azadirachtin, lufenuron, methoxyfenozide and pyriproxyfen. These compounds were offered to the insects in a 10% honey solution at concentrations of 5, 10 and 20 ppm. During 10 days after mating the reproductive parameters were evaluated. The colored dye method proved to be efficient for visual studies of P. operculellas digestive system. Carbohydrate ingestion by the insects occurred only when they were caged in small environments, 0.0018 and 0.054 m3. In larger ones 9.6 m3, feeding occurred when the solution was offered by dripping over potato plants. Results showed a significant reduction of P. operculella fertility among females that ingested the honey solution containing azadirachtin and lufenuron, at 5 and 20 ppm, respectively. Regarding egg viability and embrionary period, no significant differences were found between the treatments. This fact suggests that fertility was not affected, thus demonstrating that IGRs did not affect males. Confirmation of carbohydrate ingestion offered by dripping over potato leaf blades and the results of fertility reduction in P. operculella, indicated that this technique may be utilized in integrated management programs against the potato tuber moth.

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) apresentar revisão bibliográfica abordando as principais referências presentes na literatura sobre a cultura da batata, Solanum tuberosum L. (Solanaceae), os aspectos bioecológicos da traça-da- -batatinha, Phthorimaea operculella (Zeller) (Lepidoptera: Gelechiidae), os hormônios no desenvolvimento dos lepidópteros e a atuação de alguns reguladores de crescimento de insetos (RCIs); (ii) avaliar a ingestão dos carboidratos por adultos de P. operculella e sua influência na reprodução da espécie; (iii) testar parâmetros reprodutivos devido à ingestão de alguns ingredientes ativos presentes em RCIs; (iv) avaliar a ingestão de carboidratos aplicados sobre plantas de batata de maneira a ser possível a aplicação de RCIs como método de redução populacional da praga. Inicialmente, para comprovação da ingestão dos carboidratos, foi utilizada a técnica de marcadores coloridos, em que se ofereceu, por capilaridade via rolete dental, solução de mel a 10% contendo corante líquido artificial de coloração azul anis. Os insetos foram confinados em um recipiente cilíndrico construído com tubo de PVC rígido. Após três dias de oferecimento da alimentação, analisou-se a presença do corante no sistema digestivo dos insetos. Para verificação da ingestão de carboidrato em condições mais próximas ao ambiente das culturas agrícolas, foi realizada nova avaliação em recipientes com diferentes dimensões: 0,0018; 0,054 e 9,6 m3. Posteriormente, simulando um borrifamento na cultura, foi realizada uma terceira avaliação no ambiente de 9,6 m3, na qual a solução de mel foi oferecida aos insetos em gotas grandes no limbo foliar de plantas de batata. Para análise da influência dos carboidratos na reprodução da espécie, foram verificados os seguintes parâmetros reprodutivos: ritmo de postura, fecundidade, viabilidade dos ovos e índice de ovigenia. Para análise dos efeitos dos RCIs, foram utilizados quatro compostos com diferentes ingredientes ativos: azadiractina, lufenurom, metoxifenozida e piriproxifem. Estes compostos foram oferecidos aos insetos em solução de mel a 10%, nas concentrações de 5, 10 e 20 ppm. Durante 10 dias após o acasalamento, foram analisados os parâmetros reprodutivos. O corante colorido mostrou-se adequado para os estudos visuais do sistema digestivo de P. operculella. A ingestão dos carboidratos pelos insetos ocorreu somente quando estes foram confinados em ambientes menores, 0,0018 e 0,054 m3. No ambiente maior, de 9,6 m3, a ingestão ocorreu somente quando a solução foi oferecida via gotas em plantas de batata. Quanto aos efeitos dos RCIs, verificou-se diminuição significativa na fecundidade das fêmeas de P. operculella que ingeriram solução de mel contendo azadiractina e lufenurom à concentração de 5 ppm e piriproxifem à concentração de 20 ppm. Quanto aos parâmetros viabilidade dos ovos e período embrionário não foram verificadas diferenças significativas entre os tratamentos. Este fato sugere que a fertilidade não foi alterada, demonstrando que os RCIs não afetam os machos. A comprovação da ingestão dos carboidratos oferecido via gotas no limbo foliar de plantas de batata e os resultados obtidos na redução da fecundidade de P. operculella indicaram que esta técnica pode ser utilizada em programas de manejo integrado da traça-da-batatinha. / The present work has been subdivided into four chapters, with the following objectives: (i) to present a bibliographic review of the main aspects related to the potato crop, Solanum tuberosum L. (Solanaceae), the bioecological aspects of potato tuber moth, Phthorimaea operculella (Zeller) (Lepidoptera: Gelechiidae), the hormones related to lepidopterans development and the role of some insect growth regulators (IGRs); (ii) to evaluate the carbohydrate intake by P. operculella adults and its influence on the species reproduction; (iii) to test the effects of active ingredients of IGRs on reproductive parameters; (iv) to evaluate the ingestion of carbohydrates applied on potato plants, in order to allow IGRs application as a population reduction strategy for this pest. Initially, confirmation of carbohydrate consumption was by a means colored marker technique, which offers a 10% honey solution containing an artificial liquid food dye, blue anise, by capillarity via a dental roll wick. The insects were caged in a cylindrical container made of a rigid PVC tube. After three days of food offering, dye presence was analyzed within the insects digestive system. For confirmation of carbohydrate intake under simulated field conditions, an additional evaluation was conducted in containers with different sizes: 0.0018, 0.054 and 9.6 m3. Later, a third evaluation was carried out in the 9.6 m3 container, in which the honey solution was offered to insects as big drops applied on the leaf blade of potato plants, simulating a spray application. To analyze carbohydrate influence on species reproduction, the following reproductive parameters were assessed: oviposition rate, fertility, egg viability and ovigeny index. Four compounds with different active principles were utilized to analyze IGR effects: azadirachtin, lufenuron, methoxyfenozide and pyriproxyfen. These compounds were offered to the insects in a 10% honey solution at concentrations of 5, 10 and 20 ppm. During 10 days after mating the reproductive parameters were evaluated. The colored dye method proved to be efficient for visual studies of P. operculellas digestive system. Carbohydrate ingestion by the insects occurred only when they were caged in small environments, 0.0018 and 0.054 m3. In larger ones 9.6 m3, feeding occurred when the solution was offered by dripping over potato plants. Results showed a significant reduction of P. operculella fertility among females that ingested the honey solution containing azadirachtin and lufenuron, at 5 and 20 ppm, respectively. Regarding egg viability and embrionary period, no significant differences were found between the treatments. This fact suggests that fertility was not affected, thus demonstrating that IGRs did not affect males. Confirmation of carbohydrate ingestion offered by dripping over potato leaf blades and the results of fertility reduction in P. operculella, indicated that this technique may be utilized in integrated management programs against the potato tuber moth.