Made available in DSpace on 2016-05-11T13:02:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 renata_santos_ioc_dout_2015.pdf: 7837974 bytes, checksum: c24ab8fc73c62397ef3bd2693164b4de (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Na infecção pelo vírus da hepatite A, a maioria dos pacientes desenvolvem uma doença branda ou assintomática. No entanto, alguns pacientes podem progredir para uma doença mais grave que é caracterizada pela rápida degradação do fígado, coagulopatia e encefalopatia hepática, conhecida como falência hepática aguda (ALF). A infecção pelo HAV se apresenta como uma interação dinâmica entre fatores do vírus e do hospedeiro que em conjunto é responsável pela diversidade no desfecho clínico da doença. Apresentações incomuns de infecções prevalentes foram muitas vezes atribuídas a fatores específicos do hospedeiro. Estudos de associações genômicas (GWAS) provaram ser uma ótima abordagem na identificação de alelos de risco que estão relacionados a tais síndromes. Neste estudo, 31 variações nucleotídicas humanas, incluindo variações de um único nucleotídeo (SNP) e inserções, associadas à infecção pelo HAV foram caracterizadas numa coorte com casos clássicos e de ALF. Todos os casos de hepatite A foram identificados pelo PCR em tempo real otimizado para a região 5' não codificante do HAV A população amostral dos GWAS consistiu em indivíduos expostos a surtos intradomiciliares e casos esporádicos de hepatite A no Brasil. Ao todo 321 amostras foram coletadas das quais 164 foram utilizadas nos estudos de variabilidade genética do hospedeiro. As análises de \201Codds ratio\201De \201Cdata mining\201D sugeriram que os SNPs INFL3 rs rs8099917, TGFbeta1 rs1800469, ABCB1 rs1045642, IL10 rs1800871 (IL10b), TNF\2013alpha rs1799964 (TNF\2013alpha a), TNF\2013alpha rs1800630 (TNF\2013alpha b) foram significantemente associados à gravidade da doença. Muitas das variantes identificadas neste estudo estão relacionadas a genes importantes na patofisiologia da infecção pelo HAV. Entender como os fatores do hospedeiro influenciam a resposta imune à infecção viral fornece novas oportunidades para controlar esta doença e o desenvolvimento de terapêuticas eficientes / During hepatitis A virus infection, most patients develop mild or asymptomatic disease. However, some patients can progress to a serious, life\2013threatening disease characterized by rapid deterioration of the liver, hepatic encephalopathy, and coagulopathy known as acute liver failure (ALF). HAV infection features a dynamic interplay of viral and host factors that in conjunction are responsible for the range of disease outcomes. Unusual presentations of prevalent infections have often been attributed to host\2013specific factors. Genome\2013wide association study (GWAS) has proven to be a powerful approach for identifying risk alleles that underlie such syndromes. In this study, thirty one human nucleotide variations, including single nucleotide polymorphisms (SNP) and insertions, associated with HAV infection were characterized in a cohort of ALF and classical HAV cases. All hepatitis A cases were identified by optimized real\2013time PCR for HAV 5' non\2013coding region. GWAS sample population consisted in individuals exposed to an intradomiciliary outbreak and sporadic cases of hepatitis A in Brazil Altogether 321 samples were collected of which 164 were placed into host genetic variability study. Odds ratio and data mining analysis suggested that INFL3 rs rs8099917, TGFbeta1 rs1800469, ABCB1 rs1045642, IL10 rs1800871 (IL10b), TNF\2013alpha rs1799964 (TNF\2013alpha a), TNF\2013alpha rs1800630 (TNF\2013alpha b) SNPs were significant associated with severe hepatitis A outcome. Several of the variants identified in this genome\2013wide study lie within genes important to hepatic pathophysiology for hepatitis A virus infection. Understanding how the host factor influences the immune response to viral infection provides new opportunities to control this disease and for the development of effective therapeutics

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-21T19:40:25Z No. of bitstreams: 1 alexandre_santos_silva_ioc_bp_0011_2010.pdf: 1220834 bytes, checksum: e61580079e61e5f06f901abb6feddfb9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-21T19:40:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alexandre_santos_silva_ioc_bp_0011_2010.pdf: 1220834 bytes, checksum: e61580079e61e5f06f901abb6feddfb9 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A hepatite A é uma doença endêmica no Brasil e na América Latina. A prevalência da infecção tem correlação com precárias condições de higiene e saneamento. Em países em desenvolvimento, um saneamento inadequado resulta em maior transmissão desta doença, principalmente entre crianças e jovens. Atualmente, devido às melhorias das condições sanitárias, o perfil epidemiológico da doença está se deslocando para idades mais avançadas, o que facilita a ocorrência de surtos epidemiológicos. Os kits comerciais para detecção de anti-HAV total normalmente utilizam imunoglobulina G (IgG) de mamíferos no período convalescente da doença para a produção dos anticorpos de captura e do conjugado. Uma alternativa à aplicação dos anticorpos de mamíferos no diagnóstico é o uso da imunoglobulina Y (IgY), encontrada no soro e gema dos ovos de aves e répteis. Essas proteínas têm varias vantagens quando comparadas com IgG: alta resposta contra antígenos de mamíferos, redução da cor de fundo em ensaios imunoenzimáticos e de serem obtidas por um método não-invasivo (coleta da gema dos ovos). O objetivo deste trabalho foi a obtenção de anticorpos IgY anti-HAV produzidos em galinhas imunizadas contra o vírus da Hepatite A (HAV) e o desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático para detecção de anti-HAV total utilizando IgY anti-HAV como imunoglobulinas de captura e conjugado. Cinco grupos de galinhas foram imunizadas com diferentes inóculos contendo: vacina com e sem o adjuvante CpG-ODN, HAV com adjuvante incompleto de Freund (IFA) com e sem o adjuvante CpG-ODN e um grupo controle com IFA. Os ovos foram coletados e a gema foi purificada pela precipitação com polietileno glicol. A solução purificada contendo IgY anti-HAV foi avaliada para determinação da concentração da IgY anti-HAV por espectrofotometria e sua especificidade e título foram determinados à partir de um teste imunoenzimático. Os anticorpos foram conjugados com a peroxidase e foi estabelecida a diluição ideal para os anticorpos de captura e conjugado. Para avaliar o ensaio imunoenzimático “in-house” com IgY anti-HAV, foi avaliado um painel composto de 100 amostras positivas e 100 amostras negativas para anti- HAV-total. A presença da IgY anti-HAV nas gemas dos ovos foi confirmada por SDS-PAGE e Western Blotting, e após a purificação, a média da concentração de proteínas nas gemas dos ovos foi de 8,7406 mg /mL. O grupo imunizado com HAV, IFA e CPG-ODN apresentou os maiores títulos de anticorpo. O ensaio “in-house” apresentou sensibilidade de 84%, especificidade de 79% e eficiência de 81,5%. Os métodos utilizados para a produção de IgY anti-HAV e sua conjugação com peroxidase foram eficientes e o ensaio imunoenzimático “in-house” IgY anti-HAV demonstrou uma boa sensibilidade e especificidade. A produção de anti-HAV IgY apresenta vantagens quando comparado com obtenção da IgG anti-HAV. O teste imunoenzimático “in house” com IgY anti- HAV pode ser uma alternativa a utilização da IgG nos ensaios imunoenzimáticos. / Hepatitis A is an endemic disease in Brazil and Latin America. Prevalence of this infection is related to the low degree of hygiene and sanitation. In developing countries, inadequate sanitation results in larger transmission of the disease mostly in children and young people. Nowadays, due to better sanitation conditions, the epidemiological profile of disease is changing to older ages resulting in the occurrence of outbreaks. Diagnostic kits for detection of total anti-HAV generally use mammals immunoglobulin G (IgG) in the convalescent period of disease for production of capture and conjugated antibodies. One alternative to the application of mammals antibodies in the diagnosis is the use of immunoglobulin Y (IgY), encountered in birds and reptiles. These proteins have several advantages when compared to IgG: high response against mammals antigens, reduction of the background in imunoenzymatic assays and it is obtained by a non-invasive method (harvest of the egg yolks). The objective of this work was the acquisition of anti-HAV IgY antibodies produced in immunized chickens against Hepatitis A virus and the development of an immunoenzymatic assay for total anti-HAV detection using IgY anti-HAV as capture and conjugated immunoglobulins. Five groups of chickens were immunized with different inocula containing: vaccine with and without CpG-ODN adjuvant, HAV with incomplete Freund adjuvant (IFA) with and without CpG-ODN and one control group with IFA. The eggs were harvested and the yolk was purified by precipitation with polyethylene glycol. The purified solution containing anti-HAV IgY was evaluated by espectrofotometry and their specificity and title were determined by an immunoenzymatic assay. These antibodies were conjugated with peroxidase and was estabilized the ideal dilution for capture and conjugated antibodies. For evaluation of the immunoenzymatic “in-house” assay with IgY anti-HAV, a panel composed of 100 positive samples and 100 negative samples for total anti-HAV was assessed. The presence of IgY anti-HAV in egg yolks was established by SDS-PAGE and Western Blotting, and after the purification, the average of the proteins concentrations in the egg yolks was of 8,7406 mg/mL. The group immunized with HAV, IFA and CpG-ODN demonstrate the higher titer of antibodies. The “in-house” assay showed sensibility of 84%, specificity of 79% and efficiency of 81,5%. The methods used for anti-HAV IgY production and conjugation with peroxidase were efficient and the “in-house” immunoenzymatic assay IgY anti-HAV demonstrated a good sensitivity and specificity. The production of IgY anti-HAV showed advantages when compared to the acquisition of IgG anti-HAV. The immunoenzymatic “in-house” assay IgY anti- HAV can be an alternative to the utilization of IgG in immunoenzymatic assays.