ELOY, Ygor Raphael Gomes. Caracterização físico-química e estrutural de polissacarídeos obtidos de folhas da planta Aloe barbadensis Miller e avaliação de suas atividades antiviral e anti-hemorrágica. 2012. 186 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T15:19:36Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_yrgeloy.pdf: 4816746 bytes, checksum: df9405e734ec6c678912a942f68c57ad (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:43:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_yrgeloy.pdf: 4816746 bytes, checksum: df9405e734ec6c678912a942f68c57ad (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:43:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_yrgeloy.pdf: 4816746 bytes, checksum: df9405e734ec6c678912a942f68c57ad (MD5) Previous issue date: 2012 / The aim of this study was to investigate the physicochemical and structural parameters of polysaccharides obtained from Aloe barbadensis leaves and to evaluate the antiviral and cytotoxic activities and procoagulant, anti-bleeding effects. In addition, toxicological analysis was carried out. The pulp was submitted to aqueous extraction (70 °C) and the total polysaccharides (PT) obtained by ethanol precipitation, TCA was used to remove the protein contamination. The fractionation of PT with DEAE-celulose resulted in two fractions (PI and PII). The physicochemical characterization showed that PI fraction presents mannose (78,4%), glucose (7,3%), galactose (2,1%), fucose (2,8%) and uronic acid (10,0%). Sulfate esters were not detected in PI fraction. On the other hand, PII fraction presents the monosaccharides mannose (39,2%), glucose (22,2%), galactose (26,3%), arabinose (3,8%), xylose (1,1%), uronic acids (8,0%) and sulfate esters groups (12,0%). The polysaccharidics of PII obtained by PAGE and agarose gel electrophoresis were revealed with toluidine blue and stainsall dye showing the presence of two different bands, one purple (indicative of sulfate) and another cyan (indicative of carboxilated groups). Structural analysis of PI and PII fractions by IR spectroscopy demonstrated that PI fraction is composed of residues of â-mannose O-acetylated (812.2 and 960 cm-1) and uronic acids (1738 cm-1). In contrast, the PII fraction is composed of mannose (1014.7 cm-1), galactose (1078.2 cm-1), negatively charged uronic acids (1635 cm-1) and sulfate ester (1329.5 and 1260.9 cm-1). These results corroborate with NMR analyses that suggest the presence of sulfate groups in PII structure. The cytotoxicity evaluation showed that PT and the fractions PI and PII did not show toxicity against most of tested cells and the same fractions were not effective against non-enveloped virus (Ad 19 and Ad 41) inhibition. However, the PT and PI fraction were able to inhibit the infection caused by HSV-1 and HSV-2. In addition, PII fraction presents antiviral activity against metapneumovirus. Although the PT and the fractions PI and PII did not show activity against dengue virus serotype 1 (DENV-1), PT could inhibit the bleeding effects in rats, reducing the bleeding and prothrombin time. The PT showed no toxicity in mice, but increased spleen size and number of blood platelets. In conclusion, A. barbadensis leaves contain neutral or negatively charged carboxylated/sulfated polysaccharides. In addition, besides having inhibitory activity against HSV-1, HSV-2 and HMPV, they can also anti-bleeding and procoagulant effect. Moreover, the PT of A. barbadensis showed no significant toxicity and can be used as a safe and effective therapeutic agent. / Este trabalho teve como objetivos caracterizar físico-química e estruturalmente polissacarídeos obtidos de folhas de Aloe barbadensis e avaliar suas atividades antiviral, anti-hemorrágica e pró-coagulante e possíveis sinais de toxicidade. Foi realizada extração aquosa de polissacarídeos totais (PT) de A. barbadensis, seguido de precipitação por etanol e remoção dos contaminantes proteicos com TCA. A cromatografia em DEAE-celulose foi eficiente no fracionamento dos PT, onde foram obtidas as frações PI e PII. A caracterização físico-química mostrou que a fração PI é composta por manose (78,4%), glucose (7,3%), galactose (2,1%), fucose (2,8%) e ácidos urônicos (10,0%), e isenta de grupos éster sulfato. Enquanto, a fração PII é constituída por manose (39,2%), glucose (22,2%), galactose (26,3%), arabinose (3,8%), xilose (1,1%), ácidos urônicos (8,0%) e grupos éster sulfato (12,0%). Na revelação das bandas polissacarídicas da fração PII, obtidas por PAGE e gel de agarose corados com stainsall foi constatado a presença de duas bandas que apresentaram diferentes colorações, roxa e ciana, correspondentes a presença de grupos sulfato e carboxilados, respectivamente. Na análise estrutural das frações PI e PII, por espectroscopia no IR, foi demonstrado que a fração PI apresenta unidades monossacarídicas de â-manose O-acetiladas (812,2 e 960 onda.cm-1) e ácidos urônicos neutros (1738 onda.cm-1) em sua estrutura. Diferentemente, a fração PII, mostrou-se ser constituída por unidades monossacarídicas de manose (1014,7 onda.cm-1), galactose (1078,2 onda.cm-1), ácidos urônicos carregados negativamente (1635 onda.cm-1) e éster sulfato (1329,5 e 1260,9 onda.cm-1). Na avaliação estrutural da fração PII por RMN foi comprovado à presença do grupo éster sulfato. Em relação às atividades biológicas, o teste de citotoxicidade mostrou que os PT e as frações PI e PII não apresentaram toxicidade para a maioria das células testadas e não foram eficientes na inibição de vírus não envelopados Ad-19 e Ad-41. No entanto, os PT e a fração PI foram capazes de inibir a infecção causada por HSV-1 e HSV-2. Em ensaios com metapneumovírus (HMPV), a fração PII apresentou atividade antiviral superior à ribavirina. Embora os PT e as frações PI e PII não terem apresentado atividade contra dengue vírus sorotipo 1 (DENV-1), os PT puderam inibir a hemorragia em ratos, diminuindo o tempo de sangramento e o tempo de protrombina. Os PT não apresentaram toxicidade em camundongos, mas aumentaram o tamanho do baço e o número de plaquetas sanguíneas. Pode ser concluído que extratos foliares de A. barbadensis podem apresentar polissacarídeos neutros ou carregados negativamente por grupos carboxilados/sulfatados. Em adição, além de apresentar atividade inibitória contra os vírus HSV-1, HSV-2 e HMPV, podem também apresentar efeito anti-hemorrágico e prócoagulante, propriedades essas, importantes, visto que a complicação de muitas viroses leva a quadros hemorrágicos. Além disso, os PT de A. barbadensis não apresentaram toxicidade expressiva, podendo ser utilizada como agente terapêutico seguro e eficaz.

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No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2011-08-31 / The recurrent aphthous stomatitis (RAS) is the most common inflammatory ulcerative disorder of no keratinized oral mucous , whose etiology is still uncertain and controversial. The herpes simplex virus 1 and 2 (HSV-1 and 2) infect litically the mucous epithelium generating clinical manifestation similar to RAS but in keratinized mucous. That said, the goal of this study was to verify the presence of herpes simplex virus 1 and/or 2 in ulcers no keratinized oral mucous of immunocompetent individuals. Sixteen patients were evaluated in the Polyclinic of Dentistry of the University of the State of Amazonas and particular service, showing ulcers in the no keratinized oral mucous and pharyngeal (one case), excluding the possibility of chemical , physics or immunosuppressive disease etiology. Swabs were collected from the centre and the periphery of aphthous lesion for the first eight patients and of the latter, in addition to scraped, 1 ml of sample of not stimulated saliva present in the mouth. Those samples were performed by Polymerase chain reaction (PCR) with multi and specific primers to each virus, after identification by the same technique of the presence of genomic DNA in the samples, and in none of these, of ulcer was found viral particle, occurring, however, the amplification fragment of HSV-2 salivary sample of one of the patients who had studied in isolation, the second time. The individual positive for the sample to feel again the symptoms identified the area suffered in the buccal floor in vesicular stage still out and made the immediate collection of smear, ulcerated lesion to shortly, and also salivate, occurring by methodology submitted, the amplification of genetic material of the virus HSV-2 in wound collected, not occurring in saliva. It was concluded with the search, the HSV has not been identified in most patients studied , except for the specific case, whose collection of biological material of the ulcer in initial stage of the condition, concluding that the HSV-2, genital mucous common infecting organism, can, in some cases, be present and be potential etiological factor of recurrent aphthous ulcers of the oral cavity. / A estomatite aftosa recorrente (EAR) é a condição inflamatória ulcerativa mais comum da mucosa bucal não-ceratinizada, possuindo etiologia ainda incerta e controvertida. Os vírus herpes simples 1 e 2 ( HSV-1 e 2) infectam liticamente o epitélio desta mucosa gerando manifestação clínica semelhante a esta estomatite, porém em mucosa ceratinizada. Diante disso, o objetivo deste estudo foi verificar a presença de vírus herpes simples 1 e/ou 2 em úlceras de mucosa bucal não-ceratinizada de indivíduos imunocompetentes. Dezesseis pacientes foram avaliados na Policlínica de Odontologia da Universidade do Estado do Amazonas e serviço particular, apresentando úlceras em mucosa não - ceratinizada bucal e faríngea ( um caso) , descartada a possibilidade de etiologia química, física ou doença imunossupressora de base. Foram coletados esfregaços do centro e da periferia da lesão aftosa dos oito primeiros pacientes e dos últimos, além do raspado, 1 ml de amostra de saliva não estimulada presente na boca. Foi realizada Reação em Cadeia de Polimerase ( PCR ) com iniciadores multi e específicos para cada vírus, após identificação pela mesma técnica da presença de DNA genômico nas amostras, e em nenhuma destas, de úlcera foi encontrada partícula viral, ocorrendo , no entanto , amplificação do fragmento de HSV-2 da amostra salivar de um dos pacientes que fora estudado isoladamente, em segundo momento . O indivíduo positivo para a amostra ao sentir novamente os sintomas, identificou a área acometida em soalho bucal , em fase ainda vesicular e fora feita a coleta imediata do esfregaço da lesão, ulcerada a pouco tempo, e também salivar , ocorrendo pela metodologia apresentada, a amplificação de material genético do vírus HSV- 2 na ferida coletada, não ocorrendo na de saliva . Concluiu-se com a pesquisa, que o HSV não foi identificado na maior parte dos pacientes estudados, excetuando o caso específico, cuja a coleta do material biológico da úlcera fora realizada em fase inicial da condição, concluindo que o HSV-2, infectante comum de mucosas genitais pode, em alguns casos, estar presente e ser potencial fator etiológico das úlceras aftosas recorrentes da cavidade bucal.

A proteína quinase dependente de RNA (PKR) é uma molécula sentinela ativada em situações de estresse celular, incluindo infecções virais. A ativação de PKR por meio de sua fosforilação aciona cascatas de sinalização intracelular envolvidas em respostas inflamatórias e inibição da síntese protéica. Dados prévios do nosso laboratório sugerem que PKR está envolvida na hiperalgesia térmica de origem inflamatória. No presente estudo, foi investigado o papel da PKR na hiperalgesia térmica induzida pelo vírus da herpes simples tipo 1 (HSV1), durante as fases herpética e pós-herpética, combinando métodos comportamentais, genéticos, farmacológicos e moleculares. Camundongos C57bl/6, PKR+/+ e PKR-/- machos foram inoculados com HSV1. Os grupos controle foram inoculados com HSV1 inativo. Alodínia mecânica e hiperalgesia térmica foram monitoradas antes da inoculação do vírus e 8, 14, 21 e 28 dias após a inoculação. A curva dose e temporesposta e o teste da capsaicina foram realizados no 8º e 21º dias após a inoculação do vírus. Também nos períodos herpético e pós-herpético, foi investigado o perfil de expressão de proteínas envolvidas nas vias de sinalização de PKR (PKR, eIF2?, PACT, IKK e PP2A?), assim como o efeito da inibição de PKR pelo monitoramento da fosforilação de PKR, IKK?/?, P38, JNK, ERK1,2 e STAT3, e expressão de CaMKII? e TRPV1 nos GRD (L3-L6) ipsilateralmente à pata inoculada. Alodínia mecânica e hiperalgesia térmica ficaram evidentes até 28 dias após a inoculação. Camundongos PKR-/- desenvolveram alodínia mecânica, mas não hiperalgesia térmica, quando comparados com animais PKR+/+. A inibição sistêmica de PKR reverteu a hiperalgesia térmica de modo tempo- e dose-dependente e preveniu o comportamento nocifensivo induzido por capsaicina, enquanto PKR-/- apresentaram resposta nocifensiva praticamente ausente em ambas as fases herpética e pósherpética. Houve aumento da expressão de PP2A? e da fosforilação de PKR, IKK?/? e eIF2?, durante os períodos herpético e pós-herpético, e de PACT na fase pósherpética. A inibição de PKR promoveu o aumento da fosforilação de P38 em ambas as fases, e redução da fosforilação de PLC?1 acompanhada do retorno da fosforilação de Akt e STAT3 ao nível do grupo controle e o aumento da expressão de Ca-MKII? na fase herpética. Já na fase pós-herpética, reduziu a fosforilação de JNK e Akt e a expressão de Ca-MKII?, retornou a fosforilação de ERK1,2, PLC?1 e STAT3 ao nível do grupo controle e aumentou a expressão de TRPV1. Nossos resultados indicam que a atividade de PKR desempenha papel essencial na hiperalgesia térmica induzida por infecção pelo HSV1 / Double stranded RNA-activated protein kinase (PKR) is a sentinel molecule activated by cellular stress conditions, including viral infections. PKR activation by phosphorylation triggers cascades involved in inflammatory response and protein synthesis suppression. Our previous data suggest that PKR is involved in the inflammatory thermal hyperalgesia. Here we investigated the role played by PKR on thermal hyperalgesia induced by herpes simplex virus type-1 (HSV-1), during herpetic and post-herpetic phases, by combining behavioral, genetic, pharmacological, and molecular methods. Adult male C57bl/6, PKR+/+ and PKR-/- mice were inoculated with HSV-1. Control groups were inoculated with inactive (mock) HSV1. Mechanical allodynia and thermal hyperalgesia were monitored before virus inoculation and 8, 14, 21, and 28 days post-inoculation. The dose- and timeresponse curve and the capsaicin test were performed at 8th and 21st days post virus inoculation. Also in the herpetic and post-herpetic periods, was investigated the expression profile of proteins involved in the PKR signaling pathways (PKR, eIF2?, PACT, IKK and PP2A?), and the effect of PKR inhibition by monitoring PKR, IKK?/?, P38, JNK, ERK1,2, and STAT3 phosphorylation, and Ca-MKII? and TRPV1 expression in the dorsal root ganglia (L3-L6) ipsilaterally to the inoculated paw. Mechanical allodynia and thermal hyperalgesia became evident until 28 days postinnoculation. PKR-/- mice developed mechanical allodynia but not thermal hyperalgesia, when compared with PKR+/+ mice. Systemic PKR inhibition reversed thermal hyperalgesia in a dose and time-dependent manner, and prevented the capsaicin-induced nocifensive behavior, whereas PKR-/- showed no nocifensive behavior almost absent in both herpetic and post-herpetic phases. There was increased expression of PP2A? and the phosphorylation of PKR, IKK?/?, and eIF2?, during herpetic and post-herpetic periods, and PACT in the post-herpetic phase. PKR inhibition increased P38 phosphorylation in both phases, and reduction of PLC?1 phosphorylation together with the return of the Akt and STAT3 phosphorylation to the control group level, and enhanced Ca-MKII? expression in the herpetic phase. At the post-herpetic phase, suppressed JNK and Akt, and Ca-MKII? expression returned ERK1,2, PLC?1 and STAT3 phosphorylation to control group level and increased TRPV1 expression. The data indicate that PKR activity plays an essential role in the HSV-1 infection-induced thermal hyperalgesia

A proteína quinase dependente de RNA (PKR) é uma molécula sentinela ativada em situações de estresse celular, incluindo infecções virais. A ativação de PKR por meio de sua fosforilação aciona cascatas de sinalização intracelular envolvidas em respostas inflamatórias e inibição da síntese protéica. Dados prévios do nosso laboratório sugerem que PKR está envolvida na hiperalgesia térmica de origem inflamatória. No presente estudo, foi investigado o papel da PKR na hiperalgesia térmica induzida pelo vírus da herpes simples tipo 1 (HSV1), durante as fases herpética e pós-herpética, combinando métodos comportamentais, genéticos, farmacológicos e moleculares. Camundongos C57bl/6, PKR+/+ e PKR-/- machos foram inoculados com HSV1. Os grupos controle foram inoculados com HSV1 inativo. Alodínia mecânica e hiperalgesia térmica foram monitoradas antes da inoculação do vírus e 8, 14, 21 e 28 dias após a inoculação. A curva dose e temporesposta e o teste da capsaicina foram realizados no 8º e 21º dias após a inoculação do vírus. Também nos períodos herpético e pós-herpético, foi investigado o perfil de expressão de proteínas envolvidas nas vias de sinalização de PKR (PKR, eIF2?, PACT, IKK e PP2A?), assim como o efeito da inibição de PKR pelo monitoramento da fosforilação de PKR, IKK?/?, P38, JNK, ERK1,2 e STAT3, e expressão de CaMKII? e TRPV1 nos GRD (L3-L6) ipsilateralmente à pata inoculada. Alodínia mecânica e hiperalgesia térmica ficaram evidentes até 28 dias após a inoculação. Camundongos PKR-/- desenvolveram alodínia mecânica, mas não hiperalgesia térmica, quando comparados com animais PKR+/+. A inibição sistêmica de PKR reverteu a hiperalgesia térmica de modo tempo- e dose-dependente e preveniu o comportamento nocifensivo induzido por capsaicina, enquanto PKR-/- apresentaram resposta nocifensiva praticamente ausente em ambas as fases herpética e pósherpética. Houve aumento da expressão de PP2A? e da fosforilação de PKR, IKK?/? e eIF2?, durante os períodos herpético e pós-herpético, e de PACT na fase pósherpética. A inibição de PKR promoveu o aumento da fosforilação de P38 em ambas as fases, e redução da fosforilação de PLC?1 acompanhada do retorno da fosforilação de Akt e STAT3 ao nível do grupo controle e o aumento da expressão de Ca-MKII? na fase herpética. Já na fase pós-herpética, reduziu a fosforilação de JNK e Akt e a expressão de Ca-MKII?, retornou a fosforilação de ERK1,2, PLC?1 e STAT3 ao nível do grupo controle e aumentou a expressão de TRPV1. Nossos resultados indicam que a atividade de PKR desempenha papel essencial na hiperalgesia térmica induzida por infecção pelo HSV1 / Double stranded RNA-activated protein kinase (PKR) is a sentinel molecule activated by cellular stress conditions, including viral infections. PKR activation by phosphorylation triggers cascades involved in inflammatory response and protein synthesis suppression. Our previous data suggest that PKR is involved in the inflammatory thermal hyperalgesia. Here we investigated the role played by PKR on thermal hyperalgesia induced by herpes simplex virus type-1 (HSV-1), during herpetic and post-herpetic phases, by combining behavioral, genetic, pharmacological, and molecular methods. Adult male C57bl/6, PKR+/+ and PKR-/- mice were inoculated with HSV-1. Control groups were inoculated with inactive (mock) HSV1. Mechanical allodynia and thermal hyperalgesia were monitored before virus inoculation and 8, 14, 21, and 28 days post-inoculation. The dose- and timeresponse curve and the capsaicin test were performed at 8th and 21st days post virus inoculation. Also in the herpetic and post-herpetic periods, was investigated the expression profile of proteins involved in the PKR signaling pathways (PKR, eIF2?, PACT, IKK and PP2A?), and the effect of PKR inhibition by monitoring PKR, IKK?/?, P38, JNK, ERK1,2, and STAT3 phosphorylation, and Ca-MKII? and TRPV1 expression in the dorsal root ganglia (L3-L6) ipsilaterally to the inoculated paw. Mechanical allodynia and thermal hyperalgesia became evident until 28 days postinnoculation. PKR-/- mice developed mechanical allodynia but not thermal hyperalgesia, when compared with PKR+/+ mice. Systemic PKR inhibition reversed thermal hyperalgesia in a dose and time-dependent manner, and prevented the capsaicin-induced nocifensive behavior, whereas PKR-/- showed no nocifensive behavior almost absent in both herpetic and post-herpetic phases. There was increased expression of PP2A? and the phosphorylation of PKR, IKK?/?, and eIF2?, during herpetic and post-herpetic periods, and PACT in the post-herpetic phase. PKR inhibition increased P38 phosphorylation in both phases, and reduction of PLC?1 phosphorylation together with the return of the Akt and STAT3 phosphorylation to the control group level, and enhanced Ca-MKII? expression in the herpetic phase. At the post-herpetic phase, suppressed JNK and Akt, and Ca-MKII? expression returned ERK1,2, PLC?1 and STAT3 phosphorylation to control group level and increased TRPV1 expression. The data indicate that PKR activity plays an essential role in the HSV-1 infection-induced thermal hyperalgesia