Degradation of membrane proteins in the vacuole/lysosome is dependent on their prior sorting into the multivesicular body (MVB) pathway. This sorting process involves incorporation of proteins into vesicles that are formed by budding of the limiting membrane of the endosome into the lumen of the organelle. The MVB sorting process on the whole is highly conserved from yeast to human, and depends on the Vps27/Hrs, ESCRT-I, -II, and -III protein complexes functioning sequentially on the endosomal membrane, as well as on additional factors, such as the ubiquitinating enzyme Rsp5/Nedd4. It has now been established that ubiquitin serves as a sorting signal for many cargoes into the MVB pathway. <p>In this thesis work, we provide evidence that Bro1 is not required for protein ubiquitination or early steps of endocytosis, but functions at the late endosome level as an integral component of the MVB pathway. Similarly to its human homologue Alix, Bro1 interacts with components of the ESCRT-I and ESCRT-III complexes. The putative role of Bro1/Alix in bridging an interaction between ESCRT-I and –III might be important to strengthen an association of these protein complexes to allow efficient sorting of cargo proteins. Deficiency in Bro1 results in recycling of the endocytosed Gap1 permease back to the plasma membrane, a process coupled to deubiquitination of the permease. This recycling is a non-classical phenotype for cells impaired in MVB pathway thus suggesting Bro1 to have a particular role in this sorting process. Furthermore, the conserved C-terminal proline-rich domain (PRD) of Bro1 is specifically important for MVB sorting of cargo proteins that are subject to ubiquitination. We show Bro1 (via its PRD) to play a highly important role in recruitment of the deubiquitinating enzyme Doa4 to the endosome. Consistent with this, Bro1 is required for deubiquitination of cargo proteins, a step occurring just before cargo incorporation into the endosomal vesicles, and similarly to Doa4, for ubiquitin recycling. In contrast to previous interpretations, we show that Doa4 has a direct role in sorting of ubiquitinated cargo proteins into the MVB pathway. We propose that Doa4 – via its association to Bro1 - achieves this role by catalyzing deubiquitination of cargo proteins and/or some components of the MVB sorting machinery. We further show Bro1 to interact with the ubiquitin ligase Rsp5, which, in addition to being required for cargo protein ubiquitination at the plasma membrane, apparently contributes to multiple steps of endocytosis and MVB sorting. Also the Bro1-Rsp5 interaction is dependent on the C-terminal PRD region of Bro1. We propose that this interaction is conserved. <p>A role for ubiquitin in regulation of the MVB sorting machinery is emerging: the function of factors recognizing and sorting ubiquitinated cargo proteins in the MVB pathway is suggested to be coupled to their cycling between ubiquitinated and deubiquitinated stages. A growing body of evidence indicates that ubiquitin ligases of the Rsp5/Nedd4 family play a central role in this regulation. We speculate the Bro1/Alix protein, through its ability to simultaneously interact with factors of the MVB sorting machinery and with ubiquitinating and deubiquitinating enzymes to play a central role in the successive rounds of ubiquitination and deubiquitination of specific factors along the MVB pathway. <p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont considérés comme la pathologie neurologique la plus sévère en termes de mortalité et d’infirmité. Ils touchent plus de 140 000 personnes chaque année. L’AVC ischémique, qui représente 80% des AVC, est causé par l’occlusion localisée d’un vaisseau conduisant à un arrêt de l’apport en oxygène et en glucose au cerveau. Il est ainsi responsable de déficits moteurs, sensitifs et cognitifs qui peuvent gravement compromettre l’autonomie et la qualité de vie des patients. Les patients qui ont subi un AVC ischémique développent notamment une atrophie musculaire qui se produit principalement dans le membre parétique, mais aussi dans une moindre mesure dans le membre non parétique. Toutefois, les mécanismes moléculaires à l’origine de cette atrophie musculaire sont méconnus. Dans une première étude, l’objectif a été d’identifier les déterminants moléculaires mis en jeu dans l’atrophie musculaire induite par une ischémie cérébrale. Pour répondre à cet objectif, les travaux ont été menés sur un modèle d'ischémie cérébrale chez la souris qui consiste en l’occlusion de l'artère cérébrale moyenne par un monofilament en nylon. Nous avons montré que l’ischémie cérébrale entraînait, 3 jours après son induction, une atrophie musculaire des muscles quadriceps, soleus et tibialis anterior du côté parétique. Cette atrophie musculaire était associée à des déficits moteurs touchant l’équilibre, la coordination, la force musculaire, la posture ou la marche. Au niveau moléculaire, nous avons reporté un déséquilibre de la balance entre la synthèse et la dégradation des protéines musculaires en faveur d’une augmentation de la dégradation dans les muscles parétique et non parétique des souris ischémiées. Nous avons notamment montré que l’expression de la myostatine, un régulateur négatif majeur de la masse musculaire, était significativement augmentée. Dans une seconde étude, l’objectif a été d’identifier une cible d’intervention thérapeutique pour préserver la masse musculaire suite à une ischémie cérébrale. Au vu des résultats obtenus dans la première étude, nous avons ciblé la myostatine. Nous avons montré que l’inhibition de la myostatine entraînait, une meilleure récupération du poids de corps et du poids de divers muscles, 15 jours après une ischémie cérébrale. De plus, l’inhibition de la myostatine tendait à améliorer le comportement moteur des souris ischémiées (équilibre, coordination, force musculaire). En revanche, nous n’avons reporté aucune variation majeure des niveaux en ARNm ou protéines d’acteurs impliqués dans les voies de signalisation Akt/mTOR, Smad2/3, ubiquitine-protéasome et autophagie-lysosome, 15 jours après une ischémie cérébrale. Ces données préliminaires suggèrent que l’inhibition pharmacologique de la myostatine pourrait représenter une stratégie thérapeutique efficace pour limiter la perte de masse musculaire suite à une ischémie cérébrale / Strokes are considered as the most severe neurological disease in terms of mortality and disability. The incidence of stroke in France is estimated at 140 000. Ischemic stroke, which represents about 80% of strokes occur as a result of an obstruction of a blood vessel supplying blood to the brain. Motor, cognitive and sensory deficits are common impacts of stroke and can seriously compromise the autonomy and patient quality of life. Ischemic stroke leads to muscle atrophy, wich occurs primarily in the paretic limb, but also to a lesser extent in the nonparetic limb. However, the molecular mechanisms of muscle atrophy is unknown. In a first study, the purpose was to identify the molecular determinants involved in skeletal muscle atrophy following cerebral ischemia. To meet this objective, the work was carried out on a mouse model of cerebral ischemia, which involves the occlusion of the middle cerebral artery (MCAO) with a nylon monofilament. We have shown that cerebral ischemia leads to skeletal muscle atrophy of quadriceps, soleus and tibialis anterior muscles of the paretic side, 3 days after MCAO. This muscular atrophy was associated with motor deficits in the balance, coordination, muscle strength, posture and walking. From a molecular point of view, we reported an imbalance between the rates of synthesis and degradation of muscle protein, in favour of protein degradation in both paretic and nonparetic muscles. In particular, we showed that the expression of myostatin, a master negative regulator of skeletal muscle mass was significantly increased. In a second study, the purpose was to identify a target for therapeutic intervention in order to maintain muscle mass following cerebral ischemia. In view of the results obtained in the first study, we targeted the myostatin. Our results show that myostatin inhibition increases body weight and muscle mass recovery, 15 days after cerebral ischemia. In addition, myostatin inhibition tends to improve motor behavior (balance, coordination, strength). From a molecular point of view, we reported no major change in mRNA or protein level of actors involved in Akt/mTOR, Smad2/3, autophagy-lysosome and ubiquitin-proteasome pathways, involved in the control of muscle mass, 15 days after cerebral ischemia. These preliminary results strongly suggest that pharmacological inhibitors of myostatin may provide significant therapeutic benefit for muscle atrophy following cerebral ischemia

La cachexie est un syndrome clinique et métabolique caractérisé par une perte de tissu adipeux et de tissu musculaire, fréquemment observé chez les patients atteints de cancer. La myostatine (Mstn) régule négativement la masse musculaire. Bien que la régulation des mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la masse musculaire joue un rôle central dans la cachexie associée au cancer, les relations existant entre la Mstn et les mécanismes physiopathologiques restent largement inconnues. Suite à l’inoculation de cellules Lewis lung carcinoma (LLC) à des souris, nous avons montré que l’invalidation du gène de la Mstn (souris Mstn-/-) confère une résistance au développement de la cachexie associée au cancer par rapport à des souris sauvages. La déficience en Mstn prévient la perte de masse musculaire et réduit la croissance tumorale, 35 jours après l’injection des cellules LLC, et est associée à un allongement de la durée de vie des souris. L’invalidation du gène de la Mstn provoque aussi une augmentation de l’apoptose des cellules LLC et une diminution de l'expression de gènes impliqués dans la prolifération et le métabolisme tumoraux. L’activation des systèmes protéolytiques ubiquitine-protéasome et autophagie-lysosome, due au développement tumoral, est réduite voire supprimée dans le muscle des souris Mstn-/-. L’accumulation de céramides intramusculaires, un sphingolipide formé suite à une lipolyse exacerbée, est corrélée à la perte de masse musculaire, suggérant que les céramides pourraient être un médiateur cellulaire impliqué dans la cachexie associée au cancer. Ces résultats montrent que la Mstn joue un rôle essentiel dans la cachexie associée au cancer / Cachexia is a complex clinical and metabolic syndrome, whose definition is imprecise, characterized by an uncontrolled loss of adipose tissue and skeletal muscle mass, frequently observed in cancer patients, and leading to death in 25% of cancer patients. Myostatin (Mstn) is a negative regulator of skeletal muscle mass and a critical determinant of skeletal muscle homeostasis. Although the regulation of the molecular mechanisms involved in the control of skeletal muscle mass plays a central role in the pathogenesis of cancer cachexia, the relationships between Mstn and the pathophysiological mechanisms remain largely unknown. Following subcutaneous inoculation of Lewis lung carcinoma cells (LLC) in mice, we showed that the Mstn gene inactivation (Mstn-/- mice) confers resistance to the development of cancer cachexia, compared to wild type mice. Mstn deficiency prevents the loss of skeletal muscle mass and reduces tumor growth, 35 days after the inoculation of LLC cells, and this is associated with a longer life of mice. Mstn gene inactivation also causes an increased apoptosis of LLC cells and decreases expression of genes involved in tumor proliferation and metabolism. Activation of ubiquitin-proteasome and autophagy-lysosome proteolytic systems, triggered by tumor growth is significantly reduced or suppressed in skeletal muscle of Mstn-/- mice. Accumulation of intramuscular ceramides, a sphingolipid synthesized due to excessive lipolysis, is correlated with the loss of muscle mass, suggesting that ceramides may be a cellular mediator involved in the pathogenesis of cancer cachexia. These results show that Mstn plays a critical role in the pathogenesis of cancer cachexia

Le système ubiquitine-protéasome joue un rôle central dans le contrôle de la progression du cycle cellulaire par la dégradation régulée de nombreuses protéines. Dans ce système, Fbw7 (aussi appelée Fbxw7, hCdc4, hAgo, Sel-10), est l'une des protéines F-box qui sert d'adaptateur de substrats pour l'une des plus importantes familles d'ubiquitine ligases : les complexes SCF (Skp1/Cullin/ F-box). Fbw7 assure la dégradation de plusieurs régulateurs positifs du cycle cellulaire : la cycline E, cMyc, c-Jun, Notch, Aurora A, mTOR, MCL1. En conséquence, l'altération des fonctions de Fbw7 conduit à des défauts de prolifération cellulaire, de différenciation et à de l'instabilité génomique. La mutation de Fbw7 dans les cancers entraîne une dérégulation de l'expression périodique cycline E qui n'est alors plus restreinte à la transition G1/S du cycle cellulaire. Nos résultats montrent qu'une isoforme, Fbw7, est exprimée dans les œufs de xénope matures arrêtés en métaphase II mais n'est pas fonctionnelle, expliquant la présence de grande quantité de cycline E dans les œufs à cette phase mitotique. Nous montrons que Fbw7 est maintenue inactive sous forme poly-ubiquitylée suite à sa phosphorylation par une PKC jusqu'à la fin des cycles embryonnaires rapides, au moment où la cycline E est brutalement dégradée. Nous montrons que la régulation négative de Fbw7 par PKC est conservée au cours des cycles cellulaires somatiques des cellules humaines, et contribue à l'expression périodique de la cycline E. Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme critique pour la régulation de Fbw7 au cours du cycle cellulaire et suggèrent que les fonctions de Fbw7 peuvent être altérées par une dérégulation de PKC, un phénomène observé dans de nombreux types de tumeurs humaines. / The ubiquitin-proteasome system plays a central role in the control of cell cycle progression through the regulated degradation of numerous critical proteins. In this process, one key family of ubiquitin ligases are the SCF (Skp1/Cul-1/F-box) complexes, in which F-box-bearing proteins act as substrate-recruiting factors. Fbw7 (also known as Fbxw7, hCdc4, hAgo, Sel-10) is one such F-box protein. It controls the stability and thus the levels of several positive regulators of the cell cycle, including cyclin E, cMyc, c-Jun, Notch, Aurora A, mTOR, Mcl1. As a consequence of its biological roles, alterations of the functions of Fbw7 lead to defects in cellular proliferation, differentiation and genetic instability. As seen in cancers, mutation of Fbw7 leads to deregulation of cyclin E expression, which is no more restricted to the G1-S phase boundary of the cell cycle. Here we report that Fbw7, although expressed in mature Xenopus eggs arrested in metaphase II, is not functional, explaining why cyclin E can be stockpiled in this mitotic-like phase. We found that, in these eggs as well as in early Xenopus embryos, Fbw7 is maintained under a PKC-dependent poly-ubiquitylated state until the end of the early rapid cleavage cycles where cyclin E is abruptly degraded. Importantly, we show that this PKC-dependent negative regulation of Fbw7 is conserved during human somatic cell cycles, resulting into the periodic expression of cyclin E. These findings reveal a novel mechanism critical for the temporal regulation of Fbw7 and suggest that the key functions of Fbw7 can be altered by PKC dysregulation, a mechanism known to occur in many types of human tumours.

HIF1α et HIF2α sont des protéines largement impliquées dans le développement de pathologies posant des problèmes majeurs de santé publique, comme le cancer. Leur activité, qui est régulée prioritairement par leur stabilité via le système ubiquitine-protéasome, coordonne de nombreux processus cellulaires susceptibles de favoriser le développement de ces maladies. Un enjeu récent de la recherche thérapeutique est d’identifier des partenaires protéiques pouvant réguler les protéines HIFα, afin de mettre au point des thérapies ciblées. Les protéines de choc thermique (HSPs) sont une classe de protéines dont une des fonctions essentielles est de réguler l’homéostasie protéique dans la cellule, en interagissant avec le protéasome. Certaines d’entre elles, HSP27 et HSP90, ont la faculté de pouvoir réguler spécifiquement la stabilité de nombreuses protéines souvent elles-mêmes impliquées dans l’apparition de ces pathologies. L’objectif de ce travail était de savoir si ces deux HSPs peuvent contrôler la stabilité de la protéine HIF2α. Nos résultats suggèrent qu’HSP27 pourrait stimuler la dégradation de HIF2α en favorisant son ubiquitination. Ce résultat est surprenant, en raison du rôle connu d’HSP27 dans la progression tumorale. Il est donc nécessaire de le confirmer et d’en préciser les processus biologiques sous-jacents. D’autre part, nos autres résultats semblent confirmer qu’HIF2α est une protéine cliente d’HSP90. De plus, nous montrons pour la première fois que l’inhibition d’HSP90 par le 17-DMAG diminue la production de VEGF dépendante de HIF2α. Des travaux récents suggèrent qu’HIF2α a un rôle prédominant dans la progression tumorale, et peut constituer une cible globale de choix dans plusieurs types de cancer. Il conviendrait d’évaluer la capacité des inhibiteurs d’HSP90 à supprimer des fonctions de HIF2α nouvellement décrites, comme son rôle dans la maintenance des cellules souches cancéreuses. / Both HIF1α and HIF2α proteins are highly involved in the development of pathologies, such as cancers, which are prime public health issues. These proteins are primarily controlled at the protein level by ubiquitin-dependant degradation, and regulate numerous cellular processes which are likely to favor the development of these diseases. A recent issue in therapeutic research is to identify partners that might regulate the expression and the activity of the HIFα proteins, with the aim to elaborate targeted therapies. Heat shock proteins (HSPs) form a family of proteins whose main function is to regulate protein homeostasis in cells, which they achieve through interaction with the ubiquitin-proteasome pathway. HSP27 and HSP90 are able to specifically control the stability of certain client proteins involved in those pathologies. In the present work, we sought to determine whether these HSPs could regulate the expression of the HIF2α protein. Our results suggest that HSP27 may induce ubiquitin and proteasome-dependant degradation of HIF2α, which is quite intriguing given the well-known role of HSP27 in tumor promotion. This needs to be confirmed and the underlying biological significance of such a regulation remains to be defined. Our results also may confirm that HIF2α is an HSP90 client protein. Moreover, we show for the first time that inhibition of HSP90 by 17-DMAG decreases the HIF2α-dependant VEGF production. Recent studies emphasize HIF2α as a major promoter of tumor progression, and suggest that HIF2α may constitute an attractive global target in several cancer types. Therefore, the ability of HSP90 inhibitors to disrupt newly described HIF2α functions, such as cancer stem cell maintenance, should be evaluated.

ITCH est une ligase de l’ubiquitine impliquée dans différents processus cellulaires. Elle contient une région riche en prolines (PRR, proline rich region) qui lui permet de lier le domaine SH3 (Src homology 3) d’Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Plusieurs de ces protéines sont impliquées dans l’endocytose clathrine-dépendante de récepteurs tel le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR, epidermal growth factor receptor). Après activation, l’EGFR est internalisé dans des vésicules enrobées de Clathrine et un complexe protéique formé par CBL, CIN85 et Endophiline participe à cet évènement. ITCH lie l’ubiquitine à CBL et à Endophiline pour vraisemblablement modifier leurs fonctions, ce qui suggère un lien direct entre cette ligase et l’endocytose de l’EGFR. Afin de déterminer le rôle d’ITCH dans ce processus, plusieurs expériences furent réalisées. Premièrement, la modalité de liaison entre la ligase ITCH et les protéines à domaine SH3 a été étudiée en détails. Une série de mutations dans la région PRR d’ITCH nous a aidé à identifier trois résidus arginines (R252, R255, R258) nécessaires pour son interaction avec Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Deuxièmement, des lignées cellulaires HeLa et Cos7 furent modifiées génétiquement par CRISPR pour empêcher l’expression d’ITCH. Ces lignées cellulaires knockout furent caractérisées et utilisées dans un essai d’endocytose de l’EGFR, puis examinées par spectrométrie de masse. L’internalisation d’EGFR fut suivie en microscopie confocale à l’aide d’un ligand EGF fluorescent -/- dans les deux types de cellules ITCH . En absence d’ITCH, nous observons une diminution significative du niveau d’EGF internalisé par rapport aux cellules parentales. La surexpression d’ITCH dans les cellules ITCH-/- rétablit l’internalisation normale de l’EGF, confirmant l’implication d’ITCH dans le processus, mais la surexpression des formes mutantes de ITCH incapable de lier Endophiline ou catalytiquement inactive ne rétablit pas l’internalisation de l’EGF. Ces résultats nous permettent de conclure que l’interaction ITCH-Endophiline et la fonction catalytique de ITCH sont nécessaires pour l’endocytose de l’EGFR. Ensemble, ces deux fonctions de ITCH régulent le trafic endocytique de l’EGFR. De plus, les cellules ITCH-/- montrent un délai de dégradation de l’EGFR phosphorylé ainsi qu’une prolongation du temps d’activation de la kinase MAPK (mitogen-activated protein kinase). Finalement, pour explorer l’influence de l’absence d’ITCH sur ses substrats et partenaires moléculaires nous avons effectué une comparaison protéomique des partenaires d’interaction et des protéines ubiquitylées à partir des lysats cellulaires ITCH-/- et WT. Les résultats ont montré que le manque d’expression de la ligase ITCH altère la présence peptidique des protéines liées à la signalisation de l’EGFR, à la voie protéolytique dépendante de l'ubiquitine et à l’adhésion cellulaire. Cette étude révèle pour une première fois que la protéine ITCH est requise pour l’endocytose dépendante de la Clathrine de l’EGFR. / ITCH is a ubiquitin ligase involved in various cellular processes including endocytosis. It contains a proline rich region (PRR) which allows it to bind the SH3 domain of endophilin and other SH3 domain-containing proteins involved in Clathrin-mediated endocytosis (CME). CME is an important regulatory mechanism for growth factor receptor activity. The epidermal growth factor receptor (EGFR) is actively internalized in Clathrin-coated vesicles after activation. This endocytosis is facilitated by a protein complex formed by CBL, CIN85 and Endophilin. ITCH is known to ubiquitinate both CBL and endophilin, providing a potential functional link between the ligase and receptor internalization. In order to determine the role of ITCH in this process, several experiments were performed. First, the mapping of molecular binding sites between the ligase ITCH and SH3 domain proteins has been studied in detail. A series of mutations in the PRR region of ITCH helped us identify three arginine residues (R252, R255, R258) as necessary for its interaction with endophilin and all the tested SH3-domain containing proteins. Secondly, HeLa and Cos7 cell lines were genetically modified by CRISPR to prevent ITCH expression. These knockout cell lines were characterized for use in an EGFR endocytosis assay and for mass spectrometry analysis. EGFR internalization was monitored by confocal microscopy using fluorescent EGF ligand in both ITCH-/- cell types. In the absence of ITCH, a significant decrease in the level of internalized EGF compared to parental cells is visible. Overexpression of WT ITCH in the knockout cells restores normal internalization of EGF, confirming the involvement of ITCH in the process. Overexpression of Endophilin-binding defective or catalytically inactive ITCH does not restore the internalization of EGF in ITCH-/- cells. These results show that the ITCH- Endophilin interaction as well as the catalytic function of ITCH are necessary for the endocytosis of EGFR. In addition, ITCH-/- cells show a delay in the degradation of phosphorylated EGFR accompanied with an extended period of mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation. In a last set of experiments, we explored the influence of the absence of ITCH on its substrates and molecular partners. We performed a proteomic comparison of ITCH-binding partners and potential substrates using the ITCH-/- and WT cell lysates. The results showed that the lack of ITCH expression alters the peptide count of proteins mainly related to EGFR signaling, theubiquitin-dependent proteolytic pathway and cell adhesion. This study shows for the first time that the protein ITCH is required for the clathrin-dependent endocytosis of EGFR.

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L'homéostasie cellulaire implique une régulation fine de la production ainsi que de l'élimination des protéines. La dérégulation de cette homéostasie entraîne des effets néfastes touchant de nombreuses voies de signalisation et de métabolisme et pouvant conduire à diverses maladies telles que le cancer ou la neurodégénérescence. De ce fait, la dégradation des protéines est un processus hautement contrôlé effectué par le système ubiquitine-protéasome (UPS) qui permet le ciblage, l’étiquetage et la dégradation des protéines mal repliées, endommagées ou en fin de vie. Le protéasome est un complexe multiprotéique vital présent dans toutes les cellules eucaryotes dont la biogenèse, la fonction de dégradation et la régulation dans le cytoplasme sont bien connues. Cependant, la fonction du protéasome dans le noyau, notamment en réponse au stress, est encore peu comprise. Les cellules ont développé de nombreux mécanismes adaptatifs en réponse à la variation de l'apport en nutriments comme l’augmentation de la dégradation et le recyclage des protéines. Chez l’humain, le protéasome est dégradé dans le cytoplasme par autophagie lors d’une privation de nutriments mais les mécanismes de régulation du protéasome nucléaire en réponse au stress métabolique restent peu connus. Nous avons trouvé que le protéasome 26S et la sous-unité régulatrice PSME3 forment des foyers nucléaires dans différents types cellulaires de mammifère en réponse à une privation en nutriments. Les foyers, nommés SIPAN pour Starvation-Induced Proteasome Assemblies in the Nucleus, ne sont colocalisés avec aucune structure ou corps nucléaires connus. La formation des SIPAN est réversible lors d’une réintégration des nutriments, suggérant une réponse spécifique liée à un stress métabolique. La manipulation de la quantité d’acides aminés intracellulaire a révélé que les acides aminés non-essentiels jouent un rôle important dans la formation et la résolution des SIPAN. Une analyse métabolomique a permis de trouver des voies reliées au métabolisme des nucléotides et des acides aminés qui pourraient fournir des facteurs clés pour la dissipation des foyers du protéasome. Le fort dynamisme des SIPAN, la présence d’événements de fusion et leur instabilité vis-à-vis des conditions cellulaires suggèrent que les SIPAN résultent d’une séparation de phase liquide-liquide (LLPS). De plus, nous avons trouvé que l’ubiquitine conjuguée est présente dans les SIPAN et que l’ubiquitination et la déubiquitination semblent être impliquées dans la formation et la résolution, respectivement. Nous avons ensuite découvert que la perte du récepteur à l’ubiquitine RAD23B empêche la formation des SIPAN. En effet, les domaines de liaison au protéasome UBL et de liaison à l’ubiquitine UBA1/UBA2 sont nécessaires pour la formation des SIPAN. De manière intéressante, la perte de RAD23B ou du complexe régulateur PSME3 retarde l’induction de l’apoptose et promeut la survie cellulaire. Enfin, en utilisant un inducteur de l’apoptose, nous avons observé l’apparition de ces foyers du protéasome dans le noyau des cellules dont certaines caractéristiques sont similaires aux SIPAN. Notre étude aborde une question très importante dans la compréhension des rôles et du dynamisme du protéasome nucléaire, en particulier dans l'adaptation au stress, qui peut réguler le niveau des protéines nucléaires. De façon générale, cela nous aidera à mieux comprendre le rôle du protéasome dans l’homéostasie nucléaire et son implication dans les maladies humaines. / Cellular homeostasis involves specific regulation of the production as well as the elimination of proteins. The deregulation of this equilibrium leads to harmful effects affecting many signaling and metabolic pathways and can lead to various diseases, such as cancer or neurodegeneration. Hence, protein degradation is a highly controlled process performed by the ubiquitin-proteasome system (UPS) that allows targeting, labeling and degradation of misfolded, damaged, or end-of-life proteins. The proteasome is a vital multiprotein complex found in all eukaryotic cells whose biogenesis, degradative function, and regulation in the cytoplasm are well known. However, the function of the proteasome in the nucleus, particularly in response to stress, is still poorly understood. Cells have evolved many adaptive mechanisms in response to varying nutrient supply such as increased protein degradation and recycling. In humans, the proteasome is degraded in the cytoplasm by autophagy during nutrient deprivation, but the regulatory mechanisms of the nuclear proteasome in response to metabolic stress remain poorly understood. We have found that the 26S proteasome and regulatory subunit PSME3 form nuclear foci in different mammalian cell types in response to nutrient deprivation. These foci, called SIPAN for Starvation-Induced Proteasome Assemblies in the Nucleus, do not colocalize with any known nuclear structures or bodies. The formation of SIPAN is reversible upon nutrient replenishment, suggesting a specific response to metabolic stress. Manipulation of the intracellular amino acid pool revealed that non-essential amino acids play important roles in the formation and resolution of SIPAN. A metabolomics study has identified pathways related to nucleotide and amino acid metabolism that may provide key factors for the dissipation of the proteasome foci. The strong dynamism of SIPAN, the presence of fusion events and their instability towards cellular conditions suggest that SIPAN result from liquid-liquid phase separation (LLPS). Additionally, we have found that conjugated ubiquitin is present in SIPAN and that ubiquitination and deubiquitination appear to be involved in their formation and resolution, respectively. We then discovered that the depletion of the ubiquitin receptor RAD23B prevents the formation of SIPAN. Indeed, the UBL proteasome binding domain and UBA1/UBA2 ubiquitin binding domains are required for SIPAN formation. Interestingly, the depletion of RAD23B or the proteasome regulatory particle PSME3 delays the induction of apoptosis and promotes cell survival. Finally, we found that an apoptosis-inducing agent promotes proteasome foci formation in the nucleus of cells, and these organelles share similarities with SIPAN. Our study addresses a very important question in understanding the roles and dynamism of the proteasome in the nucleus, specifically during stress adaptation, which can regulate the level of nuclear proteins. In general, this will help us to better understand the role of the proteasome in nuclear homeostasis and its involvement in human diseases.

Au cours de cette thèse, nous avons étudié deux protéines par RMN : la créatine kinase musculaire (CK-MM) et le domaine UIM-SH3 de la protéine STAM2, seuls ou en interaction avec leurs partenaires. La CK-MM est une enzyme active sous forme dimérique. Elle appartient à la famille des guanidino-kinases et intervient dans le processus énergétique de la cellule. Le but de l'étude était d'élucider le mode de fonctionnement de la CK-MM. Pour cela, nous avons enregistré des expériences de relaxation R1, R2 et des expériences de perturbation de déplacement chimique sur la CK-MM libre et complexée avec MgADP et sous forme TSAC. Ces expériences montrent que la boucle 320s, spécifique à la reconnaissance des substrats, possède une dynamique rapide en absence de substrats et une dynamique ralentie en présence de substrats. La fixation des substrats dans les sites actifs de la CK-MM induit des modifications conformationelles importantes. La protéine STAM2 est composée de deux UBDs : VHS, et UIM et d'un domaine SH3 connu pour interagir avec des déubiquitinases UBPY et AMSH. Cette protéine est impliquée dans la voie de dégradation lysosomale. L'objectif de cette étude est la caractérisation du complexe SH3/ubiquitine. Pour cela, nous avons enregistré des expériences de perturbation de déplacement chimique et de relaxation R1, R2 et nOes sur le complexe UIM-SH3/ubiquitine. Ces expériences mettent en évidence que les domaines UIM et SH3 sont capables d'interagir chacun avec une ubiquitine, avec une affinité de l'ordre de la centaine de micromolaire. L'interface entre les UBDs et l'ubiquitine implique majoritairement des résidus hydrophobes et conservés

Le protéasome (CP) contrôle la majorité des fonctions cellulaires par la dégradation des protéines intracellulaires. En plus d’exprimer le CP, les vertébrés expriment également l’immunoprotéasome (IP), caractérisé par des préférences de dégradation distinctes. Le rôle le mieux caractérisé pour l’IP est la génération d’antigènes adaptés pour la liaison au complexe majeur d’histocomptabilité de classe I (CMH-I). Cependant, les nombreux phénotypes observés au niveau de cellules déficientes en IP ou avec une mutation révèlent que l’IP influence des fonctions immunitaires indépendamment de la génération d’antigènes et peut atténuer le stress présent au niveau de cellules non-immunitaires. L’objectif de cette thèse était de caractériser les rôles de l’IP qui ne sont pas reliés à la génération d’antigènes associés au CMH-I. L’analyse du transcriptome de cellules dendritiques IP-déficientes en cours de maturation révèle que l’IP affecte l’expression de plus de 8 000 transcrits. L’IP affecte l’expression génique principalement au niveau transcriptionnel en contrôlant l’abondance de régulateurs de transcriptions tels que NF-κB et les membres des familles IRF et STAT. Les cellules dendritiques IP-déficientes sont également moins efficaces pour activer des lymphocytes T CD8+, même chargées artificiellement avec des quantités optimales d’antigènes associés au CMH-I. En outre, nos études montrent que l’IP est fortement exprimé au niveau de cellules de patients atteints de leucémie myéloïde aigue. L’expression de l’IP est intrinsèque aux leucémies, puisque qu’elle n’est pas corrélée à la présence de lymphocytes sécréteurs d’IFN-γ. De plus, l’expression d’IP est particulièrement élevée au niveau de leucémies monocytaires et/ou possédant un réarrangement MLL. Notamment, des analyses de corrélation montrent que l’IP est connecté à des gènes impliqués dans le métabolisme, l’activité mitochondriale et la réponse au stress. En effet l’inhibition de la sous-unité PSMB8 de l’IP mène à l’accumulation de protéines ubiquitinées et la mort de cellules leucémiques monocytaires. Globalement, nos travaux montrent que le rôle de l’IP n’est pas limité à la génération d’antigènes, mais qu’il peut contrôler l’expression génique et la survie des leucémies. / By regulating protein degradation, constitutive proteasomes (CP) control practically all cellular functions. In addition to CP, vertebrates express immunoproteasomes (IP), which display distinct substrate preferences. The first non-redundant role ascribed to IP is its enhanced ability to generate MHC I-associated antigens. However, deletion or inhibition of IP subunits can affect several immune cell functions independently of MHC-I antigen generation. Moreover, recent work has shown that IP can be expressed in non-immune cells to deal with cell stress. Thus, we wished to investigate the roles of IP that are not related to antigen generation and that are not redundant with the CP. Based on profiling of WT and IP-deficient maturing mouse dendritic cells (DCs), we report that IP regulate the expression of more than 8,000 transcripts. The broad impact of IP on gene expression is cell-autonomous, mediated mainly at the transcriptional level, and involves major signaling pathways including IRFs, NF-kB and STATs. Moreover, even when engineered to present optimal amounts of antigenic peptides, IP-deficient DCs are inefficient for in vivo T-cell priming. In addition, consistent with the fact that cancer cells endure proteotoxic stress, we report that acute myeloid leukemia (AML) cells from patients express high levels of IP genes. Expression of IP genes in AML is a cell-autonomous and IFN-independent feature that correlates with the methylation status of IP genes, and is particularly high in AML with a monocytic phenotype and/or MLL rearrangement. Notably, IP inhibition leads to accumulation of polyubiquitinated proteins and cell death in IPhigh but not IPlow AML cells. Co-clustering analysis reveals that genes correlated with IP subunits in monocytic AMLs are primarily implicated in cell metabolism and proliferation, mitochondrial activity and stress responses. Overall, our studies show that the role of IP is not limited to antigen processing and reveals major non-redundant roles for IP in transcription regulation and resistance to cell stress in AML.