A fragmentação e a invasão de florestas tropicais e a crescente concentração de assentamentos humanos aumentaram exponencialmente as chances de exposição a vírus emergentes e emergentes. Dado o grande potencial de espalhamento de patógenos em população humanas, a identificação e caracterização de agentes patogênicos circulantes podem melhorar a atenção primária e as capacidades de diagnóstico para um agente emergente futuro. As abordagens moleculares e metagenômicas que utilizam as tecnologias de sequenciação da próxima geração levaram a descoberta e caracterização de muitos vírus emergentes na última década. Além disso, as abordagens in silico também podem ajudar a identificar vírus emergentes usando apenas dados de sequenciamento publicamente disponíveis. Além disso, estimar a ascendência filogenética e até mesmo analisar as mudanças no uso de codons são ferramentas adicionais que podem melhorar a nossa compreensão de vírus emergentes ou reemergentes. Este projeto visou aplicar essas ferramentas em ambos os vírus que poderiam estar circulando no Brasil: Parvovírus B19 e vírus da Febre Amarela. Também exploramos as aplicações de modelos ocultos de Markov e índice de adaptação de codons usando dados publicamente disponíveis. Esperamos que este trabalho forneça uma prova de conceito para futuros projetos metagenômicos e demonstre a utilidade das várias técnicas moleculares e bioinformáticas no estudo de vírus emergentes. / Fragmentation and encroachment of tropical rainforests and the growing concentration of human settlements have exponentially increased chances of exposure to re-emerging and emerging viruses. Given the large potential for pathogens to spillover and spread in a population, identifying and characterizing circulating human pathogens could improve the readiness and diagnostic capabilities for a future emergence. Molecular and metagenomic approaches using next-generation sequencing technologies have led to the discovery and characterization of many emerging viruses over the last decade. In complement, in silico approaches can also help identify emerging viruses using only publicly available sequencing data. Moreover, estimating the phylogenetic ancestry and even analyzing changes in codon usage are additional tools that can improve our understanding of an emerging or re-emerging virus. This project aimed to apply these tools to two viruses that could be circulating in Brazil: Parvovirus B19 and Yellow Fever virus. We also explored the applications of Hidden Markov models and codon adaptation index using publicly available data. We expect this work to provide a proof-of-concept for future metagenomic projects, and demonstrate the utility for several molecular and bioinformatics techniques in the study of emerging viruses.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2013-03-19T16:07:54Z No. of bitstreams: 1 Ana_Carolina.pdf: 2560132 bytes, checksum: 663a398860ff953a4b1de21a209ee151 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-19T16:07:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana_Carolina.pdf: 2560132 bytes, checksum: 663a398860ff953a4b1de21a209ee151 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O desenvolvimento de uma vacina para malária é considerado atualmente uma prioridade em saúde pública pelo impacto socioeconômico e morbidade da doença com 250 milhões de novos casos por ano. A vacina de febre amarela é considerada uma das vacinas mais bem sucedidas por sua imunogenicidade duradora obtida após uma única dose. Frente a elucidação das respostas polivalentes dirigidas ao vírus vacinal 17D, a utilização do mesmo como vetor de expressão para antígenos heterólogos têm sido encorajada. Tendo em vista que febre amarela e malária compartilham grandes zonas endêmicas nos continentes americano e africano, a construção de uma vacina para malária baseada no vetor de febre amarela 17D se tornou uma abordagem interessante. Foram construídos dois vírus recombinantes contendo a proteína heteróloga MSP-119de P. falciparum (FA17D/MSP-119fal) e P. vivax (FA17D/MSP-119vivax) entre os genes E/NS1 de FA. Esta proteína é constituída de um fragmento de 19 kDa obtido após o processamento proteolítico da proteína de superfície do merozoíta 1 (MSP-1) durante a invasão do eritrócito e é descrita como alvo de anticorpos protetores em animais e pessoas imunes. Os vírus recombinantes foram caracterizados in vitro quanto à capacidade proliferativa em células Vero, estabilidade genética e expressão da proteína heteróloga por microscopia confocal de imunofluorescência e western blotting. A imunização de camundongos BALB/c e primatas não-humanos da espécie Saimiri sciureus foi usada para avaliar as construções quanto à imunogenicidade. Ambos os vírus foram capazes de induzir a produção de anticorpos neutralizantes contra a FA, porém em menores títulos do que os induzidos pelo vírus vacinal 17DD. A indução de anticorpos específicos para a proteína heteróloga após a imunização com os diferentes vírus recombinantes, também foi demonstrada e resultou em baixos títulos de IgG.em ambos os modelos. Os anticorpos induzidos no modelo com macacos Saimiri reconheceram a proteína nativa do parasita em hemácias infectadas por P. falciparum. No entanto, o desafio realizado neste modelo de primata não-esplenectomizado após a imunização com FA17D/MSP-119fal não gerou resultados conclusivos. Estes resultados sugerem a necessidade de aprimoramento da plataforma de expressão em busca de maior imunogenicidade. / The development of a vaccine for malaria is currently considered a priority in public health due to the socioeconomic impact and morbidity of the disease with 250 million new cases registered every year. The yellow fever vaccine is considered one of the most successful vaccines for its longlasting immunogenicity obtained after a single dose. As a result of the elucidation of the polyvalent responses directed to YF17D vaccine virus, the use of this virus as an expression vector of heterologous antigens has been encouraged. Considering that yellow fever and malaria share the major endemic areas in American and African continents, the construction of a vaccine for malaria based on the yellow fever 17D vector became an interesting approach. Two recombinant viruses containing the heterologous protein MSP-119 from P. falciparum (YF17D/MSP-119fal) and P. vivax (YF17D/MSP-119vivax) inserted between the E/NS1 genes have been constructed. This protein consists of a 19 kDa fragment obtained after proteolytic processing of the merozoite surface protein 1 (MSP-1) during invasion of erythrocytes and is described as a target for protective antibodies in animals and immune people. Recombinant viruses were characterized in vitro for their proliferative capacity in Vero cells and genetic stability and expression of heterologous protein were assessed by confocal immunofluorescence and Western blotting. Immunization of BALB/c mice and non-human primate species Saimiri sciureus allowed the evaluation of the constructions in terms of immunogenicity. Both viruses were capable of inducing neutralizing antibodies to YF, but in lower titers than those induced by the vaccine virus 17DD.The induction of specific antibodies for the heterologous protein by the different recombinant viruses was also demonstrated by low levels of IgG in both models. The antibodies induced in this monkey model bound to the native protein in parasite-infected red blood cells by immunofluorescence. The challenge carried out in after immunization of Saimiri monkeys with FA17D/MSP-119fal did not generate conclusive results. These data suggest the need to improve the platform of expression towards higher viral immunogenicity.