Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l'expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l'ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l'intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l'Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d'interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d'insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d'identifier un nouveau domaine indispensable à l'interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d'ASK1 chez Arabidopsis thaliana.

Les β2-agonistes sont couramment utilisés pour prévenir et réduire les symptômes de l'asthme et de la bronchoconstriction induite par l'exercice. Mais, pris en quantités supérieures aux doses thérapeutiques, les β2-agonistes ont un effet anabolisant qui a été clairement démontré in vivo. Un certain nombre d'acteurs sont mis en jeu dans la réponse biologique du tissu musculaire aux β2-agonistes. L'un de ces acteurs est la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR, voie d'initiation de la traduction, ayant un rôle majeur dans la synthèse protéique. Dans ce contexte, notre première étude avait pour objectif de déterminer la cinétique des événements moléculaires responsables de l'hypertrophie du muscle squelettique de rat après administration de formotérol pendant 1 jour (J1), 3 jours (J3) et 10 jours (J10). Nous avons montré que l'administration de formotérol induisait une hypertrophie musculaire à J3 et J10 associée à l'activation transitoire de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR (J1 et J3), et à une diminution de l'expression de l'E3 ubiquitine ligase MAFbx/Atrogin-1 (J3). La voie autophagie lysosome ne semblait pas être affectée. Ainsi, l'ensemble de ces résultats suggère que l'activation de la voie PI3K/Akt/mTOR est associée à la voie ubiquitine-protéasome mais pas à la voie autophagie-lysosome. La régulation transitoire de la voie PI3K/Akt/mTOR suggère que d'autres voies de signalisation sont impliquées dans l'hypertrophie musculaire induite par le formotérol. Le 007-AM, analogue de l'AMPc, a été décrit comme pouvant stimuler la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR via l'activation de la protéine Epac, suggérant que le 007-AM puisse constituer une molécule de substitution à l'utilisation des β2-agonistes. Notre seconde étude avait pour but de déterminer si le 007-AM avait une action anabolisante sur le tissu musculaire, mais également de déterminer si la 007-AM était une molécule stable permettant d'envisager son usage dans un cadre pharmacologique. L'administration de 007-AM pendant 7 jours chez des souris n'engendrait pas d'hypertrophie musculaire. En revanche, in vitro sur cellules C2C12, le 007-AM activait la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR comme en témoignait l'augmentation de la phosphorylation des protéines rpS6 et 4E-BP1. Nos résultats montraient également que le 007-AM était instable dans le plasma alors que son produit de dégradation, le 007 était plus stable. Pris ensembles, ces résultats suggèrent qu'un traitement de 7 jours au 007-AM n'est pas suffisant pour induire une hypertrophie musculaire et que l'absence d'hypertrophie musculaire pourrait provenir de l'instabilité du 007-AM dans le plasma. Toutefois, des études supplémentaires seront nécessaires pour confirmer ces résultats

Chaque individu est exposé quotidiennement à des agents infectieux comme les bactéries, les champignons, les virus et les parasites sans pour autant développer une maladie. Cependant, certains vont développer des infections graves et récurrentes, causées par des microbes dont certains ont un faible pouvoir pathogène pour l’homme. Ceci suggère, qu’il existe entre les individus sensibles et résistants une variabilité au niveau du système immunitaire. Deux types de déficits immunitaires primitifs (DIP) de transmission mendélienne ont été décrits. Les DIP dit « classiques » sont monogéniques et prédisposent majoritairement à une susceptibilité infectieuse à large spectre d’agents pathogènes (un gène, plusieurs infections). Les seconds DIP sont également monogéniques mais sont responsables d’une susceptibilité infectieuse réduite à un groupe de pathogènes (un gène, un seul type d’infection). Chez de nombreux, patients, le défaut génétique responsable de DIP n’est pas identifié. Dans ce contexte, l’objectif de recherche de mon doctorat a été de caractériser deux DIP responsables d’une susceptibilité aux infections bactériennes. J’ai tout d’abord mis en évidence un nouveau mécanisme physiopathologique de la protéine NEMO, régulateur de la voie NF-κB, responsable d’un DIP associé à une dysplasie ectodermale anhidrotique (EDA). Ce mécanisme pathologique est caractérisé par une expression et une structure protéique conservées mais confère sélectivement un défaut de liaison de NEMO à l’ubiquitine, interaction essentielle dans l’activation de la voie NF-κB. Ceci démontre qu’une expression et une structure protéique normales n'excluent en rien un rôle pathologique de mutations dans le gène NEMO, dans un EDA-DIP. Dans un deuxième temps, j’ai mis en évidence un nouveau DIP affectant la voie de l’explosion oxydative spécifiquement dans les polymorphonucléaires et qui confère une susceptibilité sélective aux infections bactériennes de type pyogènes. Le patient étudié est né de parents consanguins et a présenté des infections récurrentes des voies respiratoires supérieures ainsi qu’une cellulite à Staphylococcus epidermidis. Par une approche génétique associant analyse de liaison et séquençage de l'exome, une mutation homozygote rare a été identifiée dans le gène codant NRAMP1. Cette mutation co-ségrège avec la maladie selon un mode de transmission autosomique récessif et altère spécifiquement l’expression de la protéine dans les granulocytes. Ce premier déficit en NRAMP1 décrit chez l’homme, compromet à la fois la voie de l’explosion oxydative et le contrôle de l’infection in vitro par Staphylococcus aureus dans les granulocytes. Cette étude implique NRAMP1 dans l'immunité contre les bactéries pyogènes via son rôle dans la production des espèces réactives de l’oxygène dans les granulocytes. Ce travail ouvre la voie vers un meilleur diagnostique et conseil génétique pour les patients souffrant de PID. / Human populations are exposed to infectious agents such as bacteria, fungi, viruses and parasites on a daily basis without developing any disease. However, a minority of individuals will suffer from infections to some microbes that are usually non-pathogenic to man, or will undergo severe and/or recurrent diseases usually easily treatable for others. This means that there is variability among individuals regarding their immune system, underlined by genetics between susceptible and resistant individuals. Two types of primary immuno deficiencies with a Mendelian mode of inheritance have been described. The first known as the classical primary immunodeficiency and is monogenic and predisposes in general to infections with a broad spectrum of infectious agents (one gene, multiple infections). The second type is also monogenic but predisposes generally to infections limited to a particular group of pathogens (one gene, one type of infection). The aim of my doctoral research was to characterize two new immunodeficiencies. First I highlighted a new physiopathological mechanism of the NEMO protein, a regulator of NF-κB pathway. This defect is characterized by normal protein expression and folding, but a specific defect of NEMO’s ubiquitin binding, which is an essential mechanism for the activation and regulation of the NF-κB pathway. This demonstrates that normal expression and structure of the protein do not exclude a pathological role of NEMO mutations in EDA-ID. I also described a new immune deficiency affecting the respiratory burst pathway in granulocytes which specifically confers a selective susceptibility to pyogenic bacterial infections. We studied a patient who was born from consanguineous parents, and who suffered from recurrent infections of the upper respiratory tract and cellulitis to S. epidermidis. By a genetic approach involving linkage analysis and exome sequencing, I identified a rare homozygous mutation (V484M) in the gene encoding for the NRAMP1 protein that co segregates with the disease with an autosomal recessive transmission. Specifically, this mutation impairs NRAMP1 protein expression in granulocytes, while expression remains normal in other phagocytic cells. NRAMP1 deficiency impairs both the respiratory burst and control of in vitro infection by S. aureus in granulocytes. Therefore, we identified the first NRAMP1 human deficiency. The mutation selectively affects granulocytes and is clinically responsible for pyogenic infections. This study helps to delineate the role of NRAMP1 in immunity against pyogenic bacteria through its involvement in reactive oxygen species production in granulocytes.

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La topoisomérase I (Top1) élimine les surenroulements de l'ADN générés lors de la transcription en produisant transitoirement des complexes de clivage Top1-ADN (Top1cc). Ces Top1cc transitoires peuvent être stabilisés par les camptothécines, dont sont dérivés des agents anticancéreux, et par les fréquentes altérations de l'ADN. Bien que les Top1cc stabilisés soient des lésions qui bloquent efficacement la transcription, la compréhension des processus moléculaires qui résultent du blocage des complexes transcriptionnels par les Top1cc est encore limitée. Des travaux précédents ont montré que les Top1cc stabilisés produisent des cassures double-brin (DSBs) de l'ADN dépendantes de la transcription qui activent ATM. Dans ce projet, nous avons utilisé des cellules quiescentes traitées avec la camptothécine pour induire des Top1cc bloquant la transcription et nous avons étudié les mécanismes de la production et de la signalisation des DSBs. Nous montrons que les DSBs sont produites préférentiellement dans les régions sub-télomériques lors de la réparation des Top1cc bloquant la transcription par les cassures simple-brin de l'ADN générées après la protéolyse de la Top1 et avant l'action de Tdp1. L'analyse de la signalisation de ces DSBs révèle une nouvelle fonction de DNA-PK dans la promotion de l'ubiquitinylation conduisant (i) à l'activité complète d'ATM aux sites des DSBs en favorisant l'ubiquitination d'H2AX et H2A, et (ii) à l'augmentation de la réparation des Top1cc en favorisant la protéolyse de la Top1. Enfin, nous montrons que les DSBs co-transcriptionnelles induisent la mort des cellules quiescentes. L'ensemble de ces résultats apportent un nouvel aperçu des réponses cellulaires aux camptothécines, et suggèrent que les DSBs qui résultent des Top1cc bloquant la transcription puissent contribuer à la pathogénèse du syndrome neurodégénératif SCAN1, qui est causé par une déficience en Tdp1. / Topoisomerase I (Top1) removes DNA supercoiling generated during transcription by producing Top1-DNA cleavage complexes (Top1cc). These transient Top1cc can be stabilized by camptothecins, from which anticancer drugs are derived, and by common DNA alterations. Although stabilized Top1cc are potent transcription-blocking lesions, our understanding regarding the molecular processes resulting from the stalling of transcription complexes by Top1cc is currently limited. Previous work showed that stabilized Top1cc produce transcription-dependent DNA double-strand breaks (DSBs) that activate ATM signalling. In this project, we used camptothecin-treated quiescent cells to induce transcription-blocking Top1cc and study the mechanisms of DSB production and signalling. We show that DSBs form preferentially at subtelomeric regions during the repair of transcription-blocking Top1cc from DNA single-strand breaks generated after Top1 proteolysis and before Tdp1 action. Analysis of DSB signalling reveals a novel function of DNA-PK in promoting protein ubiquitination leading (i) to full ATM activity at DSB sites by promoting H2AX and H2A ubiquitination, and (ii) to enhancement of Top1cc repair by promoting Top1 proteolysis. Finally, we show that co-transcriptional DSBs kill quiescent cells. Together, these findings provide new insights into the cellular responses to camptothecins and further suggest that DSBs arising from transcription-blocking Top1cc may contribute to the pathogenesis of the neurodegenerative SCAN1 syndrome, which is caused by Tdp1 deficiency.

Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l’expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l’ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l’intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l’Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d’interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d’insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d’identifier un nouveau domaine indispensable à l’interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d’ASK1 chez Arabidopsis thaliana. / The selective degradation of proteins is an important means of regulating gene expression and plays crucial roles in the control of various cellular processes. The Ubiquitin (Ub)–Proteasome System (UPS) is the principal non-lysosomal proteolytic pathway in eukaryotic cells and is required for the degradation of key regulatory proteins. Ubiquitin is a 76-residue protein that can be attached covalently to target proteins through an enzymatic conjugation cascade involving three enzymes denoted, E1, E2 and E3.The SCF complex is a type of ubiquitin-protein ligase (E3) that acts as the specific factor responsible for substrate recognition and ubiquitination. Some polyubiquitinated proteins are then targeted to the 26S proteasome for degradation. The SCF complex consists of four components including SKP1, Cullin1, Rbx1 and a large gene family of F-box proteins. Twenty one SKP1-related genes have been described in the Arabidopsis genome and some of these genes have been analyzed genetically. By contrast, little is known about the function and structure of SKP1 homologues in wheat. Some of the Triticum SKP1-related protein (TSKs) have been characterized in this study. Five complete sequences of SKP1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 and TSK16), five F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 and ABA-T), one Cullin1 and one Rbx, were successfully cloned and biochemically characterized. Yeast two-hybrid analysis showed that TSK1 and TSK3 are capable of interacting with different F-box proteins. Furthermore, TSK11 contains an additional domain that changed its interaction capabilities. In vitro analysis using a chimeric protein showed that this additional domain could modify the interaction between a SKP-like protein and two F-box proteins. Expression analyses revealed that TSK1 and TSK16 were expressed predominantly in roots. While, TSK3, TSK6 and TSK11 were expressed in several wheat organs. In addition, the TSK11 was up-regulated in the leaves at the flowering stage.

Des études chez les animaux ont montré que ZRF1 a une fonction lectrice au niveau de H2Aub1 dans la dérépression de gènes réprimés par polycomb. Deux gènes homologues au gène humain ZRF1 ont été identifiés dans le génome d'Arabidopsis, et ont par la suite été appelés AtZRF1 a etAtZRF1 b. La caractérisation fonctionnelle de ces gènes n'a pas encore été rapportée. Ma première objective était d'obtenir des connaissances générales sur AtZRF1 a et AtZRF1 b. Tous les deux sont exprimés dans des plantes d'Arabidopsis et la protéine AtZRF1 b est localisée dans le noyau et dans le cytoplasme. En plus, nous avons trouvé que la protéine AtZRF1 b lie H2Aub1 avec les mêmes caractéristiques que la protéine ZRF1 humaine. J'ai utilisé les outils génétiques puissants disponibles pour Arabidopsis pour étudier la fonction d'AtZRF1 a et AtZRF1 b. Plusieurs lignées d'insertion de T-DNA indépendantes ont été identifiées. A cause d'une rédondance fonctionelle,des mutants simples n'ont pas de défauts de développement évidents. C'est pourquoi j'ai étudié un mutant double qui montrent une perte de fonction pour les deux gènes AtZRF1 a et AtZRF1 b. Ce double mutant révèle des rôles importants pour ces gènes dans la croissance et le développement,qui vont de la prolifération cellulaire et la différenciation jusqu'au contrôle du temps de floraison. J'ai ensuite étudié les rôles d'AtZRF1 a et AtZRF1 b dans la régulation de la transcription et j'ai constaté que AtZRF1 a et AtZRF1 b ont une fonction similaire a PRC1. Finalement, j'ai étudié les niveaux de H3K4me3, H3K27me3 et H2Aub1 dans la chromatine de certains gènes dont l'expression est perturbée dans les doubles mutants. Les résultats montrent que la déubiquitination de H2Aubi1 n'est pas un événement majeur dans la régulation de la transcription chez Arabidopsis. / Studies in animais show that ZRF1 can read the histone H2AK119ub1 modification in the derepression of polycomb-repressed genes. Two homologs of human ZRF1 have been identified in the Arabidopsis genome, and here in after are named AtZRF1 a and AtZRF1 b. So far, their functional characterization had not been reported. My first objective was to acquire basic knowledge about AtZRF1 a and AtZRF1 b. Both are broadly expressed in Arabidopsis plants and the AtZRF1 b protein is localized in the nucleus and thecytoplasm. Moreover, we found that AtZRF1 b binds H2Aub1 with characteristics similar to those previously reported for the human ZRF1 protein. I subsequently used the powerful genetic tools available in Arabidopsis to investigate the AtZRF1 a and AtZRF1b function. Several independent T-DNA insertion Arabidopsis mutant lines were identified. Because of functional redundancy, single mutants have no obvious developmental defects. I therefore focused on double mutants displaying loss of function of both AtZRF1a and AtZRF1 b. The study of a double mutant revealed important roles for these genes in plant growth and development ranging from cell proliferation and differentiation to flowering time control.I then investigated the roles of AtZRF1 a and AtZRF1 b in gene transcription regulation and found that AtZRF1a and AtZRF1 b function in a way that is partially similar to PRC1 function. Lastly, I investigated H3K4me3, H3K27me3 and H2Aub1 levels in the chromatin regions of some expression-perturbed genes in double mutants. The results show that ZRF1-mediated deubiquitination of H2Aub1 is not a major event in transcription regulation in Arabidopsis.

Mon travail de thèse aborde différents développements physico-chimiques qui reposent sur le principe de transfert d'énergie par résonance de Foster (FRET). Le but est de parvenir à étudier et caractériser des assemblages moléculaires ainsi que des changements structurels de biomo-lécules (ou macro-ions) en phase gazeuse. Le transfert d'énergie par résonance de type Förster est un procédé par lequel de l'énergie s'échange de manière non radiative entre un chromo-phore dit donneur dans un état excité et un second chromophore accepteur en proximité di-recte. Conventionnellement, cette technique permet de localiser et déterminer l'écart entre deux molécules (de l'ordre de 10 à 100nm). Principalement utilisée pour étudier des systèmes biologiques, des résultats marquants ont été obtenus sur l'étude de système tel que l'appareil de Golgi, le cytosquelette ou les membranes cellulaires. Elle n'est cependant appliquée qu'à des systèmes en phase liquide. Il nous a paru intéressant de transposer cette technique en phase gazeuse, en utilisant la capacité des spectromètres de masse à sélectionner, isoler et activer des espèces moléculaires, nous permettant d'obtenir de nouvelles informations structurelles. Une grande partie de ma thèse a consisté à premièrement, valider le concept de FRET en phase gaz puis à développer et optimiser, la technique FRET dit ‘d'action'. L'Action-FRET est une tech-nique d'analyse par couplage de spectrométrie de masse et spectroscopie LASER mise au point par l'équipe Spectrobio afin d'étudier les molecules isolées en phase gazeuse. A travers ce dis-positif, je me suis particulièrement investi à contrôler, étudier et caractériser l'évolution des conformations de biomacromolécules d'intérêt biochimique et biologique. Dans une première partie je ferai une courte introduction générale sur les fondamentaux des protéines, de leur composition et élaboration en entités structurelles complexes, diverses et fonctionnelles. La manière dont les protéines s'arrangent successivement en niveaux structural quaternaire est aussi décrite. La deuxième partie est consacrée à une présentation des chromo-phores utilisés. Je présente ensuite leurs utilisations et détaille la synthèse des édifices molécu-laires produits pour réaliser les expériences de FRET. Ceux-ci sont constitués de composés bio-logiques (peptides ou protéines), couplés aux chromophores, (donneur-accepteur). Dans le contexte de ce chapitre se trouve également une discussion sur les mécanismes et produits uti-lisés lors de l'étape de conjugaison qui permet d'obtenir les composants désirés. En troisième partie vient un chapitre qui relate le fonctionnement des appareils utilisés dans le montage expérimental; le LASER et le spectromètre de masse. La méthode de couplage est dé-crite et spécifiée, détaillant comment les appareils commerciaux ont été modifiés pour interagir avec l'un avec l'autre. Avec ce nouveau montage, un suivi de la signature optique de FRET ap-partenant aux protéines entières greffées et à différents états de charge a été possible. Le quatrième chapitre est dédié dans les premières sections à la théorie et l'état de l'art en ce qui concerne le FRET. Les éléments emblématiques et leurs applications en solution de ces der-nières années et les travaux plus récents en phase gazeuse y sont présentés. Par ailleurs, nous avons voulu démontrer dans ce chapitre que nos diverses manipulations ont l'avantage critique de ne pas dépendre d'une mesure de l'émission de lumière suite au transfert résonant d'éner-gie. A la place, on dispose de la fragmentation spécifique de l'ion piégé du chromophore à tra-vers l'analyse de masse conventionnelle du spectromètre de masse pour détecter et quantifier une manifestation de FRET. Nous démontrerons aussi la possibilité cette méthode appliquée à la biologie moléculaire... [etc] / In this thesis, I discuss the application and development of mass spectrometry (MS) - LASER coupled techniques for the characterization and measurement of trapped biomolecules in the gas phase. In broad terms, this thesis demonstrates the potential and perspectives of action-FRET a novel structural biology tool amenable to the gas phase. The fundamentals rely on a well attested resonance quantic process known as Förster resonance energy transfer (FRET). As of yet it has been a widely utilized method to scrutinize molecular structure in solution. The mo-tivation has been to transpose this occurrence to the instrumental settings of a mass spectrom-eter, its gas confinement and, in doing so, overcome the earlier limitations of the technique and stride into the theoretical and experimental study of well determined systems as well as those whose structure were presently undetermined - all without the influence of the environment of a solvated medium. The first chapter of this thesis offers a general overview on peptides and proteins plus how they can be studied. Subsequent chapters include how the work carried out herein ads towards their study, moving the technique towards a gold standard of native mass spectrometry (native MS). In the second chapter, a treatment of the synthetic steps and preparations is given detailing the mechanistics of the reactions at play and above all outlining the experimental procedures and providing any information on any observations made. The third chapter describes, and is devoted to an introduction of the instrumental setup outlaid as it stands giving an account on the LASER, optical pieces and the mass spectrometer employed throughout the course of this thesis, effectively setting the premises of thought and understand-ing for subsequent chapters and methodology. Chapter four presents energy transfer, in particular to the Foster Resonance Energy Transfer and furthermore outlines the developed technique central to the mass spectrometry method to look at donor-acceptor chromophores espoused to biomolecular systems and their photofrag-ments — what is nicknamed as action-FRET. Chapter five reviews and discusses the study of a macromolecule: Ubiquitin, by action-FRET. The first gas phase experiment on the protein to have ever been realised. The information and content gathered from this adapted experiment is compared to work found elsewhere giving an appraisal on the potential of action-FRET and providing an idea to what future insights the technique could bring. In chapter six the reader is introduced to the project of establishing action-FRET in the negative mode of the mass spectrometer’s ionization source as opposed to its positive mode. Suitable pairs of donor-acceptor chromophores to validate the energy transfer under a negative regime were explored. These where profiled and characterized before being adapted to a biomolecular system. The results provide a different flavor of complimentary structural and conformation information, the first of its kind for negative mode action-FRET. The seventh and final chapter is devoted to future developments. The conclusive work tends to grant a further understanding of neurodegenerative diseases that afflict our societies. Chiefly that of the likes of Alzheimer’s: it’s the mechanism of action pertinent to other neurodegenera-tive pathologies; Parkinson’s, Huntington’s but also prion diseases or amyloid neuropathy. In doing so a contribution is presented on a way to trace a strategy in how to tackle and treat such diseases

Regulation of gene expression occurs at several levels in a cell. While control of transcription is often viewed as the main source of regulation, it is now clear that post-transcriptional processes are essential to fine-tune protein availability. The presence of AU-rich elements (ARE) in the 3’ untranslated region (3’UTR) of many important mRNAs exemplifies one such process. AREs alter the mRNA translation or degradation status by recruiting ARE-binding proteins (ARE-BP). ARE-BPs of the TTP/TIS11 family bind to their cognate ARE-RNAs using their conserved tandem zinc-finger domain and induce rapid decay of their targets. This allows for proper regulation of cell proliferation, cell death and inflammation. In this regard, TTP/TIS11 are main regulators of gene expression, and as such are put under strict transcriptional, post-transcriptional as well as several layers of post-translational control.<p>In this work, we aimed at elucidating the degradation mechanisms affecting TTP/TIS11. Using Drosophila as a model, we found that dTIS11 protein turnover is rapid due to continuous degradation by the proteasome. However, proteasomal recognition did not require ubiquitination of dTIS11 as non-ubiquitinable mutants were efficiently degraded by the proteasome. In addition, dTIS11 was digested by the 20S proteasome that lacks ubiquitin-recognition domains. Our results further indicate that intrinsically disordered regions (IDR) in dTIS11 may be responsible for proteasomal recognition. In fact, dTIS11 is predicted as disordered and possesses the main characteristics of intrinsically disordered proteins (IDP). We also identified dTIS11 N- and C-terminal domains as functional signals for degradation, potentially due to their destructuration. This ubiquitination-independent, disorder-dependent degradation process is conserved throughout evolution as dTIS11 mammalian counterpart, TTP, undergoes the same degradation by default pathway. In addition, we established that phosphorylation prevents degradation of TTP/TIS11 by the proteasome. <p>Together, our results pinpoint a new essential characteristic for TTP/TIS11 that may redefine the identity of these proteins. In addition, we unraveled a novel and conserved mechanism of regulation of TTP/TIS11. This control is essential for cell physiology as defects in this process can lead to defects in the inflammatory response, increased radiation-induced lung toxicity and tumorigenesis.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Plasma membrane transport proteins play a crucial role in all cells by conferring to the cell surface a selective permeability to a wide range of ions and small molecules. The activity of these transporters is often regulated by controlling their amount at the plasma membrane, via intracellular trafficking. The recent boom in the numbers of crystallized transporters shows that many of them that belong to different functional families with little sequence similarity adopt the same structural fold implying a conserved transport mechanism. These proteins belong to the APC (Amino acid-Polyamine-organoCation) superfamily and their fold is typified by the bacterial leucine transporter LeuT. This LeuT fold is characterized by inverted structural repeats of 5 transmembrane domains that harbor the central substrate-binding site and a pseudo-symmetry axis parallel to the membrane. The yeast Saccharomyces cerevisiae possesses about 16 amino acid permeases (yAAPs) that belong to the APC superfamily and that display various substrate specificity ranges and affinities. Topological, mutational analysis and in silico data indicate that yAAPS adopt the LeuT fold.<p><p>In this work we combined computational modeling and yeast genetics to study substrate binding by yAAPs and the endocytosis of these transporters in response to substrate transport. In the first part of this work, we analyzed the selective recognition of arginine by the yeast specific arginine permease, Can1. We constructed three-dimensional models of Can1 using as a template the recently resolved structure of AdiC, the bacterial arginine:agmatine antiporter, which is also a member of the APC superfamily. By comparison of the binding pockets of Can1 and Lyp1, the yeast specific lysine permease, we identified key residues that are involved in the recognition of the main and side chains of arginine. We first showed that the network of interactions of arginine in Can1 is similar to that of AdiC, and that the selective recognition of arginine is mediated by two residues: Asn 176 and Thr 456. Substituting these residues by their corresponding residues in Lyp1 converted Can1 into a specific lysine permease. In the second part of this work, we studied the regulation of two permeases, Can1 and the yeast general amino acid permease, Gap1. In the presence of their substrates, Gap1 and Can1 undergo ubiquitin-dependent endocytosis and targeting to the vacuolar lumen for degradation. We showed that this downregulation is not due to intracellular accumulation of the transported amino acids but to transport catalysis itself. By permease structural modeling, mutagenesis, and kinetic parameter analysis, we showed that Gap1 and Can1 need to switch to an intermediary conformational state and persist a minimal time in this state after binding the substrate to trigger their endocytosis. This down-regulation depends on the Rsp5 ubiquitin ligase and involves the recruitment of arrestin-like adaptors, resulting in the ubiquitylation and endocytosis of the permease.<p><p>Our work shows the importance of the structural analysis of yAAPs to get further insight into the different aspects of their function and regulation. We validate the use of a bacterial APC transporter, AdiC, to construct three-dimensional models of yAAPs that can be used to guide experimental analyses and to provide a molecular framework for data interpretation. Our results contribute to a better understating of the recognition mode of amino acids by their permeases, and the regulation of this transport in response to substrate binding. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished