Les mutations héréditaires dans le gène BRCA2 sont associées à une forte susceptibilité au développement du cancer du sein et de l’ovaire. La protéine suppresseur de tumeur BRCA2 est essentielle pour préserver l’intégrité des chromosomes après endommagement de l’ADN. BRCA2 est impliquée dans la recombinaison homologue (RH), une voie fiable de réparation des cassures de l’ADN. BRCA2 exerce aussi un rôle pendant la mitose afin d’assurer un point de contrôle et une division cellulaire correcte. Bien que le rôle de BRCA2 dans la RH soit bien établi, la littérature décrive une restauration partielle de la fonction de RH dans des cellules ne possédant pas le site de liaison à l’ADN en C-terminal (CT-DBD), ce que nous a encouragé à voir s’il existait un domaine secondaire de liaison à l'ADN. L'analyse in silico a révélé un domaine zf-PARP putatif dans la région N-terminale. Normalement, ce type de domaine s’associe à l’ADN, ce que nous a porté à l’examiner. En utilisant des fragments purifiés de la partie N-terminale comprenant le site putatif dans des analyses de changements de mobilité électrophorétique, nous avons montré une activité de liaison à l’ADN. En comparaison avec le CT-DBD canonique, le site de liaison à l’ADN en N-terminal (NT-DBD) manifeste une affinité plus forte pour divers substrats et contrairement du CT-DBD il est capable de s’associer à l’ADN à double brin. En utilisant des tests d’échange de brin, nous avons également montré que le NT-DBD peut stimuler la fonction de recombinaison de RAD51. De plus, des variantes faux-sens dans le NT-DBD trouvé chez les patients atteints de cancer du sein ont montré une activité réduite d’association à l’ADN et une stimulation diminuée de l’activité de RAD51 ce qui implique que ces amino-acides sont importants pour les deux fonctions. Ce travail révèle un nouveau sitede liaison à l’ADN, ce qui contrairement au CT-DBD est capable de s’associer à l’ADN double-bras(db) et stimuler l’activité de recombinaison de RAD51. Nous proposons que le NT-DBD positionne RAD51 à la jonction entre ADNdb et ADNsb, ce qui facilite le chargement de RAD51 sur l’ADN recouvert de RPA. Cette activité pourrait promouvoir la RH pendant la réparation des cassures de l’ADN (von Nicolai, C et al., 2016, under revision).Afin de définir la prévalence des mutations de NT-DBD pour la prédisposition au cancer, nous avons sélectionné des variants faux-sens non-classifiés (variants of unknown clinical significance), identifiés dans des familles à risque élevé de développer un cancer du sein. Nous avons effectué des tests afin d’étudier l’impact de ces variants sur la fonction de BRCA2 dans la RH et la mitose. Certains de ces variants ont conduit à une hypersensibilité aux agents endommageant l’ADN et aux inhibiteurs de PARP, caractéristique d’une RH défectueuse alors qu’un de ces variants était compétent pour la réparation. Tous les variants ont induit une duplication normale des centrosomes, mais la cytokinèse était défectueuse. Ce phénotype suggère un défaut dans la formation du midbody et de l’abscission. Cette étude aidera à classifier les VUS dans le NT-DBD et facilitera la consultation génétique pour des individus. BRCA2 est un médiateur de la RH dépendante de RAD51. Son homologue méiotique, DMC1, partage structure et fonction similaire et s’associe à BRCA2. Néanmoins, la pertinence fonctionnelle de cette interaction reste élusive. Nous avons montré que BRCA2 interagit avec DMC1 au travers des répétitions BRC et promeut la formation de molécules d'adhérence. Cet effet stimulant est dû au renforcement de la liaison de DMC1 à l’ADN. BRCA2 complet et fonctionnel était surtout capable de stimuler l’activité d’échange de brin de DMC1, ce qui confirme les résultats obtenus avec les répétitions BRC. Nos résultats identifient BRCA2 comme une protéine de médiation de la recombinaison méiotique et renforcent le rôle des répetitions BRC dans cette fonction (Martinez, von Nicolai, et al., PNAS, 2016). / Germline mutations in the BRCA2 gene lead to high susceptibility to the development of breast and ovarian cancer. The tumor suppressor protein BRCA2 is essential for preserving chromosome integrity after DNA damage emerging from endogenous or exogenous sources. BRCA2 functions in Homologous Recombination (HR), the most reliable pathway to repair DNA double strand breaks. BRCA2 exerts its tumor suppressor role also at several stages during mitosis where it ensures checkpoint control and proper cell division.Although the function of BRCA2 in HR is well established, evidence from the literature describing a partial restoration of HR function in cells lacking the C-terminal DNA binding domain (CT-DBD) brought us to test the hypothesis of a secondary DNA binding domain in BRCA2.In silico analysis of the protein revealed a putative zinc finger-PARP domain in exon 10 of the N-terminal region. This type of domain usually binds DNA which prompted us to examine this activity in vitro. Using purified N-terminal fragments comprising the putative DNA binding domain in electrophoresis mobility shift assay we demonstrated the DNA binding activity of the N-terminus of BRCA2. When compared to the canonical CT-DBD, the N-terminal DNA binding domain (NT-DBD) exhibits stronger affinity for various DNA substrates and unlike the CT-DBD, it can also associate with dsDNA. Using a DNA strand exchange assay we also showed that the NT-DBD stimulates the recombination function of RAD51. In addition, BRCA2 missense variants in the NT-DBD found in breast cancer patients showed reduced dsDNA binding and decreased stimulation of RAD51 recombination activity on dsDNA/ssDNA containing substrates, implying that these residues are important for both functions. This work revealed a novel DNA binding domain in the N-terminus of BRCA2 that, in contrast to the CT-DBD, can associate with dsDNA and promote RAD51 recombination activity. We propose that the NT-DBD positions RAD51 at the ssDNA/dsDNA junction facilitating RAD51 loading onto the RPA-coated ssDNA. This activity may promote HR in DSB repair and in daughter strand gap repair (von Nicolai, C et al., 2016 submitted).To define the relevance of NT DBD on cancer predisposition, we selected several missense variants of unknown clinical significance (VUS) found in families at high risk to develop breast cancer located in this region. We used in vitro and in vivo functional assays to study the impact of the mutations on BRCA2 function in HR and mitosis. Some of the variants exhibited hypersensitivity to DNA damaging agents and PARP inhibitors, a hallmark of defective HR while one variant was proficient in repair. All variants showed normal centrosome duplication, but exhibited delayed or failed cytokinesis. This phenotype suggests a defect of the variants in midbody formation and abscission as a consequence of impaired BRCA2 function. It remains to be established if the defects in HR and cytokinesis are related. In the future, this study will help to classify VUS in the NT-DBD and facilitate genetic counselling of individuals carrying these mutations.BRCA2 is a mediator protein in RAD51-dependent HR. Its meiotic counterpart, DMC1, shares similar structure and function and binds BRCA2. However, the functional relevance of this interaction remained elusive. In this work, we showed that through the BRC repeats, BRCA2 interacts with DMC1 and promotes joint molecule formation. This stimulatory effect is due to the enhancement of DMC1 assembly on ssDNA. Importantly, full-length BRCA2 also stimulated the DNA strand exchange activity of DMC1, confirming the results with the isolated BRC repeats. Our results identify BRCA2 as a mediator of meiotic recombination and underline the role of the BRC repeats on this function (Martinez, von Nicolai, et al., 2016, PNAS).

Le syndrome de Lynch est une affection héréditaire autosomique dominante due à des mutations constitutionnelles des gènes du système de réparation de l'ADN (MLH1, MSH2 et MSH6). Depuis 20 ans le réseau français des laboratoires impliqués dans le syndrome de Lynch a identifié un total de 6687 variants. Sept cent sept d'entre eux, essentiellement des variants faux sens, restent encore des variants de signification inconnue (VSI), sans utilité pour le conseil génétique. Le but de notre étude était de développer un algorithme permettant de classer les variants de signification inconnue. Les critères utilisés étaient les données des analyses in silico, phénotypiques (ségrégation, critères d'Amsterdam), l'état de la fonction MMR (MisMatch Repair) dans les cellules tumorales, les tests fonctionnels et d'épissage, ainsi que les données publiées. Cet algorithme a été appliqué à l'ensemble des VSI de la base de données française et nous a permis de caractériser 370 variants . Les données ont été intégrées dans la base de données française UMD des gènes MMR afin d'être disponibles pour la communauté scientifique. Grace aux données collectées par le réseau, nous avons également pu caractériser le phénotype du syndrome de Lynch. Nous avons ainsi confirmé que le cancer du sein ne fait pas partie du spectre du syndrome de Lynch et que les formes de ce syndrome associées à une mutation du gène EPCAM n'entrainent qu'un risque très faible de cancers de l'endomètre, permettant ainsi d'adapter les recommandations de suivi dans cette situation.de l'endomètre, permettant ainsi d'adapter les recommandations de suivi dans cette situation. / Lynch syndrome is a frequent cancer predisposition with an autosomal dominant mode of inheritance and caused by heterozygous germ line mutations in one of the major DNA mismatch repair (MMR) genes (MLH1, MSH2 and MSH6). For 20 years, the French laboratories network involved in Lynch syndrome identified a total of 6687 variations. Among them, 707, mainly missense variations, remained variants of uncertain significance (VUS), thus could not be used for reliable genetic counseling. The aim of our study was to develop an algorithm able to classify VUS, according to the international consensus (IARC). This algorithm was constructed based on criteria usually required for genetic characterization such as in silico analysis, phenotypical data (segregation, Amsterdam criteria's), MMR status in tumor cells, functional assays, splicing analyses and published data. Data were registered in the French database. As a result of this work, we were able to classify 370 variants of the 707 (52,3%). As part of this work, we also analyzed phenotypical data of patients with Lynch syndrome and showed that breast cancer can definitively be excluded from the spectrum of Lynch-related cancers, and that EPCAM mutations, which may lead to Lynch syndrome, are associated with a very low incidence of endometrial cancer and have probably to be considered as an allelic disease with specific clinical recommendations.