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Plusieurs études ont démontré que le virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) possède la propriété d’incorporer diverses protéines de la cellule-hôte. Certaines observations indiquent que ce processus d'incorporation est sélectif. Cependant, les mécanismes expliquant la sélectivité des protéines incorporées demeurent largement inconnus. Les travaux présentés ciblent l'identification du facteur responsable de l'incorporation sélective de la protéine cellulaire ICAM-1 par le VIH-1. Parallèlement, nous avons évalué la sensibilité des virus porteurs de l’ICAM-1 à l’action de l’inhibiteur de fusion, T-20. Un système de transfection et d'expression transitoire a été utilisé afin de produire des particules virales isogéniques avec ou sans l’ICAM-1, et de certains de ses variants. Ce système nous a permis de démontrer que le VIH-1 s’approprie la molécule d’adhésion ICAM-1 par un processus indépendant de l’enveloppe virale (Env), mais dépendant de la portion intracytoplasmique de l’ICAM-1. Cette incorporation serait dirigée par une interaction directe ou indirecte entre la molécule d’adhésion et le précurseur immature Gag du VIH-1. Par ailleurs, la présence de l’’ICAM 1 sur le VIH-1 augmente la résistance des virions à l’action du T-20 en accélérant la cinétique de fusion du virion. La présence de l’ICAM-1 à la surface des virions et son rôle dans le cycle réplicatif du VIH 1 sont très importants dans la pathogenèse du VIH-1. / INTRODUCTION Previous works have indicated that incorporation of surface glycoprotein into retroviruses such as the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is not a highly specific process since several cellular glycoproteins can be inserted within the mature viral particle. The mechanism(s) that govern the acquisition of such host constituents have remained so far elusive. OBJECTIVES We have examined the molecular basis, associate to ICAM-1 localization and structural viral proteins responsible for the selective incorporation of the adhesion molecule ICAM-1 within HIV-1. We also investigated whether sensitivity to the newly developed fusion inhibitor T-20 is affected by incorporation of the adhesion molecule ICAM-1 in HIV 1. METHODS We have first investigated the role played by the viral envelope (Env) of HIV-1 in the acquisition of host ICAM-1. The incorporation process of ICAM-1 was also investigated by using different ICAM-1 constructs in which both transmembranes and intracytoplasmic tails were modified. These investigations were performed in combination with virus capture and immunoprecipitation studies, Western blot, confocal microscopy analyses, and infectivity assays. We finally used laboratory isolates of HIV-1 (X4- and R5-tropic) either lacking or bearing ICAM-1 as well as clinical variants into infectivity tests to both evaluate their respective IC50 for the fusion inhibitor and to understand the mechanism of resistance bring by the presence of this host molecule. RESULTS Mutation in the matrix (MA) domain or on Env-deficient viruses produced either in immortalized or primary human cell lines does not affect the incorporation of ICAM-1 by HIV-1. However, the incorporation seems to be conducted by the cytosolic tail of ICAM-1. Further experiments suggested that there is an association – direct or indirect – between ICAM-1 and virus-encoded Pr55Gag. We also demonstrate that ICAM-1-bearing virions are more resistant to T-20 than isogenic HIV-1 particles lacking this host adhesion molecule probably based on a reduction of the kinetic window during which the viral envelope is sensitive to T-20. CONCLUSION This study represents the first demonstration that structural Gag polyproteins mediate the uptake of a host-derived cell surface constituent (ICAM-1) by interacting directly with its cytoplasmic domain or by interacting with a partner into the cytosol. This observation describes a new strategy by which HIV-1 can modulate its replicative cycle considering that insertion of ICAM-1 within nascent virions has been shown to affect virus life cycle and also the sensitivity to the newly develop class of inhibitor including T-20.

Chez les individus infectés par le VIH-1, nous retrouvons des particules virales dans le système nerveux central dès la phase aiguë de l'infection. De ce fait, plusieurs complications neurologiques peuvent émerger chez ces individus tels que des troubles neurocognitifs modérés, certaines déficiences neurocognitives asymptomatiques et même de la démence. De nombreuses recherches démontrent que la neuropathogénèse du VIH-1 est surtout reliée à la neuroinflammation plutôt qu'à la charge virale dans le système nerveux central. Plusieurs molécules proinflammatoires sont produites par les cellules neurologiques lorsqu'il y a infection par le VIH-1. Parmi celles-ci, nous retrouvons les eicosanoides tels que les leucotriènes (LTs) qui sont souvent présents dans le liquide cérébrospinal d'individus infectés. À ce jour, le rôle que peut jouer ces médiateurs lipidiques inflammatoires dans la pathogénèse du VIH-1 est méconnu. Nous nous sommes donc intéressés à mieux comprendre comment les LTs peuvent affecter l'infection du système nerveux central par le VIH-1. Dans une première étude, nous avons tenté de caractériser les interactions entre les LTs, les cellules microgliales et le VIH-1. Nous montrons que les LTs inhibent non seulement l'entrée virale, mais aussi les étapes précoces de l'infection qui suivent la fusion membranaire du VIH-1 dans les microglies. En effet, lorsque ces cellules sont traitées aux LTs, on observe une diminution significative du niveau d'ADN proviral dans les cellules microgliales résultant d'un blocage d'étapes de la replication virale après l'importation nucléaire de façon protéine kinase C (PKC)-dépendante. Dans le cadre d'un deuxième projet, nous avons étudié l'effet des LTs sur les astrocytes. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence la capacité des astrocytes stimulés par le leucotriène C₄(LTC₄) à induire la transmigration de lymphocytes T CD4+ infectées par le VIH-1 au travers d'un modèlew vitro de barrière hémato-encéphalique. De plus, nos résultats démontrent l'implication de la CX3CL1 à cet effet. Ainsi, cette étude décrit comment les LTs produits dans le système nerveux central peuvent contribuer à la neuroinvasion et l'infection du VIH-1 dans ce compartiment. Globalement, nos travaux permettent une mise en perspective du rôle des LTs dans la neuropathogénèse du VIH-1 et ouvre la voie vers de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Depuis sa découverte, le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) a causé la mort de 33 millions de personnes, et 36,7 millions sont actuellement infectées. Malgré l’existence des thérapies antirétrovirales, celles-ci ne conduisent pas à d’éradiquer le virus. En outre, il n’existe pas de vaccin. Les lymphocytes B, dont la fonction est de produire les anticorps sont dysfonctionnels au cours du VIH-1. Or la majorité des stratégies vaccinales se basent sur la production d’anticorps dépendante des cellules T CD4. Ainsi, la première partie de mon doctorat a été consacré à la compréhension de l’impact du VIH-1 sur les cellules T CD4 folliculaires auxiliaires (Tfh) essentielles à l’activation des lymphocytes B et à la production d’anticorps spécifiques, dans la rate l’organe majeur de la réponse des lymphocytes B. Dans la deuxième partie, j’ai analysé les cellules T CD4 mémoires, Tfh et les lymphocytes B dans les ganglions mésentériques: un site inducteur de la réponse immunitaire intestinale, qui alimente la lamina propria (site effecteur) de la muqueuse intestinale en cellules mémoires. Étant donné l’impossibilité d’étudier ces organes profonds en particulier en phase aiguë chez l’homme, j’ai utilisé le modèle du macaque rhésus infecté par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS). Les résultats de ces études montrent que l’évolution vers le SIDA est associée à une déplétion précoce des cellules Tfh et T CD4 mémoires dans la rate et les ganglions mésentériques. Concomitant à cela, je rapporte une déplétion des lymphocytes B mémoires dans la rate et un faible titre d’IgG anti-VIS dans le sérum. En plus, les cellules Tfh commutent leur phénotype d'effecteur mémoire vers celui de centrale mémoire associé à l’expriment de CD127 (récepteur de l’IL-7) et de T-bet (marqueur de cellules Th1). De plus, je montre que la déstructuration des organes lymphoïdes secondaires, ainsi que les cytokines environnementales comme l’IL-7 ou l’IL-27 peuvent contribuer au dysfonctionnement des cellules Tfh puisque ces dernières induisant les facteurs de transcription inhibiteurs des cellules Tfh tels que T-bet, Foxo1, Stat5 et KLF2. En conclusion, mes résultats permettent de mieux comprendre que le dysfonctionnement des lymphocytes B et l’immunodéficience dans la muqueuse intestinale sont associés à la déplétion soudaine des lymphocytes T CD4 mémoires et Tfh dans la rate et les ganglions mésentériques. Par conséquent, prévenir la perte de ces cellules pourrait être une approche thérapeutique et vaccinale prometteuse pour la neutralisation du virus et pour une meilleure immunité intestinale, afin d’empêcher la translocation bactérienne. / Since its discovery, HIV-1 has caused the death of 35 million people, and 36.9 million are living infected. Although researches have led to the development of antiretroviral therapies, which not only improve life expectation but also life quality of infected individuals, these therapies are not capable of eradicating the virus, and unfortunately there is no vaccine. The pathogenesis of HIV-1 is linked to a dysfunction of CD4 T cells that favors progression to AIDS. Therefore, given that most vaccines are based on T cell-dependent antibody production, the first part of my PhD research is devoted to understanding the impact of HIV-1 on CD4 T Follicular helper (Tfh) cells, which are essential for B cell activation and the production of specific antibodies. These cells are particularly crucial in the spleen, which is the major organ for B cell response. In the second part, I have analyzed the dynamics of memory CD4 T, Tfh and of B cells in mesenteric lymph nodes: an inductive site of the immune response that provides memory cells to the lamina propria (effector site) of the intestinal mucosa. Given the difficulties to study these deep organs, particularly during the acute phase in humans, I have used rhesus macaques infected with the simian immunodeficiency virus (SIV) to study the dynamics of Tfh cells. My results show an early depletion of splenic Tfh cells during the acute phase; a depletion that persists during the chronic phase within macaques in which the infection rapidly progresses to AIDS. Concomitantly, we report a depletion of memory B cells and low titers of anti-SIV IgG titers in these macaques. Furthermore, I observed a massive depletion of memory CD4 T, Tfh and B cells in mesenteric lymph nodes, as well as a phenotypic change of Tfh cells that become central memory cells associated with the upregulation of the expression of CD127 (IL-7 receptor). My results also show that environmental cytokines such as IL-7 and IL-27 contribute to their dysfunction as support the expression of transcription factors that inhibit Tfh cells such as T-bet, Foxo1 and Stat5. In conclusion, my results provide a better understanding of B cell dysfunction related to the early loss of the Tfh cells during HIV/SIV infection. Moreover, I hypothesize that the loss of immunity in the intestinal mucosa is due to the sudden depletion of memory CD4 T, Tfh and B cells in the mesenteric lymph nodes. Therefore, maintaining Tfh and memory CD4 T cells during the early phase of infection could be a promising therapeutic and vaccine approach for neutralizing HIV/SIV, as well as preventing bacterial translocation.

La molécule HLA-DR du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II) est fortement incorporée dans l'enveloppe virale du virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). L'expression à la membrane cytoplasmique de cette même molécule est modulée à la baisse par la protéine virale Nef. D'autre part, Nef augmente l'expression de la chaîne invariante CD74, une autre protéine du CMH-II associée avec HLA-DR dans un complexe protéique immature. D'autres protéines accessoires virales, telles Vpu, interagissent avec le CMH-II. Vpu diminue l'expression de HLA-DR et interagit avec la portion intracellulaire de CD74. Cette étude a pour but de vérifier si les complexes immatures de CMH-II sont incorporés dans l'enveloppe virale du VIH-1. Elle veut aussi vérifier l'impact de la présence de Nef et de Vpu sur l'incorporation du CMH-II. La modulation à la baisse de HLA-DR et l'augmentation d'expression de CD74 induite par Nef ont été confirmées à la surface de lymphocytes T CD4+. La molécule CD74 représentant un complexe de CMH-II immature ne semble pas être incorporée dans l'enveloppe virale, peu importe la présence ou l'absence de Nef et de Vpu lors de l'infection. La présence de Nef ne semble pas influencer l'incorporation de HLA-DR qui demeure toujours fortement incorporée. Vpu semble important pour l'incorporation du HLA-DR, puisqu'un virus sans Vpu incorpore nettement moins de HLA-DR. Un mutant déficient en phosphorylation sur deux serines de Vpu, pour sa part, semble permettre une incorporation partielle de cette même molécule. Ces résultats semblent indiquer que HLA-DR est incorporée selon son stade de maturation et que Vpu est essentielle à l'incorporation de HLA-DR.

Les cellules dendritiques (CDs) sont connues comme étant les cellules sentinelles du système immunitaire. En effet, par leur capacité à capturer et à présenter les antigènes du soi ou étrangers, elles ont la propriété de moduler la réponse immunitaire innée et acquise. Toutefois, elles sont aussi connues pour libérer des vésicules dans le milieu extra cellulaire, dont entre autres les exosomes. Les exosomes sont des microvésicules de 30 - 100 nm jouant un rôle important au sein de l'intercommunication cellulaire. L'état d'activation des CDs influence drastiquement la composition et le rôle des exosomes. D'après des résultats préliminaires obtenus au sein du laboratoire, nous avons observé que les CDs ainsi que les lymphocytes T CD4⁺ (LTCD4) mis en contact avec le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) pouvaient libérer de plus grandes quantités d'exosomes. De plus, une préparation virale dépourvue en exosomes augmente la viabilité des LTCD4. Enfin, une analyse protéomique d'échantillons purifiés d'exosomes sur gradient d'optiprep a révélé un contenu enrichi en protéines jouant un rôle important dans la survie cellulaire : telle que, les protéines Death-Associated-Protein 3 (DAP3) et Apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF-1). Ces deux protéines sont connues pour participer à la voie d'activation des caspases entraînant l'apoptose. De ce fait, la présence de ces protéines dans les exosomes pourrait contribuer à l'élimination des LTCD4. En utilisant l'immunobuvardage nous avons mis en place le protocole et confirmé les résultats de l'analyse protéomique dans les cellules HEK-293T. Cependant, seulement la protéine DAP3 est détectée dans les exosomes isolés à partir de CDs mises en contact avec du virus atténué. De plus, il s'avère qu'une infection productive est nécessaire pour déceler la protéine. Finalement, en utilisant des ARN antisens anti-DAP3, nous avons favorisé la diminution de l'expression de la protéine DAP3. Ainsi, nous pouvons moduler l'expression de la protéine dans les CDs afin de vérifier éventuellement son impact sur la viabilité des LTCD4. En conclusion, tous les outils sont mis en place afin d'assurer la suite du projet qui pourrait nous permettre de mieux comprendre la depletion des LTCD4 lors de la primo-infection.

Lors d'une exposition au VIH-1, bien qu'une seule petite proportion des macrophages soit infectée, il est proposé que ces cellules jouent un rôle important dans l'infection et la propagation du VIH-1. Pour approfondir nos connaissances dans ce domaine, des analyses transcriptomiques et protéomiques ont été effectuées afin de comparer les MDMs (Macrophages Dérivés de Monocytes) infectés aux non infectés. Ces analyses ont mené à la sélection de 50 gènes dont l'expression est modulée chez les cellules infectées pour effectuer un criblage par siRNA pour leurs rôles fonctionnels dans le cycle viral. Huit cibles ont été identifiées comme des régulateurs de l'infection chez les MDMs, mais seulement le gène MDM2 agissait comme un facteur de susceptibilité. Ce gène a donc été l'objet d'études plus approfondies. L'inhibition de l'expression de MDM2 induit une diminution de moitié de l'expression virale. Nos résultats indiquent que la résistance accrue au VIH-1 associée à l’interférence de MDM2 est maintenue même si le niveau d'ARNm est rétabli, suggérant que cette protéine serait impliquée indirectement dans l'infection par le VIH-1. L'identification des cofacteurs viraux régulés par MDM2 mènera à une compréhension des évènements signalétiques contrôlant la réplication du VIH-1 dans les macrophages. / Upon exposure to HIV-1, only a small proportion of macrophages are infected whereas most remain uninfected. It is proposed that these cells play an important role in the establishment and propagation of HIV-1 infection. To further our knowledge in this field, transcriptomic and proteomic comparative analyses of uninfected and HIV-1-infected MDMs (Monocyte-derived macrophages) were performed. These analyses led to the selection of 50 genes that were tested for their functional roles in HIV-1 replication by siRNA screen. Eight genes were identified as regulators of HIV-1 infection in MDMs, but only MDM2 acted as a susceptibility factor. The knockdown of MDM2 decreased HIV-1 expression by two folds. Our results indicate that the resistance to HIV-1 upon MDM2 silencing is maintained in MDMs even if MDM2 mRNA level is restored, thus suggesting that this protein might be indirectly involved in HIV-1 infection. Identification of viral cofactors regulated by MDM2 will bring a new understanding of signaling events controlling HIV-1 replication in macrophages.

La 17β-HSD1 catalyse l’activation de l’oestrogène le plus actif, l’estradiol, ainsi que la désactivation de la dihydrotestosterone, l’androgène le plus puissant. Cette enzyme est considé ré e comme une cible prometteuse pour le traitement des maladies dépendantes des oestrogènes. Malgré des décennies de recherches, aucun inhibiteur ciblant la 17β-HSD1 n’a encore atteint le stade clinique. De plus, le mécanisme de l’inhibition du substrat de la 17β-HSD1, qui peut être utilisé pour faciliter la conception d’inhibiteur, n’est toujours pas bien dé montré de maniè re structurelle. Ici, nous avons Co-cristallisé trois inhibiteurs de différence, à savoir l’EM- 139, le 2-MeO-CC-156 et le PBRM, avec la 17β-HSD1 et avons résolu ces structures cristallines. L’inhibiteur ré versible EM-139 s’est révélé moins stable dans le site de liaison aux stéroïdes, avec seulement la fraction du noyau stéroïdien de l’inhibiteur présentant une densité d’électron définissable. La fraction volumineuse de 7α-alkyle de l’inhibiteur, qui limite son activité anti-oestrogénique, n’est pas dé finie dans la densité électronique, peut compromettre l’effet inhibiteur de l’inhibiteur sur l’enzyme. Quant à l’inhibiteur réversible, le 2-MeO-CC-156, il interagit de maniè re similaire que le CC-156 avec l’enzyme. Cependant, avec la présence du groupe 2-MeO, le pouvoir inhibiteur de la 17β-HSD1 est nettement infé rieur à celui du CC-156. L’analyse du complexe ternaire PBRM avec la 17β-HSD1 montre clairement la formation d’une liaison covalente entre l’His221 et la chaîne laté rale bromoethyl de l’inhibiteur, donnant un aperç u des interactions molé culaires bé né fiques qui favorisent la liaison et l’avè nement de N-alkylation ulté rieur dans le site catalytique de l’enzyme. En outre, le groupe bromoethyl en position C-3 du PBRM justifie son profil non oestrogénique, ralentit son mé tabolisme et assure son action spé cifique de la 17β-HSD1 par la formation d’une liaison covalente avec Nε du ré sidu His221. Nous avons aussi Co-cristallisé la 17β-HSD1 avec l’oestrone ainsi qu’avec l’analogue de l’oestrone et du cofacteur NADP+, la structure a révélé un mode de liaison inversé de l’oestrone dans l’enzyme, jamais trouvé dans les complexes d’estradiol. L’analyse structurale a démontré que His221 est le résidu clé responsable de la réorganisation et de la stabilisation de l’oestrone liée de manière inversée, conduisant à la formation d’un complexe sans issue. Ainsi, sur la base du mécanisme d’inhibition du substrat et de l’analyse computationnelle, une novelle entité chimique (SX7) est proposé e qui peut inhiber la 17β-HSD1 et former un complexe sans issue. De plus, avec un grand nombre d’échantillons cliniques, nous avons dé montré la modulation et la corrélation d’expression significative de plusieurs enzymes clés de conversion des sté roïdes, supportant les 17β-HSD1 et 17β-HSD7 ré ductrices comme cibles prometteuses et la nouvelle thé rapie combiné e ciblant les 11β-HSD2 et 17β- HSD7 / Human 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (17β-HSD1) catalyzes the activation of the most potent estrogen estradiol as well as the deactivation of the most active androgen dihydrotestosterone, and is considered as a promising target for the treatment of estrogen-dependent diseases such as endometriosis, breast cancer, endometrial cancer and ovarian cancer. Despite decades of research, no inhibitor targeting 17β-HSD1 has yet reached the stage of clinical trials. Moreover, the structure-biological function of the substrate inhibition of 17β-HSD1, which can be used to facilitate the inhibitor design, is still not well demonstrated. Here we co-crystallized three different inhibitors, namely EM-139, 2-MeO-CC-156 and PBRM, with 17β-HSD1 and solved the structures of these complexes. The reversible inhibitor EM-139 showed high mobility in the steroid binding site with only its steroid core moiety could be defined in the electron density. The bulky 7α-alkyl moiety of the inhibitor, which guarantees its anti-estrogenic activity but unable to be defined in the electron density, may compromise the inhibitory effect of the inhibitor on the enzyme. As for the reversible inhibitor 2-MeO-CC-156, it interacts similarly to CC-156 with the enzyme. However, in the presence of the 2- MeO group, it shows much less inhibitory potency to 17β-HSD1 as compared to the CC-156. The analysis of the PBRM ternary complex with 17β-HSD1 clearly shows an unambiguous continuity of electron density from the side chain of His221 to the bound PBRM, demonstrating the formation of a covalent bond between the Nε of His221 and the C-31 (BrCH2) of the inhibitor. This result provides insight into beneficial molecular interactions that favor the binding and subsequent N-alkylation event in the enzyme catalytic site. Also, the bromoethyl group at position C-3 of the PBRM warrants its non-estrogenic profile, slows down its metabolism, and secures the specific action of 17β-HSD1 through the formation of a covalent bond with Nε of residue His221. Meanwhile, we co-crystallized 17β-HSD1 with estrone as well as with estrone and cofactor analog NADP+, revealed a reversely orientated binding mode of estrone in the enzyme, never found in reported estradiol complexes. Structural analysis demonstrated that His221 is the key residue responsible for the reorganization and stabilization of the reversely bound estrone, leading to the formation of a dead-end complex. Thus, based on the substrate inhibition mechanism and computational analysis, a chemical entity (SX7) is proposed that may inhibit 17β-HSD1 and form a dead-end complex. Furthermore, with large number clinical samples, we demonstrated the significant expression modulation and expression correlation of several key steroidconverting enzymes, supporting the reductive 17β-HSD1 and 17β-HSD7 as promising targets and the new combined therapy targeting 11β-HSD2 and 17β-HSD7.