Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2008.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2005. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 78-87).

Tierärztl. Hochsch., Diss., 2003--Hannover.

Orientador: Cristiano Gallina Moreira / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Samar Freschi de Barros / Resumo: Salmonella Typhimurium é um patógeno causador de gastroenterite em humanos e outros mamíferos, e sua habilidade de invadir as células epiteliais e replicar-se dentro de macrófagos a torna um importante modelo de estudo de mecanismos de virulência e interação patógeno-hospedeiro. O estudo desta interação baseia-se na sinalização química via hormônios do hospedeiro e do patógeno, e durante a investigação destes processos foi detectada uma nova proteína denominada VisP, relacionada a funções celulares diversas como manutenção de membrana, metabolismo, virulência bacteriana e resposta ao estresse. A motilidade via flagelos, importante na colonização e exploração de novos nichos, é um dos importantes mecanismos de patogenicidade bacteriana durante o processo de infecção. O objetivo deste trabalho foi investigar a motilidade mediada por flagelos e seu funcionamento em S. Typhimurium, bem como a participação de VisP durante o processo. Para isso, foram feitos ensaios de motilidade, análise da expressão gênica de genes alvos importantes para a patogênese, expressão da flagelina FliC e microscopia em cada um dos mutantes isogênicos comparados à cepa selvagem. Foi evidenciado que a retirada do gene visP afeta a motilidade de S. Typhimurium, bem como promove um desequilíbrio na homeostase da membrana celular, gerando um aumento exacerbado de flagelina através de um mecanismo ainda não elucidado. A compreensão destes processos é essencial para o entendimento da relação patógeno-hospedeir... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Salmonella Typhimurium is a pathogen that promotes gastroenteritis in humans and mammals, and its ability to invade epithelial cells and replicate inside macrophages makes Salmonella an important model for the study of virulence and host-pathogen interactions. This interaction is based on chemical signaling via host and pathogen hormones, and during this investigation a novel protein named VisP was described. This protein is related to diverse cell processes as membrane maintenance, metabolism, virulence and stress response. Flagellar motility, which is important for colonization and exploration of new niches, is one of the bacterial pathogenicity mechanisms that occurs during infection. The aim of the study was to investigate flagellar motility and its operation in S. Typhimurium and verify the participation of VisP protein during this process. Motility assays, gene expression analysis of target genes important for pathogenesis, expression of FliC protein and microscopy were performed with the isogenic mutants comparative to the wild type. The results demonstrated that the visP gene impacts motility in S. Typhimurium, promoting a misbalance in cellular membrane and increasing levels of flagellin via an unknown mechanism. The elucidation of these processes is essential to understanding host-pathogen associations, and contributes to the development of novel technologies and therapies. / Mestre

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T13:49:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225390.pdf: 1106891 bytes, checksum: 2bb5cae7c975eda6d81cab7a182b1ea4 (MD5) / Devido ao hábito alimentar filtrador dos moluscos bivalves, estes organismos podem concentrar, em seus tecidos, microrganismos patogênicos presentes nas águas de cultivo, sendo associados com intoxicações alimentares, como a salmonelose. O Estado de Santa Catarina, por suas características geográficas e da qualidade das águas litorâneas, tornou-se um ambiente ideal para o cultivo de organismos marinhos, especialmente moluscos bivalves, como ostras da espécie Crassostrea gigas. Considerando registros recentes de contaminação por patógenos entéricos em alguns locais de cultivo de moluscos na Ilha de Santa Catarina, a produção e comércio de moluscos necessitam ser monitorados. Com o objetivo de expandir a maricultura na costa do Estado de Santa Catarina e garantir um produto final com alto valor comercial, um sistema de depuração de moluscos foi desenvolvido pela empresa Blue Water Aquaculture e avaliado em relação à eliminação de Salmonella enterica serovar Typhimurium por ostras da espécie C.gigas. Inicialmente, foi padronizado o método para detecção da presença de S. Typhimurium em tecido digestivo de ostras. Esta metodologia consistiu em dissecação do tecido digestivo de ostras, pré-enriquecimento da amostra em meio de cultura não seletivo, extração do DNA bacteriano, e PCR seguida de hibridização molecular utilizando como sonda o produto de PCR de S.Typhimurium marcado com digoxigenina. Como resultado da padronização da metodologia de detecção molecular, foi desenvolvido um método sensível para detectar baixos níveis de S. Typhimurium em tecido digestivo de ostras (0.1UFC/g). Simultaneamente aos trabalhos de depuração, um dos pontos de cultivo de ostras de Florianópolis foi monitorado, no período entre março e outubro de 2005, em relação à qualidade microbiológica da água e da carne dos moluscos ali cultivados. Como resultado foi observado um alto índice de contaminação fecal nas águas e presença de Salmonella spp. nas ostras, enfatizando ainda mais esta necessidade de validação de um sistema de depuração. O sistema de depuração utilizado foi um sistema fechado, no qual 1000 L de água recircularam por 24h. Parâmetros como o tempo de depuração e o tratamento da água utilizada na recirculação foram também avaliados. Durante a recirculação, a água foi esterilizada com luz Ultra Violeta, cloro e associação dos dois tratamentos. Para a validação do sistema de depuração, ostras cultivadas em Santa Catarina (C.gigas) foram inicialmente contaminadas com S. Typhimurium. As ostras foram amostradas após 0, 6, 12, 18 e 24h para avaliar a dinâmica de depuração. Após cada coleta, as amostras foram analisadas por métodos clássicos de microbiologia para quantificar as bactérias viáveis no tecido digestivo das ostras. Os ensaios de depuração com água tratada com UV e Cloro, separadamente, mostraram uma crescente eliminação de bactérias viáveis durante os períodos de depuração, com 90% da contaminação eliminada em 24h. A associação destes tratamentos mostrou a total eliminação das bactérias dentro de 12h. A PCR apresentou uma variável detecção do genoma bacteriano em todos os métodos para esterilização da água, demonstrando que a detecção molecular, nesse caso, não é uma boa metodologia, já que não é indicadora da viabilidade bacteriana, podendo detectar fragmentos de DNA de bactérias inviáveis. Este tipo de trabalho é pioneiro no Brasil e, considerando que o Estado de Santa Catarina apresenta liderança na produção de moluscos no Brasil e que até o momento não há um programa sanitário para regulamentar a exportação da produção, os resultados encontrados apresentam uma grande contribuição para a economia e o desenvolvimento sustentável do país.

The overall aim of this project was to determine the molecular mechanisms by which the flagellin gene from Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) activates the NAIP/NLRC4 inflammasome and its contribution to the host protective immune response against salmonellosis. Inflammasomes are multi-protein complexes formed in response to the activation of pattern recognition receptors (PRRs). The NOD-like receptor (NLR)-family of inflammasome complexes are formed from the cytosolic NLR receptors, ASC adaptor and caspase-1 in response to pathogen- associated molecules or danger-associated signals. The NAIP/NLRC4 inflammasome is activated by the S. enterica flagellar filament protein (FliC), the SPI-1 type III secretion system needle (PrgI) and inner rod proteins (PrgJ). Recognition of these bacterial ligands by the NAIP receptors allows oligomerisation with NLRC4 and subsequent recruitment of caspase-1. Caspase-1 mediates pyroptosis, while recruitment of ASC is also required for cleavage of pro-IL-1β and pro-IL-18 to their active forms by caspase-1. Differential recognition of the flagellar filament proteins (flagellin) by the NAIP/NLRC4 inflammasome forms an important part of my thesis. Here, I have looked at the molecular mechanisms and immunological consequences of the differential recognition of flagellin by the NAIP/NLRC4 inflammasome using S. Typhimurium SL1344 and the non-pathogenic E. coli strain K12-MG1655. An important part of my work was to try and determine which regions of fliC are required for NAIP/NLRC4 inflammasome activation and whether they can be mutated while preserving motility. To do this a panel of ten strains expressing chimeric fliC genes were created and characterised in macrophage infection experiments and bacterial motility assays. My results confirm the C-terminus of FliC is critical for both inflammasome activation and motility in agreement with published reports. To further investigate this differential recognition by the NAIP/NLRC4 inflammasome I modified S. Typhimurium strain of moderate virulence (M525P) to express flagellin from E. coli K12-MG1655. This strain (M525PΔfliC::fliCK12-MG1655CmR) retained motility and both in vitro and in vivo characterisation was carried out in macrophages and using a murine model of sublethal salmonellosis respectively. Activation of the NAIP/NLRC4 inflammasome was impaired in murine macrophages infected with M525PΔfliC::fliCK12-MG1655CmR when compared to those infected with M525P. Mice infected with M525PΔfliC::fliCK12-MG1655CmR had increased liver and spleen bacterial burdens compared to those infected with M525P, indicating that optimal NAIP/NLRC4 inflammasome activation is key for efficient control of microbial spread in vivo. The role of NAIP receptors in inflammasome formation was further investigated with the use of CRISPR/Cas9 to generate mutant murine macrophage cell lines. To investigate the consequence of gene deletions cell lines were designed to lack NAIP 1, 2, 5 and 6, while others were designed to express tagged NAIP proteins to elucidate the cellular localisation of the NAIP proteins during inflammasome formation by microscopy. Characterisation of these cell lines is ongoing, with extensive optimisation of the CRISPR/Cas9 technique undertaken during this study.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T22:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_Sergiode_D.pdf: 5307853 bytes, checksum: de9b6f00c4099ec1ab0d2f50163feb4e (MD5) Previous issue date: 1999 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Salmonella enterica species are intracellular bacteria causative agents of gastroenteritis and typhoid fever in humans. Pregnancy poses an increased risk of severe Salmonellosis in many mammalian species contributing to miscarriage and/or maternal illness. Previous studies indicated that Salmonella infection in pregnant mice caused rapid fetal and maternal death due to massive bacterial proliferation in the placenta. However, the susceptibility of human primary trophoblast cells (cTBCs) to Salmonella infection was not known. We hypothesized that human placental trophoblast cells are productively infected and provide a unique intracellular niche that permits uncontrolled Salmonella replication due to an ineffective maternal innate immune response to the virulent bacteria resulting in placental death. Firstly, we observed that S.Tm strains defective in the Salmonella pathogenicity island (SPI)-1 type III secretion system (TTSS) (S.Tm-ΔinvA) were unable to enter epithelial cells, but efficiently infected placental choriocarcinoma cell lines through scavenger receptor-mediated endocytosis. Next, we observed that S.Tm failed to grow vigorously in macrophages, but replicated rapidly within epithelial and placental trophoblast cells. Further examination of intracellular localization of S.Tm indicated that bacteria were arrested in early Rab5 expressing phagosomal vesicles within trophoblast cells, whereas phagosomal maturation progressed steadily in macrophages (with expression of lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) and cathepsin D). Moreover, human primary cTBCs harboring S.Tm underwent rapid death of the cells. Infected cTBCs expressed phosphorylated-receptor-interacting serine/threonine-protein kinase (RIPK)-1 protein and phosphorylated-mixed lineage kinase domain-like (MLKL), suggesting induction of the necroptosis pathway of cell death. Furthermore, specific inhibition of necroptosis rescued S.Tm-induced death of cTBCs. Finally, S.Tm infected trophoblast cells produced interleukin (IL)-10, and signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 signalling. This correlated to delayed phagosomal maturation which consequently facilitated intracellular pathogen proliferation. Overall, human trophoblast cells may act as reservoirs for S.Tm survival and may aid dissemination in the pregnant host.

Magíster en Bioquímica en el área de especialización de Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular / Memoria para optar al Título de Bioquímica / El género Salmonella comprende dos especies, S. enterica y S. bongori, que en conjunto agrupan a más de 2.500 serovares. De éstos, los pertenecientes a S. enterica subespecie enterica son responsables de aproximadamente el 99% de los casos de salmonelosis en animales de sangre caliente. A nivel mundial se producen anualmente millones de casos de salmonelosis en el ser humano y miles de muertes, principalmente en países subdesarrollados. En esta tesis se propuso identificar un conjunto de genes requeridos para la colonización sistémica de un hospedero murino por tres serovares de Salmonella: S. Typhi, S. Typhimurium y S. Enteritidis. Este estudio se realizó mediante un análisis masivo de mutantes bajo selección negativa in vivo. La detección de aquellas mutantes con defectos en la colonización sistémica aguda de ratones BALB/c se realizó mediante hibridaciones comparativas utilizando un microarray genómico de Salmonella. El posterior análisis comparativo de las mutantes bajo selección negativa in vivo en los tres serovares, nos permitió identificar que mutantes en 131 genes serían atenuadas in vivo. Dentro de este grupo identificamos genes codificados en islas de patogenicidad conservadas del género Salmonella, genes necesarios para la biosíntesis de purinas y compuestos aromáticos (aro, pur y gua), genes relacionados con la biosíntesis y modificación del LPS (rfa, rfb) y genes que codifican reguladores globales asociados a patogenicidad (phoP, envZ, rpoN, dam y rsd). Otros genes identificados corresponden a los que codifican el sistema transportador de proteínas Twin-Arginine (tatABC), genes que codifican las diferentes subunidades de una NADH deshidrogenasa (genes nuo); un locus que corresponde a un transportador de péptidos del tipo ABC (sapBF). También pudimos detectar que mutantes en genes involucrados en el transporte de solutos se encuentran bajo selección, como trkH que codifica un transportador de potasio. El sistema de transporte Twin-Arginine corresponde a una de las dos vías de translocación de proteínas hacia el espacio periplasmático en bacterias Gram negativo. La participación de este sistema en la patogenicidad de Salmonella se confirmó mediante ensayos de competencia in vivo entre mutantes definidas del operón y la respectiva cepa silvestre en los tres serovares estudiados. El análisis global de mutantes en tres serovares nos permitió determinar un conjunto de genes comunes necesarios para establecer la colonización sistémica aguda en un hospedero murino. Posteriormente, se confirmó la participación del sistema de transporte de proteínas Tat en la patogenicidad de Salmonella. Los resultados de los ensayos de competencia nos permitieron confirmar la predicción obtenida en el análisis de masivo de mutantes bajo selección negativa in vivo. / The Salmonella genus comprises two species: S. bongori and S. enterica, which can be grouped into more than 2,500 serotypes. Serovars within S. enterica subspecies enterica account for ~99% of all salmonellosis in warm-blooded animals. Worldwide, these organisms are responsible for hundreds of millions of salmonellosis cases and hundreds of thousands of deaths, mainly in underdeveloped countries. In this thesis, we aimed to identify a group of genes required for systemic colonization of a murine host by three Salmonella serotypes: S. Typhi, S. Typhimurium and S. Enteritidis. We used a high-throughput microarray-based screening for mutants with defects in systemic colonization of BALB/c mice. Subsequent comparative analysis of mutants under negative selection in vivo allowed us to identify that mutants in 131 genes are attenuated in the three serotypes under study. Within this group we found genes encoded in some of the pathogenicity islands conserved in the Salmonella genus, genes required for biosynthesis of purines and aromatic compounds (aro, pur and gua), genes related to LPS biosynthesis (rfa and rfb) and genes encoding regulators previously associated with virulence (phoP, envZ, rpoN, dam and rsd). Other genes identified are those encoding the Twin-Arginine transport system (tatABC), genes coding the different subunits of a NADH dehydrogenase (nuo genes) and a locus encoding an ABC peptide transporter (sapBF). We also identified that mutants in genes involved in solute transport (i.e: trkH, that encodes a potassium transporter) are under negative selection in vivo. The Twin-Arginine transport system corresponds to one of the two pathways used by Gram-negative bacteria to translocate proteins to the periplasmatic space. Participation of this system in Salmonella pathogenicity was confirmed in the three serotypes under study by means of in vivo competition assays between targeted mutants of the operon and the corresponding wild-type strains. Overall, the global analysis of mutants under negative selection in vivo in three serotypes of Salmonella allowed us to identify a common group of genes required to establish acute systemic colonization of a murine host. We confirmed the participation of the Tat transport system in the pathogenicity of Salmonella using in vivo competition assays. These results further support the predictions obtained in our global analysis. / Fondecyt

Analiza el efecto de la lactoferrina en la cinética de crecimiento de Salmonella typhimurium cepa SL 1344 ΔhilA, evalúa el efecto citotóxico del tratamiento con gentamicina a células HEp-2, determina el efecto in vitro de la lactoferrina sobre la adhesión de Salmonella typhimurium SL 1344 ΔhilA y especifica el tratamiento y concentración de lactoferrina que permita mayor disminución de la adherencia e invasión a las células HEp-2. / Tesis