O presente trabalho apresenta o estudo físico-químico da interação de lipossomas miméticos de plaquetas humanas (LM) com a urease de jack bean (JBU), bem como a interação com o surfactante Triton X-100. Realizou-se, também, um estudo físico-químico preliminar de LM com gangliosídeos (GG) em sua composição e a interação com a JBU e com o Triton X-100. Os LM foram preparados pelo método de evaporação em fase reversa. A interação da JBU e do Triton X-100 com os LM foi analisada pelas técnicas de Microscopia Óptica de Luz Polarizada (POM), Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS), Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS) e Velocimetria de Espalhamento de Luz (PZ). O estudo da interação de LM com a JBU revelou uma significativa mudança nas dimensões dos LM, que se mostrou mais pronunciada com uma maior concentração de JBU. Os dados de SAXS revelaram mudanças estruturais na membrana lipossômica, indicando que a JBU aumenta a distância de repetição lamelar, enquanto que o Triton X-100 diminui. Observou-se, também, uma mudança no potencial elétrico superficial dos LM na presença do JBU e do Triton X-100. Os LM com GG apresentaram um perfil de SAXS característico de lipossomas unilamerales, diferentemente dos LM sem GG, indicando que os GG foram incorporados na membrana. Os dados de SAXS sugerem que a JBU esteja interagindo com GG dos LM e não com a membrana lipossômica. / This work presents the physical-chemical study of platelets mimetic liposomes (LM) interaction with jack bean urease (JBU), as well as interaction with the surfactant Triton X-100. The preliminary physical-chemical study was carried out with LM content gangliosides (GG) in its composition and its interaction with JBU and Triton X-100. The LM were prepared by reverse phase evaporation. The interaction of JBU and Triton X-100 with LM was analyzed by Polarized Optical Microscopy (POM), Dynamic Light Scattering (DLS), Small Angle X-ray Scattering (SAXS) and Velocimetry Light Scattering (PZ). The study of the interaction of LM with JBU revealed a significant change in the LM dimensions, which was more pronounced with a higher concentration of JBU. The SAXS data indicate structural changes in the liposome membrane, indicating that the JBU cause an increase in the lamellar repeat distance, while the Triton X-100 decreases. The surface electric potential changed in the presence of JBU and Triton X-100 in the LM. The LM with GG showed a SAXS profile characteristic of unilamerales liposomes, unlike of LM without GG, indicating that the GG were incorporated into the membrane. The SAXS data suggest that JBU interacts with GG of the LM.

Helicobacter pylori é uma bactéria Gram negativa que coloniza o epitélio gástrico humano. É considerada um fator de risco associado a úlceras gástricas e duodenais assim como câncer gástrico, através de mecanismos ainda não completamente esclarecidos. Estudos recentes mostram a existência de uma correlação entre a infecção por H. pylori e doenças cardiovasculares, através da ativação de células pró-inflamatórias. A urease de H. pylori (HPU) é considerada um fator de virulência, visto que sua atividade catalítica cria um microambiente, de pH mais elevado, possibilitando a sobrevivência do patógeno no estômago. A HPU é capaz de ativar plaquetas de coelho através da indução da secreção de seus grânulos densos e liberação de ADP, culminando na agregação plaquetária. Esse fenômeno ocorre com ativação da via da 12-lipoxigenase, via esta também utilizada pelo colágeno, um importante agonista intrínseco desse sistema. Nesse trabalho demostramos que a subunidade UreA, com doses até 10 vezes maior que a HPU, não é capaz de agregar plaquetas de coelho, ao passo que reduz a agregação induzida por colágeno e ADP de forma dose dependente. Já a subunidade UreB induz agregação plaquetária de forma semelhante a HPU e ao colágeno, sugerindo que pode ser o dominio da HPU responsável por induzir agregação plaquetária. Da mesma forma que a UreA, a UreB reduz a agregação plaquetária induzida por colágeno e ADP. Verificamos também a participação da glicoproteína VI (GPVI), importante receptor de colágeno na plaqueta, sendo que quando há o bloqueio desse receptor a HPU não é capaz de agregar plaquetas. Nossos resultados sugerem que a agregação plaquetária por HPU compartilha pelo menos parte da rota de agregação com o colágeno. A GPVI parece estar envolvida na ativação de plaquetas por HPU. Essa propriedade farmacológica recém-descrita da HPU reforça a hipótese que essa proteína possa estar envolvida nas patologias indiretamente causadas por H. pylori.

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas, dependentes de níquel, produzidas por plantas, fungos, bactérias e invertebrados, que catalisam a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmetros formados por seis subunidades idênticas, e, em bactérias, são formadas por duas a três subunidades distintas. A presença de dois íons de níquel no sítio ativo das ureases é essencial para sua atividade catalítica. Em bactérias, ureases atuam como fatores de virulência em infecções do trato urinário e gastrointestinal. Em plantas, ureases são encontradas principalmente nas sementes, mas estão distribuídas em todos os tecidos. A soja produz duas isoenzimas: a urease embrião-específica, sintetizada no embrião, e a urease ubíqua, presente em todos os tecidos da planta, em menor quantidade que a embrião-especifica. Em estudos prévios realizados pelo grupo foram identificadas proteínas de plastídios que co-imunoprecipitaram associadas à urease, o que despertou o interesse em estudar a presença de ureases na organela. Nesse trabalho, estabeleceu-se o protocolo para purificação e enriquecimento de cloroplastos de folhas de soja para investigar a provável presença de ureases na organela. Ensaios de atividade enzimática, ELISA e cromatografia de troca iônica foram realizados com o extrato obtido de cloroplastos após o processo de extração e purificação e indicaram a presença de ureases nestes plastídeos. Na tentativa de identificar-se as isoformas de ureases presentes no cloroplasto, realizou-se ensaios de espectrometria de massas, porém não se obteve sucesso devido a quantidade da enzima presente no extrato. O aprimoramento do processo de enriquecimento de cloroplastos possibilitará prosseguir nos estudos para identificar as isoformas presentes na organela, bem como detectar sua localização nestas organelas. / Ureases (urea amido-hydrolases; EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes, produced by plants, fungi, bacteria and invertebrates, that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by two or three identical subunits, while in bacterias are formed by two to three different subunits. The catalytic activity of urease is due to the presence of two nickel ions in its active site. Bacterial ureases are known virulence factors in urinary and gastrointestinal tracts. In plants urease are mainly found in the seeds, but are widely distributed in all tissues. Soybean produces two isoenzymes: embryo-specific urease is synthesized in the embryo during development and ubiquitous urease is present in all plant tissues, in a smaller amount compared to embryo-specific. Previous studies have shown that many plastid proteins co-immunoprecipitate with urease, which sparked interest in studying the presence of ureases in the organelle. In this study, we established the protocol for purification and enrichment of soybean leaves chloroplasts in order to investigate the presence of urease in the organelle. Enzymatic activity, ELISA and ion exchange chromatography assays were conducted with the organelle and indicated the presence of ureases. In an effort to identify which ureases isoforms were present in the chloroplast, we performed mass spectrometry analysis. This effort was unsuccessful due to small amount of enzyme obtained from the extract. Improving the enrichment process will enable further studies regarding the identification of the urease isoforms as their location in the plastid.

Aquaporinas, também conhecidas como Major Intrinsic Proteins (MIPs), são proteínas de membrana distribuídas em todos os domínios da vida, responsáveis pelo transporte de água e pequenos solutos. Em plantas superiores, essa família é particularmente diversa e pode ser classificada em cinco subfamílias: proteínas intrínsecas de membrana plasmática, proteínas intrínsecas de tonoplasto, proteínas intrínsecas do tipo nodulina-26, proteínas intrínsecas pequenas e proteínas intrínsecas X. Esses canais apresentam uma estrutura bastante conservada, exibindo, no centro do poro, duas regiões importantes para a seletividade: os motivos NPA e o filtro seletivo. No presente trabalho, sessenta e seis genes de aquaporinas foram identificados no genoma da soja e classificados por homologia de sequência nas cinco subfamílias estabelecidas. As estruturas tridimensionais das MIPs de soja foram determinadas por modelagem comparativa e o raio dos poros e os resíduos importantes para a especificidade foram identificados. Ensaios funcionais utilizando expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae foram realizados para quatro aquaporinas, GmTIP1;9, GmTIP2;5, GmTIP3;2 e GmNIP2;2, demonstrando que esses genes codificam canais funcionais capazes de transportar água, peróxido de hidrogênio e ureia. A ureia possui um papel muito importante na agricultura por ser o fertilizante nitrogenado mais utilizado mundialmente. A identificação de transportadores de ureia em plantas ainda é recente e, além de um transportador específico, somente as aquaporinas estão relacionadas ao transporte de ureia em plantas. Apesar disso, a relevância fisiológica desse transporte pelas MIPs é ainda motivo de debate. Empregando uma abordagem baseada em PCR quantitativo, foi demonstrado que os níveis de expressão de GmTIP1;9, GmTIP3;2 e GmNIP2;2, mas não de GmTIP2;5, são alterados em raízes de soja cultivada em solução nutritiva contendo ureia como a única fonte de nitrogênio. Além disso, os níveis dos transcritos de GmNIP2;2 são aumentados na parte aérea das plantas, indicando o possível envolvimento dessa aquaporina na redistribuição de ureia nos tecidos. Outros genes de aquaporinas de soja também apresentaram maior expressão nessas condições. Esses resultados sugerem o envolvimento de aquaporinas no metabolismo de ureia em plantas e apontam essas proteínas como potenciais alvos para manipulação genética visando o aumento da eficiência do uso de nitrogênio em sistemas adubados com ureia e a melhoria da produção agrícola. / Aquaporins, also known as Major Intrinsic Proteins (MIPs), are membrane proteins distributed in all kingdoms of life, responsible for water and small solutes transport. In higher plants, this family is particularly diverse and can be classified into five subfamilies: plasma membrane intrinsic proteins (PIPs), tonoplast intrinsic proteins (TIPs), nodulin-26-like intrinsic proteins (NIPs), small basic intrinsic proteins (SIPs) and X intrinsic proteins (XIPs). These channels present a highly conserved structure, displaying, in the center of the pore, two regions important for selectivity: the NPA motifs and the selective filter. In the present work, sixty-six aquaporin genes were identified in soybean genome and classified by sequence homology into the five established subfamilies. The three-dimensional structure of soybean MIPs was determined by homology modeling and the pore radius and residues influencing substrate specificity were identified. Functional assays using heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae were performed for four aquaporins, GmTIP1;9, GmTIP2;5, GmTIP3;2 and GmNIP2;2, indicating that these genes codify functional channels capable of transporting water, hydrogen peroxide and urea. Urea plays an important role in agriculture because it is the most used nitrogen fertilizer worldwide. Plant urea transporters are just beginning to be identified and, to date, besides a specific transporter, only aquaporins are linked to urea transport in plants. Nevertheless, the physiological relevance of this transport is still in debate. Using a quantitative PCR approach, we have shown that the expression levels of three urea transporting MIPs, GmTIP1;9, GmTIP3;2 and GmNIP2;2, but not GmTIP2;5, are altered in soybean roots when urea is the sole nitrogen source. Moreover, transcript levels of GmNIP2;2 were also up-regulated in shoots, indicating the possible involvement of this aquaporin in urea redistribution to other plant tissues. Several other soybean aquaporin genes were up-regulated in this condition as well. Taken together, these results suggest the involvement of aquaporins in urea metabolism in plants and place these proteins as potential targets for plant manipulation to improve urea based nitrogen use efficiency and crop production.

Urease (EC 3.5.1.5) é uma metaloenzima dependente de níquel que catalisa a hidrólise da ureia à amônia e dióxido de carbono. A Soja (Glycine max) produz duas isoformas de urease: a urease ubíqua (uSBU) e a urease embrião-específica (eSBU). Nosso grupo demonstrou que eSBU apresenta propriedades biológicas independentes da sua atividade ureolítica, como ativação de plaquetas, atividade inseticida e inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos, estes últimos sugestivos de envolvimento das SBUs em mecanismos de defesa da planta. Outras ureases também estudadas pelo nosso grupo, são as de Feijão-de-porco (Canavalia ensiformis). O Feijão-de-porco produz três isoformas de urease: Canatoxina, JBU e JBURE-II, que também apresentam atividades biológicas, não relacionadas à sua atividade enzimática. Dentre elas, a atividade inseticida tem sido a mais estudada. A toxicidade das ureases a insetos envolve a liberação de um peptídeo interno tóxico, mediante à hidrólise por enzimas digestivas do inseto. Um peptídeo equivalente foi clonado em Escherichia coli e denominado Jaburetox. Este peptídeo apresenta um amplo espectro de ação contra insetos e toxicidade contra fungos. Nossos objetivos nessa tese foram estudar: 1) as propriedades biológicas da urease ubíqua de soja, fusionada à Glutationa S-Transferase (GST-uSBU), e 2) as propriedades estruturais do peptídeo Jaburetox. No capítulo 1 mostramos que a GST-uSBU é tóxica contra fungos filamentosos, interferindo no metabolismo secundário fúngico e na produção de pigmentos, e também foi tóxica a leveduras, induzindo mudanças morfológicas. A proteína de fusão apresentou ainda atividade inseticida e induziu agregação de plaquetas de coelho e de hemócitos de insetos. Os dados sugerem que GST-uSBU serve de modelo para o estudos futuros de propriedades biológicas de ureases de plantas. No captítulo 2, o peptídeo Jaburetox foi estabilizado em sua forma monomérica, com a utilização do agente redutor TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina). O Jaburetox apresentou elevado raio hidrodinâmico, característico de uma proteína intrinsicamente desordenada. Estes dados foram confirmados através de análises de Dicroísmo Circular, de preditores de desordem (PONDR) e por Ressonância Magnética Nuclear. A estrutura do peptídeo em solução foi elucidada, apresentando um motivo α-hélice na região N-terminal e duas estruturas do tipo volta, uma na região central e outra próxima da região C-terminal do peptídeo. O conhecimento da estrutura tridimensional do peptídeo será de grande importância para o entendimento do mecanismo de ação inseticida e fungitóxico do Jaburetox. / Urease (EC 3.5.1.5) is a nickel-dependent metalloenzyme that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Soybean (Glycine max) produces two urease isoforms: ubiquitous urease (uSBU) and the embryo-specific urease (eSBU). Our group demonstrated that eSBU displays biological properties independent of its ureolytic activity, such as platelets activation, insecticidal activity and inhibition of phytopathogenic fungi growth. These data suggested that soybean ureases could be involved in plant defense. Other ureases also studied by our group are jack bean (Canavalia ensiformis) ureases. Jack bean produces three isoforms of ureases, Canatoxin, JBU and JBURE-II, which also have biological properties unrelated to enzymatic activity. Among them, the insecticidal activity has been the most studied. The toxicity of ureases against insects involves hydrolysis by insect digestive enzymes and the release of a toxic internal peptide. An equivalent peptide was cloned in Escherichia coli and called Jaburetox. This peptide presents a broad spectrum of activity against insects and is also fungitoxic. In this thesis, our objectives were to study: 1) the biological properties of the soybean ubiquitous urease fused to Glutathione S- Transferase (GST-uSBU), and 2) the structural properties of the peptide Jaburetox. In chapter 1, we show that GST-uSBU is toxic against filamentous fungi, interfering on the fungal secondary metabolism, in the pigments production, and also affected yeasts, inducing morphological changes. GST-uSBU also displayed insecticidal activity and induced aggregation of rabbit platelets and insect hemocytes. Thus, this fusion protein could serve as model for future studies related to biological properties on plant ureases. In chapter 2, the peptide Jaburetox was stabilized in its monomeric form by using the reducing agent TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine). Jaburetox showed a large hydrodynamic radius, which is characteristic of an intrinsically disordered protein. These data were confirmed by Circular Dichroism analysis, disorder predictors (PONDR) and Nuclear Magnetic Resonance. The structure of the peptide in solution was elucidated, showing a α-helix motif in the N-terminal region and two turn-like structures, one located in the central region and another near the C-terminal of the peptide. The knowledge of Jaburetox’s three-dimensional structure is an important step towards the understanding of its insectidal and fungitoxic mode of action.

O presente trabalho apresenta o estudo físico-químico da interação de lipossomas miméticos de plaquetas humanas (LM) com a urease de jack bean (JBU), bem como a interação com o surfactante Triton X-100. Realizou-se, também, um estudo físico-químico preliminar de LM com gangliosídeos (GG) em sua composição e a interação com a JBU e com o Triton X-100. Os LM foram preparados pelo método de evaporação em fase reversa. A interação da JBU e do Triton X-100 com os LM foi analisada pelas técnicas de Microscopia Óptica de Luz Polarizada (POM), Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS), Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS) e Velocimetria de Espalhamento de Luz (PZ). O estudo da interação de LM com a JBU revelou uma significativa mudança nas dimensões dos LM, que se mostrou mais pronunciada com uma maior concentração de JBU. Os dados de SAXS revelaram mudanças estruturais na membrana lipossômica, indicando que a JBU aumenta a distância de repetição lamelar, enquanto que o Triton X-100 diminui. Observou-se, também, uma mudança no potencial elétrico superficial dos LM na presença do JBU e do Triton X-100. Os LM com GG apresentaram um perfil de SAXS característico de lipossomas unilamerales, diferentemente dos LM sem GG, indicando que os GG foram incorporados na membrana. Os dados de SAXS sugerem que a JBU esteja interagindo com GG dos LM e não com a membrana lipossômica. / This work presents the physical-chemical study of platelets mimetic liposomes (LM) interaction with jack bean urease (JBU), as well as interaction with the surfactant Triton X-100. The preliminary physical-chemical study was carried out with LM content gangliosides (GG) in its composition and its interaction with JBU and Triton X-100. The LM were prepared by reverse phase evaporation. The interaction of JBU and Triton X-100 with LM was analyzed by Polarized Optical Microscopy (POM), Dynamic Light Scattering (DLS), Small Angle X-ray Scattering (SAXS) and Velocimetry Light Scattering (PZ). The study of the interaction of LM with JBU revealed a significant change in the LM dimensions, which was more pronounced with a higher concentration of JBU. The SAXS data indicate structural changes in the liposome membrane, indicating that the JBU cause an increase in the lamellar repeat distance, while the Triton X-100 decreases. The surface electric potential changed in the presence of JBU and Triton X-100 in the LM. The LM with GG showed a SAXS profile characteristic of unilamerales liposomes, unlike of LM without GG, indicating that the GG were incorporated into the membrane. The SAXS data suggest that JBU interacts with GG of the LM.

Urease (EC 3.5.1.5) é uma metaloenzima dependente de níquel que catalisa a hidrólise da ureia à amônia e dióxido de carbono. A Soja (Glycine max) produz duas isoformas de urease: a urease ubíqua (uSBU) e a urease embrião-específica (eSBU). Nosso grupo demonstrou que eSBU apresenta propriedades biológicas independentes da sua atividade ureolítica, como ativação de plaquetas, atividade inseticida e inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos, estes últimos sugestivos de envolvimento das SBUs em mecanismos de defesa da planta. Outras ureases também estudadas pelo nosso grupo, são as de Feijão-de-porco (Canavalia ensiformis). O Feijão-de-porco produz três isoformas de urease: Canatoxina, JBU e JBURE-II, que também apresentam atividades biológicas, não relacionadas à sua atividade enzimática. Dentre elas, a atividade inseticida tem sido a mais estudada. A toxicidade das ureases a insetos envolve a liberação de um peptídeo interno tóxico, mediante à hidrólise por enzimas digestivas do inseto. Um peptídeo equivalente foi clonado em Escherichia coli e denominado Jaburetox. Este peptídeo apresenta um amplo espectro de ação contra insetos e toxicidade contra fungos. Nossos objetivos nessa tese foram estudar: 1) as propriedades biológicas da urease ubíqua de soja, fusionada à Glutationa S-Transferase (GST-uSBU), e 2) as propriedades estruturais do peptídeo Jaburetox. No capítulo 1 mostramos que a GST-uSBU é tóxica contra fungos filamentosos, interferindo no metabolismo secundário fúngico e na produção de pigmentos, e também foi tóxica a leveduras, induzindo mudanças morfológicas. A proteína de fusão apresentou ainda atividade inseticida e induziu agregação de plaquetas de coelho e de hemócitos de insetos. Os dados sugerem que GST-uSBU serve de modelo para o estudos futuros de propriedades biológicas de ureases de plantas. No captítulo 2, o peptídeo Jaburetox foi estabilizado em sua forma monomérica, com a utilização do agente redutor TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina). O Jaburetox apresentou elevado raio hidrodinâmico, característico de uma proteína intrinsicamente desordenada. Estes dados foram confirmados através de análises de Dicroísmo Circular, de preditores de desordem (PONDR) e por Ressonância Magnética Nuclear. A estrutura do peptídeo em solução foi elucidada, apresentando um motivo α-hélice na região N-terminal e duas estruturas do tipo volta, uma na região central e outra próxima da região C-terminal do peptídeo. O conhecimento da estrutura tridimensional do peptídeo será de grande importância para o entendimento do mecanismo de ação inseticida e fungitóxico do Jaburetox. / Urease (EC 3.5.1.5) is a nickel-dependent metalloenzyme that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Soybean (Glycine max) produces two urease isoforms: ubiquitous urease (uSBU) and the embryo-specific urease (eSBU). Our group demonstrated that eSBU displays biological properties independent of its ureolytic activity, such as platelets activation, insecticidal activity and inhibition of phytopathogenic fungi growth. These data suggested that soybean ureases could be involved in plant defense. Other ureases also studied by our group are jack bean (Canavalia ensiformis) ureases. Jack bean produces three isoforms of ureases, Canatoxin, JBU and JBURE-II, which also have biological properties unrelated to enzymatic activity. Among them, the insecticidal activity has been the most studied. The toxicity of ureases against insects involves hydrolysis by insect digestive enzymes and the release of a toxic internal peptide. An equivalent peptide was cloned in Escherichia coli and called Jaburetox. This peptide presents a broad spectrum of activity against insects and is also fungitoxic. In this thesis, our objectives were to study: 1) the biological properties of the soybean ubiquitous urease fused to Glutathione S- Transferase (GST-uSBU), and 2) the structural properties of the peptide Jaburetox. In chapter 1, we show that GST-uSBU is toxic against filamentous fungi, interfering on the fungal secondary metabolism, in the pigments production, and also affected yeasts, inducing morphological changes. GST-uSBU also displayed insecticidal activity and induced aggregation of rabbit platelets and insect hemocytes. Thus, this fusion protein could serve as model for future studies related to biological properties on plant ureases. In chapter 2, the peptide Jaburetox was stabilized in its monomeric form by using the reducing agent TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine). Jaburetox showed a large hydrodynamic radius, which is characteristic of an intrinsically disordered protein. These data were confirmed by Circular Dichroism analysis, disorder predictors (PONDR) and Nuclear Magnetic Resonance. The structure of the peptide in solution was elucidated, showing a α-helix motif in the N-terminal region and two turn-like structures, one located in the central region and another near the C-terminal of the peptide. The knowledge of Jaburetox’s three-dimensional structure is an important step towards the understanding of its insectidal and fungitoxic mode of action.

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas, dependentes de níquel, produzidas por plantas, fungos, bactérias e invertebrados, que catalisam a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmetros formados por seis subunidades idênticas, e, em bactérias, são formadas por duas a três subunidades distintas. A presença de dois íons de níquel no sítio ativo das ureases é essencial para sua atividade catalítica. Em bactérias, ureases atuam como fatores de virulência em infecções do trato urinário e gastrointestinal. Em plantas, ureases são encontradas principalmente nas sementes, mas estão distribuídas em todos os tecidos. A soja produz duas isoenzimas: a urease embrião-específica, sintetizada no embrião, e a urease ubíqua, presente em todos os tecidos da planta, em menor quantidade que a embrião-especifica. Em estudos prévios realizados pelo grupo foram identificadas proteínas de plastídios que co-imunoprecipitaram associadas à urease, o que despertou o interesse em estudar a presença de ureases na organela. Nesse trabalho, estabeleceu-se o protocolo para purificação e enriquecimento de cloroplastos de folhas de soja para investigar a provável presença de ureases na organela. Ensaios de atividade enzimática, ELISA e cromatografia de troca iônica foram realizados com o extrato obtido de cloroplastos após o processo de extração e purificação e indicaram a presença de ureases nestes plastídeos. Na tentativa de identificar-se as isoformas de ureases presentes no cloroplasto, realizou-se ensaios de espectrometria de massas, porém não se obteve sucesso devido a quantidade da enzima presente no extrato. O aprimoramento do processo de enriquecimento de cloroplastos possibilitará prosseguir nos estudos para identificar as isoformas presentes na organela, bem como detectar sua localização nestas organelas. / Ureases (urea amido-hydrolases; EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes, produced by plants, fungi, bacteria and invertebrates, that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by two or three identical subunits, while in bacterias are formed by two to three different subunits. The catalytic activity of urease is due to the presence of two nickel ions in its active site. Bacterial ureases are known virulence factors in urinary and gastrointestinal tracts. In plants urease are mainly found in the seeds, but are widely distributed in all tissues. Soybean produces two isoenzymes: embryo-specific urease is synthesized in the embryo during development and ubiquitous urease is present in all plant tissues, in a smaller amount compared to embryo-specific. Previous studies have shown that many plastid proteins co-immunoprecipitate with urease, which sparked interest in studying the presence of ureases in the organelle. In this study, we established the protocol for purification and enrichment of soybean leaves chloroplasts in order to investigate the presence of urease in the organelle. Enzymatic activity, ELISA and ion exchange chromatography assays were conducted with the organelle and indicated the presence of ureases. In an effort to identify which ureases isoforms were present in the chloroplast, we performed mass spectrometry analysis. This effort was unsuccessful due to small amount of enzyme obtained from the extract. Improving the enrichment process will enable further studies regarding the identification of the urease isoforms as their location in the plastid.

Aquaporinas, também conhecidas como Major Intrinsic Proteins (MIPs), são proteínas de membrana distribuídas em todos os domínios da vida, responsáveis pelo transporte de água e pequenos solutos. Em plantas superiores, essa família é particularmente diversa e pode ser classificada em cinco subfamílias: proteínas intrínsecas de membrana plasmática, proteínas intrínsecas de tonoplasto, proteínas intrínsecas do tipo nodulina-26, proteínas intrínsecas pequenas e proteínas intrínsecas X. Esses canais apresentam uma estrutura bastante conservada, exibindo, no centro do poro, duas regiões importantes para a seletividade: os motivos NPA e o filtro seletivo. No presente trabalho, sessenta e seis genes de aquaporinas foram identificados no genoma da soja e classificados por homologia de sequência nas cinco subfamílias estabelecidas. As estruturas tridimensionais das MIPs de soja foram determinadas por modelagem comparativa e o raio dos poros e os resíduos importantes para a especificidade foram identificados. Ensaios funcionais utilizando expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae foram realizados para quatro aquaporinas, GmTIP1;9, GmTIP2;5, GmTIP3;2 e GmNIP2;2, demonstrando que esses genes codificam canais funcionais capazes de transportar água, peróxido de hidrogênio e ureia. A ureia possui um papel muito importante na agricultura por ser o fertilizante nitrogenado mais utilizado mundialmente. A identificação de transportadores de ureia em plantas ainda é recente e, além de um transportador específico, somente as aquaporinas estão relacionadas ao transporte de ureia em plantas. Apesar disso, a relevância fisiológica desse transporte pelas MIPs é ainda motivo de debate. Empregando uma abordagem baseada em PCR quantitativo, foi demonstrado que os níveis de expressão de GmTIP1;9, GmTIP3;2 e GmNIP2;2, mas não de GmTIP2;5, são alterados em raízes de soja cultivada em solução nutritiva contendo ureia como a única fonte de nitrogênio. Além disso, os níveis dos transcritos de GmNIP2;2 são aumentados na parte aérea das plantas, indicando o possível envolvimento dessa aquaporina na redistribuição de ureia nos tecidos. Outros genes de aquaporinas de soja também apresentaram maior expressão nessas condições. Esses resultados sugerem o envolvimento de aquaporinas no metabolismo de ureia em plantas e apontam essas proteínas como potenciais alvos para manipulação genética visando o aumento da eficiência do uso de nitrogênio em sistemas adubados com ureia e a melhoria da produção agrícola. / Aquaporins, also known as Major Intrinsic Proteins (MIPs), are membrane proteins distributed in all kingdoms of life, responsible for water and small solutes transport. In higher plants, this family is particularly diverse and can be classified into five subfamilies: plasma membrane intrinsic proteins (PIPs), tonoplast intrinsic proteins (TIPs), nodulin-26-like intrinsic proteins (NIPs), small basic intrinsic proteins (SIPs) and X intrinsic proteins (XIPs). These channels present a highly conserved structure, displaying, in the center of the pore, two regions important for selectivity: the NPA motifs and the selective filter. In the present work, sixty-six aquaporin genes were identified in soybean genome and classified by sequence homology into the five established subfamilies. The three-dimensional structure of soybean MIPs was determined by homology modeling and the pore radius and residues influencing substrate specificity were identified. Functional assays using heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae were performed for four aquaporins, GmTIP1;9, GmTIP2;5, GmTIP3;2 and GmNIP2;2, indicating that these genes codify functional channels capable of transporting water, hydrogen peroxide and urea. Urea plays an important role in agriculture because it is the most used nitrogen fertilizer worldwide. Plant urea transporters are just beginning to be identified and, to date, besides a specific transporter, only aquaporins are linked to urea transport in plants. Nevertheless, the physiological relevance of this transport is still in debate. Using a quantitative PCR approach, we have shown that the expression levels of three urea transporting MIPs, GmTIP1;9, GmTIP3;2 and GmNIP2;2, but not GmTIP2;5, are altered in soybean roots when urea is the sole nitrogen source. Moreover, transcript levels of GmNIP2;2 were also up-regulated in shoots, indicating the possible involvement of this aquaporin in urea redistribution to other plant tissues. Several other soybean aquaporin genes were up-regulated in this condition as well. Taken together, these results suggest the involvement of aquaporins in urea metabolism in plants and place these proteins as potential targets for plant manipulation to improve urea based nitrogen use efficiency and crop production.

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas distribuídas em plantas, fungos e bactérias. As duas isoformas de ureases de Canavalia ensiformis (canatoxina - CNTX e urease do feijão de porco - JBU) são altamente tóxicas para insetos de diferentes ordens. A toxicidade dessas proteínas é dependente da liberação de um fragmento de cerca de 10 kDa a partir da proteína nativa. Essa liberação se dá por ação das enzimas digestivas cisteínicas e aspárticas (tipo catepsina B e D) presentes no trato digestivo de algumas ordens de insetos. Ureases não são tóxicas para insetos com digestão baseada em enzimas serínicas (tipo tripsina). Esse peptídeo de 10 kDa foi isolado e caracterizado, recebendo o nome de Pepcanatox. Um peptídeo recombinante, equivalente ao Pepcanatox, foi expresso em Escherichia coli e chamado Jaburetox 2Ec. Jaburetox 2Ec é tóxico, por via oral, para ninfas de Dysdercus peruvianus e, por injeção toráxica, para ninfas de Rhodnius prolixus e ninfas e adultos de Triatoma infestans. CNTX e JBU, dados por via oral, são tóxicos para ninfas de D. peruvianus e R. prolixus, mas não são tóxicas para as formas adultas desses insetos.O processamento de CNTX e JBU por enzimas de ninfas e adultos de D. peruvianus mostraram um perfil distinto, podendo ser esse diferencial o responsável pela falta de efeito tóxico observado em adultos. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. A purificação parcial das enzimas de C. maculatus por gel-filtração resultou em uma fração (Pico B) capaz de liberar um peptídeo de aproximadamente 10 kDa a partir de CNTX e JBU. A atividade proteolítica do Pico B é completamente inibida por Pep-A e parcialmente inibida por E-64, indicando a presença de aspártico (majoritária) e cisteíno proteases. Observamos que tanto E-64 (inibidor de cisteíno proteinases) quanto Pepstatina-A (inibidor de aspártico proteinases) diminuem a formação do peptídeo entomotóxico pelo Pico B, sugerindo que cisteíno e aspártico proteases estão envolvidas nesse processo.O mecanismo de ação em insetos das ureases, assim como dos peptídeos derivados, ainda não é conhecido. Um efeito observado in vivo é a diminuição da taxa de perda de peso de R. prolixus após a alimentação com ureases, indicando uma possível alteração no sistema excretório. Para avaliar o efeito das ureases e de Jaburetox 2Ec na secreção de R. prolixus, realizamos ensaios de secreção de fluídos pelos túbulos de Malpighi isolados, assim como ensaios de contrações dos intestinos anterior e posterior e vaso dorsal. JBU e Jaburetox 2Ec inibem a secreção de fluídos por túbulos de Malpighi isolados, de maneira dose dependente. CNTX também tem efeito antidiurético, enquando a urease de Helicobacter pylori (HPU) não causa nenhuma alteração na secreção dos túbulos de Malpighi. Jaburetox 2Ec, mas não JBU, causa um aumento dos níveis de GMPc nos túbulos sendo esse o segundo mensageiro de sua ação.Metabólitos de eicosanóides e cálcio (intra e extracelular) influenciam a ação de JBU, mas não de Jaburetox 2Ec. Ensaios de potencial transepitelial realizados com túbulos de Malpighi indicaram que Jaburetox 2Ec, mas não JBU, alteram a ação de uma H+-ATPase presente na membrana dos túbulos, causando um desequilíbrio no transporte iônico e, como consequência, alteração na secreção de fluídos. Os dados obtidos não mostram que JBU e Jaburetox 2Ec desencadeiam rotas distintas nos túbulos de Malpighi, ambos culminando em antidiurese. Assim como nos túbulos de Malpighi, JBU diminui o transporte de fluídos pelo epitélio do estômago de R. prolixus. Jaburetox 2Ec e JBU causam um aumento na frequência de contrações do estômago estimuladas por serotonina. No intestino posterior, observamos que JBU também causa um aumento na frequência e amplitude das contrações, e mudança no tônus basal do tecido. No vaso dorsal, nenhuma alteração significativa nas contrações foram observadas. Também avaliamos por microscopia o efeito da alimentação com JBU na liberação de serotonina, hormônio envolvido em diversos processos fisiológicos. Não observamos nenhuma alteração significativa na liberação desse hormônio a partir das células do sistema nervoso, assim como nos órgãos controlados por serotonina. A liberação de fragmento(s) entomotóxico(s) a partir de ureases vegetais, assim como o mecanismo de ação dessas ureases e fragmentos, são processosbastante complexos. Nessa tese tivemos êxito em caracterizar várias etapas desses processos, esclarecendo pontos chaves e levantando evidências para guiar trabalhos futuros. / Ureases (E.C. 3.5.1.5) are metalloenzymes widespread in plants, fungi and bacteria. Two isoforms of Canavalia ensiformis urease, (canatoxin - CNTX and jack bean urease – JBU), are toxic to insects from different orders. The toxicity of these proteins is due to the release of a 10 kDa peptide from the native protein. This release is due to the action of acidic digestive enzymes present in the insect digestive tract. Ureases are not toxic to insects with digestion relying on trypsin-like enzymes. The entomotoxic peptide, called Pepcanatox, was isolated and characterized and a recombinant peptide, equivalent to Pepcanatox was expressed in Escherichia coli. Jaburetox 2Ec, the recombinant peptide, is toxic by oral route to nymphs of Dysdercus peruvianus and by injection to nymphs of Rhodnius prolixus and nymphs and adults of Triatoma infestans. CNTX and JBU, administered by oral route, are toxic to nymphs of D. peruvianus and R. prolixus, but are innocuous to adults of these insects. Proteolytic processing of JBU and CNTX by digestive enzymes from D. peruvianus nymphs and adults showed a distinct profile. This differential processing could be related to the lack of toxic effect of the proteins in adults.Using Callosobruchus maculatus as a model, the digestive enzymes involved in urease’s processing were investigated. The partial purification of C. maculatus enzymes resulted in a protein fraction (Pool B) capable of releasing a 10kDa peptide from JBU and CNTX. The proteolytic activity of Pool B was completely abolished by Pep-A and partially inhibited by E-64, indicating the presence of aspartic (majoritary) and cysteine proteinases. Both E-64 and Pep-A decrease the formation of the entomotoxic peptide, suggesting that both classes of enzymes may be involved in this process. The purification of the enzymes present on Pool B will clarify the role of each of these enzymes on urease processing and release of the entomotoxic peptide. The mechanisms of action of ureases as well as urease-derived peptides in insects is still poorly characterized. A lower rate of weight loss in R. prolixus fed on a urease-containing meal was observed in vivo, indicating a possible alteration on theexcretory system. To evaluate the effect of ureases and Jaburetox 2Ec on R. prolixus excretion, we performed fluid secretion assays on isolated Malpighian tubules, as well as fore- and hindgut contractions assays. JBU and Jaburetox 2Ec inhibit Malpighian tubules fluid secretion in a dose dependent fashion. CNTX is also antidiuretic, while Helicobacter pylori urease (HPU) does not alter the secretion rate. Jaburetox 2Ec, but not JBU, increases tubules levels of cGMP. No changes in AMPc was seen with either polypeptide. Eicosanoid metabolites and calcium (intra- and extracellular) modulate the antidiuretic effect of JBU, but not that of Jaburetox 2Ec. Measurements of the transepithelial potential in Malpighian tubules indicated that Jaburetox 2Ec, but not JBU, disrupts the activity of a H+-ATPase present on tubules’ membranes, causing changes in fluid secretion due to an imbalance of ions transport. The data obtained show that JBU and Jaburetox 2Ec are acting on Malpighian tubules through different pathways, both leading to antidiuresis. As seen in Malpighian tubules, JBU also decrease the fluid transport across the crop epithelium of R. prolixus. Jaburetox 2Ec and JBU cause an increase of the frequency of crop contractions stimulated with serotonin. In the hindgut, JBU increases the frequency and amplitude of contractions, and alters the muscle basal tonus. In the dorsal vessel, no significant alterations were observed. Using microscopy, we also evaluated the effect of JBU feeding in the release of serotonin, a hormone involved in several physiological processes. There is no alteration in the release of this hormone from nervous system cells, as well as in tissues regulated by serotonin. All these data indicate that JBU and its derived peptide cause major alterations of post feeding physiological process in R. prolixus that contribute to, or can be the cause of the entomotoxic effect. The release of entomotoxic fragment(s) from plant ureases and their mechanism of action are complex processes. Here, we were successful in characterizing several steps of these processes, clarifying crucial points and providing leads for future work in this field.