Urease, uma enzima encontrada em diversas espécies de plantas, catalisa a hidrólise de uréia, formando amônia e dióxido de carbono. Esta enzima é encontrada também em bactérias, fungos e alguns invertebrados e apresenta três domínios: alfa, beta e gama. Em Canavalia ensiformis, foram descritas mais de uma isoforma de urease: a urease clássica JBU (Jack bean urease - cDNA e proteína), o cDNA jbure-II e a proteína canatoxina. A sequência jbure-II, obtida previamente, codificava uma proteína hipotética incompleta nos domínios alfa e gama (correspondentes as regiões terminais 5´ e 3´ do cDNA). Neste trabalho, demonstramos a clonagem de um cDNA denominado jbure-IIB, que codifica uma proteína predita com os domínios completos. Análises filogenéticas e modelagem molecular da proteína predita foram realizadas. A estrutura proposta para a proteína hipotética JBURE-IIB possui uma forma similar às das ureases bacterianas, exceto pela presença de duas regiões de ligação, que conectam os três domínios das ureases, ausentes nas ureases bacterianas. Todos os resíduos críticos para a atividade ureásica foram detectados. Em seguida, o cDNA completo de jbure-IIB foi obtido através de sobreposição dos fragmentos clonados (5’, interno e 3’), utilizando uma técnica de “PCR overlap” modificada. O cDNA foi clonado no vetor pET101, a proteína heteróloga foi produzida em Escherichia coli e sua presença confirmada por análises de Western blot. A atividade da urease recombinante foi observada em placas das colônias transformadas induzidas, na presença de uréia e níquel. A proteína canatoxina apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos. Sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) pelas catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Baseado na seqüência N-terminal e tamanho de pepcanatox, projetamos oligonucleotideos para amplificar um fragmento de 270 pb, usando o cDNA jbure-II como molde. Este fragmento, denominado jaburetox-2 (“Jack bean urease toxin 2”) foi clonado em vetor pET101 e expresso em E. coli. O peptídeo recombinante foi denominado jaburetox-2Ec (“Jack bean urease toxin 2” expresso em células de E. coli, contendo uma metionina inicial e acrescido, na região Cxiii terminal, do epitopo V-5 e seis resíduos de Histidina). Sua atividade inseticida foi testada contra ninfas de Dysdercus peruvianus e larvas de Spodoptera frugiperda, obtendo-se 100% de mortalidade. Em seguida, cultivou-se a bactéria recombinante em biorreatores para obtenção de grandes quantidades de peptídeo, que foi purificado e testado contra Rhodnius prolixus (4º instars) e Triatoma infestans (5º instars e adultos). A injeção de jaburetox-2Ec (1 μg/mg de peso vivo do inseto) resultou em 100% de mortalidade. Em contraste, altas doses do peptídeo foram inócuas quando injetadas ou ingeridas por ratos neonatos e camundongos. Corroborando com estes resultados, a modelagem molecular “ab initio” de jaburetox-2Ec revelou um motivo de “grampo beta” consistente com atividade inseticida, possivelmente baseada em neurotoxicidade ou alteração de permeabilidade celular. Adicionalmente, plantas de tabaco foram transformadas com o vetor pCAMBIA contendo o fragmento de cDNA jaburetox-2 (acrescido de um códon de iniciação e um códon de terminação da tradução) e as plantas transformadas, PCR positivas, foram testadas contra S. frugiperda. Realizou-se alimentação direta com as folhas de tabaco e observaram-se diferentes níveis de mortalidade (50-100%), provocadas por diferentes plantas, após 15-30 dias. O conjunto de dados desta tese demonstra o potencial uso de jaburetox-2 como um transgene para construção de plantas resistentes a insetos e contribui para elucidação do mecanismo de ação da atividade inseticida de ureases, bem como seu possível papel na defesa da planta. / Urease, an ubiquitous enzyme in plants, catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Urease is also found in bacteria, fungi and some invertebrates. In Canavalia ensiformis there are more than one isoform of urease: the classic JBU (the major isoform), JBURE-II and the protein Canatoxin. In a previous study, a partial sequence of jbure-II was obtained that putatively codify for an enzyme incomplete at the alfa and gamma domains. In this work, we report the cloning of a cDNA named jbure-IIB, encoding a complete urease protein with the expected 90 kDa size. Phylogenetic studies of the urease sequence and the molecular modeling of the putative protein are also presented. Its modeled structure has an overall shape similar to that of related bacterial ureases except for the presence of two linking regions that connect the three domains of ureases. All critical residues for urease activity are present. The complete cDNA was obtained by overlapping the three parts of cloned cDNA (5’, middle part and 3’) using a modified PCR overlap technique. The cDNA was cloned into PET101 vector and the heterologous protein was produced in Escherichia coli cells and confirmed by Western blot analyses. The activity of the recombinant urease was observed in a urea segregation agar containing urea and nickel. Canatoxin displays insecticidal activity against different insect species. The entomotoxicity relies on an internal 10 kDa peptide (pepcanatox), released by hydrolysis of Canatoxin by cathepsins in the digestive system of susceptible insects. Here, based on the N-terminal sequence of pepcanatox, we designed primers to amplify by PCR a 270-bp fragment corresponding to pepcanatox using jbure-II cDNA as a template. This amplicon named jaburetox-2 (“jack bean urease toxin 2”) was cloned into pET101 vector and expressed in E. coli. The recombinant peptide was named jaburetox-2Ec and its insecticidal effect was demonstrated against Dysdercus peruvianus and Spodoptera frugiperda larvaes, in which it induced 100% mortality. Bacterial cultivation in bioreactors was carried out with lactose as inducer to obtain large amounts of recombinant peptide. It was tested against Rhodnius prolixus (4th instars) and Triatoma infestans (5th instars and xv adults) by injection and 1 μg/mg insect body weight resulted in 100% mortality. In contrast, high doses of jaburetox-2Ec were innocuous when injected or ingested by mice and neonate rats. Modeling of jaburetox-2Ec, and comparison with other peptide structures, revealed a prominent β-hairpin motif consistent with an insecticidal activity based on either neurotoxicity or alteration of cell permeability. Finally, tobacco plants were transformed with pCAMBIA vector containing the jaburetox-2 fragment (with a start and a stop codon) and the transformed plants were tested against S. frugiperda. Mortality varying from 50-100% of the insects feeding on different transformed plants was observed after 15-30 days. Our results showed the potential use of jaburetox-2 as transgene to engineering insect resistance into plant and contribute to elucidation of mechanisms of action of urease insecticidal activity, as well as its possible role in plant defense.

Ureases são enzimas altamente homólogas, encontradas em plantas, bactérias e fungos. A urease de feijão de porco, Canavalia ensiformis, foi a primeira enzima a ser cristalizada e também a primeira cuja presença de níquel foi demonstrada. Canatoxina, uma isoforma da urease de C. ensiformis, apresenta diversas atividades biológicas, além de sua atividade ureolítica: 1) atividade inseticida; 2) efeito secretagogo e pró-agregante em plaquetas de coelho; 3) ligação a glicoconjugados que contém ácido siálico; 4) atividade pró-inflamatória. Esses efeitos são independentes de sua atividade hidrolítica sobre a uréia, e envolvem ativação do metabolismo de eicosanóides e canais de cálcio. Outras ureases compartilham algumas atividades biológicas da canatoxina, como indução de agregação plaquetária por ureases de vegetais e de Bacillus pasteurii, e efeito inseticida, uma propriedade só encontrada para as ureases de plantas. Ureases microbianas contribuem para a patogênese de cálculos urinários, pielonefrites, incrustação de cateter, úlcera péptica e, possivelmente, tumores gástricos. Helicobacter pylori, uma bactéria Gram-negativa que coloniza a mucosa gástrica, causa úlcera péptica e carcinoma gástrico distal por um mecanismo ainda não completamente elucidado até o momento. Neste trabalho ureases de bactérias são estudadas, objetivando investigar se elas apresentam alguns dos efeitos biológicos descritos para a canatoxina. Foi demonstrado que as ureases recombinante de H. pylori e nativa de B. pasteurii induzem agregação de plaquetas de coelho por um mecanismo, similar ao da canatoxina, mediado por eicosanóides derivados da via da lipoxigenase. Os efeitos pró-inflamatórios da urease de H. pylori são também similares ao apresentado pela canatoxina e mediados pelo mesmo mecanismo de sinalização. Esses resultados contribuem para o entendimento da fisiopatologia de distúrbios causados por organismos produtores de urease. / Ureases are highly homologous enzymes found in plants, bacteria and fungi. Urease of the jackbean, Canavalia ensiformis, was the first enzyme ever crystallized and also the first enzyme shown to contain nickel. Canatoxin, an isoform of C. ensiformis urease, presents several other biological effects besides its ureolytic property: 1) insecticidal effect; 2) pro-aggregating activity in rabbit platelets; 3) binding to sialic acid-containing glycoconjugates; 4) pro-inflammatory activity. These effects are independent of urea hydrolysis and require activation of the eicosanoid metabolism and calcium channels. Other ureases have some of biological activities described for canatoxin, such as induction of platelet aggregation by jackbean and soybean ureases, and also Bacillus pasteurii urease, while insecticidal effects were seen only for plant-derived ureases. Microbial ureases play a role in the pathogenesis of urinary stones, pyelonephritis, urinary catheter incrustation, peptic ulceration and possibly in gastric tumors. Helicobacter pylori, a Gram-negative bacterium that colonizes the human stomach mucosa, causes gastric ulcers and cancer through a mechanism not yet fully elucidated. In this work we studied bacterial ureases to find out if they present some of the biological properties described for canatoxin. We demonstrate that a recombinant Helicobacter pylori urease and a native Bacillus pasteurii urease induce aggregation of rabbit platelets by a mechanism similar to that recruited by canatoxin, involving mediation by lipoxygenase-derived eicosanoids. H. pylori urease also induces pro-inflammatory effects similar to those presented by canatoxin and are mediated by the same signalling pathway. These findings may contribute to the enlightening of physiopathology of diseases promoted by ureaseproducing bacteria.

Helicobacter pylori é uma bactéria Gram negativa que coloniza o epitélio gástrico humano. É considerada um fator de risco associado a úlceras gástricas e duodenais assim como câncer gástrico, através de mecanismos ainda não completamente esclarecidos. Estudos recentes mostram a existência de uma correlação entre a infecção por H. pylori e doenças cardiovasculares, através da ativação de células pró-inflamatórias. A urease de H. pylori (HPU) é considerada um fator de virulência, visto que sua atividade catalítica cria um microambiente, de pH mais elevado, possibilitando a sobrevivência do patógeno no estômago. A HPU é capaz de ativar plaquetas de coelho através da indução da secreção de seus grânulos densos e liberação de ADP, culminando na agregação plaquetária. Esse fenômeno ocorre com ativação da via da 12-lipoxigenase, via esta também utilizada pelo colágeno, um importante agonista intrínseco desse sistema. Nesse trabalho demostramos que a subunidade UreA, com doses até 10 vezes maior que a HPU, não é capaz de agregar plaquetas de coelho, ao passo que reduz a agregação induzida por colágeno e ADP de forma dose dependente. Já a subunidade UreB induz agregação plaquetária de forma semelhante a HPU e ao colágeno, sugerindo que pode ser o dominio da HPU responsável por induzir agregação plaquetária. Da mesma forma que a UreA, a UreB reduz a agregação plaquetária induzida por colágeno e ADP. Verificamos também a participação da glicoproteína VI (GPVI), importante receptor de colágeno na plaqueta, sendo que quando há o bloqueio desse receptor a HPU não é capaz de agregar plaquetas. Nossos resultados sugerem que a agregação plaquetária por HPU compartilha pelo menos parte da rota de agregação com o colágeno. A GPVI parece estar envolvida na ativação de plaquetas por HPU. Essa propriedade farmacológica recém-descrita da HPU reforça a hipótese que essa proteína possa estar envolvida nas patologias indiretamente causadas por H. pylori.

Ureases são metaloenzimas dependentes de níquel, amplamente distribuída em bactérias, fungos e plantas. Estas enzimas atuam na catálise da hidrólise da ureia a amônia e dióxido de carbono. Proteus mirabilis é uma bactéria patogênica, produtora de urease, um de seus mais importantes fatores de virulência. Esta bactéria Gram-negativa se comporta como um uropatógeno oportunista responsável por severas infecções em pacientes hospitalizados. A amônia liberada pela hidrólise da ureia catalisada pela urease de Proteus mirabilis (PMU) causa um aumento no pH levando à formação de microclima, possibilitando a colonização do patógeno no trato urinário do hospedeiro. A PMU apresenta alta similaridade com outras ureases, como a urease de sementes de “Jack bean” (JBU) e a urease de Helicobacter pylori (HPU), para as quais nosso grupo descreveu diversas atividades biológicas que são independentes da hidrólise de ureia. Neste trabalho, nós produzimos PMU, e logo depois investigamos se esta, assim como a JBU e a HPU, apresenta atividades não relacionadas à atividade enzimática. As condições de cultivo para expressão da PMU expressa em Escherichia coli HB101 foram otimizadas pela metodologia de superfície de resposta. Concentrações de níquel, ureia e tempos de indução foram testados. A purificação da enzima recombinante foi obtida em 3 etapas cromatográficas. A primeira, uma HiTrapQTM HP (pH 7,5) onde a urease foi eluida com 400 mMol.L-1 de KCl. O pico das frações eluídas foram reunidas, dialisadas e aplicadas na coluna HiLoad 26/10 Q-SepharoseTM HP, usando o mesmo tampão e sal para eluição. As frações ativas foram novamente reunidas e a PMU foi submetida a cromatografia de gel filtração (Superdex 200TM 26/60-pg). A PMU apresenta estabilidade na faixa de pH 7,0 a 8,5, com seu pH ótimo estimado em 8,0. Alta atividade ureolítica pode ser detectada de 37 oC a 48 oC. Diferentes soluções salinas induzem o aumento na atividade enzimática desta urease, e quanto maior o tempo de exposição, maior a tendência a este aumento. Assim como a JBU, esta urease é capaz de inibir o crescimento de leveduras, mas diferentemente desta e da HPU, a PMU não apresenta atividade inibitória sobre a germinação de esporos e o crescimento de fungos filamentosos. As ureases de P. mirabilis e de H. pylori apresentam regiões de semelhança com o peptídeo proveniente do colágeno, e de acordo com testes de modelagem, esta região estaria exposta para interação com receptores localizados nas membranas de plaquetas, visto que ambas ativam plaquetas resultando na formação de agregados. / Ureases are Ni-dependent metalloenzymes, widespread in bacteria, fungi and plants, that catalyze the hydrolysis of urea into ammonium and carbon dioxide. The pathogenic bacteria Proteus mirabilis produces urease as virulence factor. Proteus mirabilis is a Gram negative opportunistic uropathogen, which causes severe infections in hospitalized patients. Ammonia released from urea hydrolysis by Proteus mirabilis urease (PMU) increases the local pH and forms a microclimate which allows the colonization of the host urinary tract. PMU presents high similarity to other ureases, such as that from Jack bean seeds (JBU) or from Helicobacter pylori (HPU), for which our group has described biological activities unrelated to urea hydrolysis. Here we aimed to investigate whether PMU shares with JBU and HPU other properties unrelated to enzyme activity. Growth conditions of PMU-expressing Escherichia coli HB101 were optimized by response surface methodology prior to purification. Concentrations of nickel, urea, and induction time were tested. A partially purified recombinant enzyme was obtained after 3 chromatographic steps. In the first, a HiTrapQTM HP (pH 7.5), urease eluted with 400 mMol.L-1 KCl. Peak fractions were pooled, dialyzed and loaded in a HiLoad 26/10 Q-SepharoseTM HP column using same buffer and eluting salt. The active fractions were pooled and PMU was submitted to gel filtration (Superdex 200TM26/60-pg). The enzyme was stable in the range of pH 7.0 up to 8.5, with optimum pH at 8.0. The ureolitic activity is high from 37 oC up to 48 oC. Different salts increased the ureolytic activity of PMU, the longer the exposition, the higher was the increase in activity. PMU inhibited yeast growth, similarly to the effect induced by JBU. Differently from JBU and HPU, this urease did not inhibit spore germination and growth of different filamentous fungi. Ureases from P. mirabilis and H. pylori presented regions of homology with collagen, and according to modeling tests, these region are exposed to receptor recognition localized in platelets membrane, which might explain their platelet aggregating effect.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:56:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9086_Amanda Lacerda20160413-141653.pdf: 1239073 bytes, checksum: fa8834f743bad46727e943eb9af47dd2 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da administração do Cloprostenol (análogo da PGF2α), na libido e qualidade espermática de touros jovens. Foram utilizados 12 animais hígidos, mestiços Holandes x Gir, de mesma faixa etária, púberes. Os animais foram divididos igual e aleatoriamente em grupo controle e grupo tratamento no dia do início do experimento, dia 0. Os animais do grupo controle receberam 2mL de solução salina, enquanto os animais do grupo tratamento receberam 500μg (2ml) de Cloprostenol semanalmente, a partir do dia 7 até o dia 70, perfazendo um total de 10 aplicações, estas aplicações foram feitas 30 minutos antes das coletas de sêmen para avaliação da qualidade espermática. A qualidade espermática foi avaliada através dos exames macroscópicos: cor, odor, aparência e volume (mL); microscópicos: turbilhonamento (0-5), motilidade espermática total (%), vigor (0-5), concentração espermática (sptz/mL) e avaliação da morfologia espermática; e testes complementares: termo-resistência (TTR) e hiposmótico (HOST). Nos dias 0, 35 e 70 foi realizado o teste de libido e aferida a circunferência escrotal dos animais. As variáveis quantitativas foram avaliadas em modelos mistos lineares com medidas repetidas no tempo, com animal como efeito aleatório; os escores dados para a variável libido foram utilizados para a classificação em: questionável, bom, muito bom e excelente. As frequências das classificações foram arranjadas em tabelas de contingência e as associações entre as classificações e os tratamentos foram avaliadas pelo teste exato de Fisher (tabelas 2 x 2) ou teste de Freeman-Halton (tabelas m x n). Para as variáveis qualitativas, foi utilizado o teste de Kruskall-Wallis, com nível de significância de 5%. Os resultados obtidos demonstraram que houve diferenças no HOST para os grupos no decorrer dos dias. Houve diferença (P<0,05) para motilidade no TTR entre os dias em ambos os grupos, porém foram observadas diferenças estatísticas (P<0,05) para o vigor apenas no grupo controle. Para o comportamento sexual dos animais não houve diferença significativa, sendo a maioria dos animais classificados com alta libido, com uma redução (P<0,05) para tempo de reação no D35 nos animais tratados e diferenças no D7 e D56 com aumento do volume do ejaculado dos animais. A circunferência escrotal não apresentou diferenças (P>0,05) entre os grupos tratados. Não houve diferença (P>0,05) para motilidade, turbilhonamento, concentração espermática, espermatozoides totais, espermatozoides viáveis e morfologia espermática. No presente estudo, a administração do Cloprostenol sódico, análogo da PGF2α, não afetou de forma expressiva a qualidade espermática e circunferência escrotal, no entanto, apresentou redução do tempo de reação do comportamento sexual.

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A urease (Canavalia ensiformis DC.) foi fisicamente imobilizada em matrizes de polipirrol (PPI) com o objetivo de se detectar uréia em amostras padrão. A eletropolimerização do pirrol foi realizada por voltametria cíclica em uma faixa de potencial de -1,0 a 1,0 V vs. ECS em um meio aquoso contendo 0,2 mol/L de \'LI\'CL\'O IND.4\' e 0,1 mol/L de pirrol. Este procedimento permitiu também a imobilização da enzima na matriz polimérica em suas formas, urease purificada (comercial) e como extrato bruto obtido a partir do feijão de porco (Jack Bean), após a adição de 300 \'mü\'g/mL de urease purificada ou 100 \'mü\'L de extrato bruto de feijão de porco. A urease purificada possui 34.375 U/g de sólido e o extrato bruto, 13.000 UA/mL, valores obtidos por titrimetria. A presença da enzima imobilizada nos filmes de PPI foi verificada por voltametria cíclica, FTIR, microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia de força atômica (AFM) e por uma microbalança de cristal de quartzo (MCQE). A atividade da enzima após a imobilização nos filmes de PPI foi confirmada pela presença de íons amônio em solução, que são formados como produtos da reação de hidrólise da uréia catalisada pela enzima. Como o transdutor influencia a eficiência e a sensibilidade do biossensor, dois métodos de transdução foram estudados: cronoamperometria, aplicando-se um potencial de -0,28 V durante 120 s em tampão fosfato pH 7,0 e a cronopotenciometria, aplicando-se uma corrente de 1,0 mA durante 120 s em tampão fosfato pH 7,0 variando-se a concentração de uréia. O principal objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência do biossensores para a detecção de uréia por meio de transdutores potenciométricos e amperométricos e depois comparar as eficiências dos filmes de PPI/urease purificada e PPI/extrato bruto como biosensores. / Urease (Canavalia ensiformis DC.) was physically immobilized on polypyrrole (PPy) films aiming at detecting urea in standard samples. The electropolymerization of pyrrole was performed by cyclic voltammetry at a potential range from -1.0 to 1.0 V vs SCE in an aqueous medium containing \'LI\'CL\'O IND.4\' 0.2 mol/L and 0.1 mol/L pyrrole. This procedure also allowed us to immobilize the enzyme into the PPy matrix in forms, commercially purified and crude extract of urease obtained from Jack Bean (Canavalia ensiformis) after adding into the electropolymerization media 300 \'mü\'g/mL of purified urease or 100 \'mü\'L of crude extract. The urease solutions had units of active enzyme of 34.375 U/g (purified) and 13.000 UA/mL (crude extract), and the crude extract was obtained from Jack beans by titrimétric methods. The presence of urease immobilized into the PPy film was verified by cyclic voltammetry, FTIR, scanning electron microscopy (SEM), atomic force microscopy (AFM), and by electrochemical quartz crystal microbalance (EQCM) The activity of the enzyme after immobilizing into the PPy films was confirmed by the presence of ammonium ions in solution, since they are formed as catalytic products by urea hydrolysis reaction catalyzed enzyme. The transducer element influences the efficiency and sensitivity of the biosensor, and two transducer methods were studied: chronoamperometry, by applying a potential of -0.28 V during 120 s in buffer phosphate at pH 7.0 and chronopotentiometry, by applying a current of 1.0 mA during 120 s in buffer phosphate at pH 7.0 both after varying the urea concentration. Our main purpose was to evaluate the efficiency of the biosensors for detecting urea by means of potentiometric and amperometric transducers and then compare the efficiencies of PPY/purified urease e PPY/crude extract as biosensors.

As moléculas orgânicas podem ser a principal entrada de nitrogênio para plantas em ambientes onde as fontes inorgânicas de nitrogênio são limitadas, como o ambiente epífitico. Estudos recentes têm mostrado que plantas de Vriesea gigantea, uma bromélia epífita formadora de tanque, possuem alta capacidade de absorver ureia, fazendo dela um excelente modelo para estudar o metabolismo de ureia. Entretanto, os processos de absorção e assimilação de ureia estão pouco caracterizados nessas plantas. Várias aquaporinas de plantas têm mostrado ser capazes de facilitar a difusão de ureia através das membranas. Três genes que codificam para aquaporina foliares, VgPIP1;2, VgPIP1;5 e VgTIP2, recentemente foram clonados a partir de plantas V. gigantea tratadas com ureia, sendo que as expressões de VgPIP1,5 e VgTIP2, foram induzidas por essa fonte nitrogenada. No entanto, não tinha sido testado funcionalmente se, de fato, essas aquaporinas seriam capazes de transportar ureia, amônio ou água através das membranas. Uma vez absorvida, a ureia precisa ser metabolizada. Sugere-se que a assimilação do N ocorra por meio da via GS/GOGAT, com prévia hidrólise da ureia pela enzima urease, fornecendo amônio e CO2. Contudo, nunca se analisou a relevância da urease nesse processo em V. gigantea. Dessa maneira, no presente trabalho o transporte de ureia, amônio e água através de VgPIP1;2, VgPIP1;5 e VgTIP2 foi determinado por meio de ensaios de absorção em ovócitos de Xenopus laevis (água e ureia) e de estudos de complementação em Saccharomyces cerevisiae (NH4+/NH3). Os resultados mostraram que, enquanto VgTIP2 facilita o transporte de água quando expresso isoladamente em ovócitos, VgPIP1;2 e VgPIP1;5 precisaram de ser co-expressos com aquaporinas do tipo PIP2 para serem corretamente transportadas para a membrana plasmática e atuem como canais de água. Além disso, VgTIP2 foi a única aquaporina capaz de facilitar a difusão de ureia através das membranas, enquanto que VgPIP1;2 parece ser capaz de transportar NH4+/NH3. Adicionalmente, a relevância da urease no processo de assimilação de ureia foi analisada por meio do perfil isotópico dos aminoácidos em plantas de V. gigantea tratadas com um inibidor da urease (cloranil) antes de fornecer ureia duplamente marcada com C13 e N15. Os experimentos foram conduzidos em plantas nas fases ontogenéticas, atmosférica e adulta-tanque devido a existência de diferenças metabólicas e morfológicas. Os resultados sugeriram que a atividade da urease é um passo limitante na conversão do N da ureia em amônio para sua assimilação. Adicionalmente, foi visto que a diminuição na atividade da urease afeta principalmente a formação de glutamina (Gln) em plantas atmosféricas, enquanto que em plantas adultas-tanque a transaminação é o principal processo prejudicado. A diferença de assimilação de ureia entre as fases ontogenéticas podem ser consequência de diferenças morfológicas associadas com estratégias para captar nutrientes. Além disso, apesar da diminuição da atividade da urease pela ação do inibidor, processos de assimilação direta (sem prévia hidrólise da ureia anterior) em plantas V. gigantea parecem improváveis de acontecer / Organic molecules can be the main input of nitrogen for plants in environments where inorganic nitrogen sources are limited, such as the epiphytic habitat. Recent studies have shown a high capacity of Vriesea gigantean, an epiphytic tank-forming bromeliad, to absorb urea by their leaves, making this bromeliad an excellent model to study urea metabolism. Nevertheless, urea uptake and assimilation processes are little characterized in these plants. Several plant aquaporins from different species are able to facilitate the diffusion of urea through the membranes. Three foliar aquaporin genes, VgPIP1;2, VgPIP1;5 and VgTIP2, have been recently cloned from urea-treated V. gigantea plants. The expression of VgPIP1;5 and VgTIP2 was specifically up-regulated by urea in the basal part of the leaves. Nevertheless, it had not been tested whether these aquaporins were in fact capable of facilitating the membrane diffusion of either urea, ammonium or water. Moreover, it was suggested that after urea absorption, this organic N compound is hydrolyzed by the urease enzyme into CO2 and NH4+ prior to NH4+ assimilation by the GS/GOGAT pathway. In the present project, urea, NH4+/NH3 and water diffusion through VgPIP1;2, VgPIP1;5 and VgTIP2 were determined by uptake studies in Xenopus laevis oocytes (urea and water)and complementation assay in Saccharomyces cerevisiae (NH4+/NH3). The results showed that while VgTIP2 facilitates water transport when expressed alone in oocytes, VgPIP1;2 and VgPIP1;5 needed to be co-expressed with a PIP2 aquaporin to be targeted to the plasma membrane and act as water channels. Moreover, VgTIP2 was the only aquaporin able to facilitate the diffusion of urea through the membrane, while VgPIP1;2 seems to be capable of transporting NH4+/NH3. Additionally, the urease relevance in the urea assimilation process was investigated through the analysis of the amino acid profile in V. gigantea plants kept under a urease inhibitor (chloranil) and supplied with labeled [13C]-[ 15N]2-urea. The experiments were conducted in atmosphheric and adult-tank ontogenetic stages of V. gigantea due to their metabolic and morphological differences. The results suggested that urease activity may be a limiting step in the conversion of N from urea to ammonium. Moreover, decreases in urease activity by chloranil impared the first steps in N assimilation, droping the pool of glutamine (Gln) in atmospheric plants. In adult-tank plants the transamination appeared to be adversely affected. Those differences in urea assimilation might be due to differences in the morphology and the nutrient capture strategies of the ontogenetic phases. Finally, direct urea assimilation process (without previous urea hydrolysis) in V. gigantea plants seems unlikely to occur

A urease (Canavalia ensiformis DC.) foi fisicamente imobilizada em matrizes de polipirrol (PPI) com o objetivo de se detectar uréia em amostras padrão. A eletropolimerização do pirrol foi realizada por voltametria cíclica em uma faixa de potencial de -1,0 a 1,0 V vs. ECS em um meio aquoso contendo 0,2 mol/L de \'LI\'CL\'O IND.4\' e 0,1 mol/L de pirrol. Este procedimento permitiu também a imobilização da enzima na matriz polimérica em suas formas, urease purificada (comercial) e como extrato bruto obtido a partir do feijão de porco (Jack Bean), após a adição de 300 \'mü\'g/mL de urease purificada ou 100 \'mü\'L de extrato bruto de feijão de porco. A urease purificada possui 34.375 U/g de sólido e o extrato bruto, 13.000 UA/mL, valores obtidos por titrimetria. A presença da enzima imobilizada nos filmes de PPI foi verificada por voltametria cíclica, FTIR, microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia de força atômica (AFM) e por uma microbalança de cristal de quartzo (MCQE). A atividade da enzima após a imobilização nos filmes de PPI foi confirmada pela presença de íons amônio em solução, que são formados como produtos da reação de hidrólise da uréia catalisada pela enzima. Como o transdutor influencia a eficiência e a sensibilidade do biossensor, dois métodos de transdução foram estudados: cronoamperometria, aplicando-se um potencial de -0,28 V durante 120 s em tampão fosfato pH 7,0 e a cronopotenciometria, aplicando-se uma corrente de 1,0 mA durante 120 s em tampão fosfato pH 7,0 variando-se a concentração de uréia. O principal objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência do biossensores para a detecção de uréia por meio de transdutores potenciométricos e amperométricos e depois comparar as eficiências dos filmes de PPI/urease purificada e PPI/extrato bruto como biosensores. / Urease (Canavalia ensiformis DC.) was physically immobilized on polypyrrole (PPy) films aiming at detecting urea in standard samples. The electropolymerization of pyrrole was performed by cyclic voltammetry at a potential range from -1.0 to 1.0 V vs SCE in an aqueous medium containing \'LI\'CL\'O IND.4\' 0.2 mol/L and 0.1 mol/L pyrrole. This procedure also allowed us to immobilize the enzyme into the PPy matrix in forms, commercially purified and crude extract of urease obtained from Jack Bean (Canavalia ensiformis) after adding into the electropolymerization media 300 \'mü\'g/mL of purified urease or 100 \'mü\'L of crude extract. The urease solutions had units of active enzyme of 34.375 U/g (purified) and 13.000 UA/mL (crude extract), and the crude extract was obtained from Jack beans by titrimétric methods. The presence of urease immobilized into the PPy film was verified by cyclic voltammetry, FTIR, scanning electron microscopy (SEM), atomic force microscopy (AFM), and by electrochemical quartz crystal microbalance (EQCM) The activity of the enzyme after immobilizing into the PPy films was confirmed by the presence of ammonium ions in solution, since they are formed as catalytic products by urea hydrolysis reaction catalyzed enzyme. The transducer element influences the efficiency and sensitivity of the biosensor, and two transducer methods were studied: chronoamperometry, by applying a potential of -0.28 V during 120 s in buffer phosphate at pH 7.0 and chronopotentiometry, by applying a current of 1.0 mA during 120 s in buffer phosphate at pH 7.0 both after varying the urea concentration. Our main purpose was to evaluate the efficiency of the biosensors for detecting urea by means of potentiometric and amperometric transducers and then compare the efficiencies of PPY/purified urease e PPY/crude extract as biosensors.

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