Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T08:32:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_Luciana_M.pdf: 438742 bytes, checksum: a5f9e3b963ae7457238c742a983b8733 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Aeromonas são bacilos Gram-negativos, anaeróbios facultativos, ermentadores, oxidase e catalase positivos, ubíquos em ambientes aquáticos e capazes de causar uma variedade de doenças em humanos, principalmente gastroenterite. As espécies mais comumente associadas com infecções em humanos são A. hydrophila, A.caviae e A. veronii biovar sobria. Entre os vários fatores de virulência descritos, Aerolisina é considerada um dos principais fatores de virulência do genero Aeromonas, sendo esta além de provocar a lise em eritrócitos de carneiro tem atividade enterotóxica. Recentemente foi descrito pelo nosso uma enterotoxina citotóxica denominada Fator Citotóxico Vacuolizante (VCF), diferente de Aerolisina biologica e molecularmente, no sobrenadante da cultura de Aeromonas veronni biovar sobria, isoladas de casos clinicos. O VCF purificado apresentou atividade citotóxica em linhagens de células tumorais humanas tais como, HEp-2, Caco-2, HeLa e NCI-H 292. No ensaio de efeito anti-proliferativo o VCF apresentou potencial atividade de inibição de crescimento de células tumorais NCI-ADR/RES, uma linhagem celular com resistência a múltiplas drogas de quimioterapia e K562, uma linhagem de células leucêmicas. Estes resultados sugerem que o VCF apresenta potencial toxigênico sobre células tumorais de origem humana / Abstract: Aeromonas is a Gram-negative, facultative anaerobic rod, fermenting, oxidase and catalase positive ubiquitous in fresh and brackish water and capable of causing several human diseases, specially gastroenteritis. The most important pathogens species associated with human infections are A. hydrophila, A. caviae, and A. veronii biovar sobria. Between the several virulence factors described, Aerolisin is considered as one of the main virulence factors of the Aeromonas genus, this one causing lysis in lamb erythrocytes and has an enterotoxic activity. Was recently described by our a citotoxic enterotoxin named as Vacuolating Cytotoxic Factor (VCF), differing biologicaly and molecularly from the Aerolisin, at the supernatant of a culture of A. veronii biovar sobria, isolated from clinic cases. The purified VCF presented citotoxic activitiy on lineages of human tumorous cells such as , HEp-2, Caco-2, HeLa and NCI-H 292. On the test antiproliferative effect the VCF presented a potencial activity of growth inhibition on tumour cells NCI-ADR/RES, a cellular lineage with resistance to multiple chemotherapy drugs and K562, a lineage of leukemic cells. This results sugests that the VCF presents toxigenic potencial over human tumorous cells / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Estreptococos do grupo B (EGB) comumente colonizam adultos saudáveis, sem sintomas, mas sob certas circunstâncias possui a capacidade de invadir tecidos do hospedeiro, evadir da detecção imunológica e causar doenças invasivas graves. Por conseguinte, os EGB continuam sendo uma das principais causas de mortalidade neonatal, pneumonia, sepse e meningite. Contudo, a patogênese desta infecção ainda está pouco elucidada. O sorotipo V é freqüentemente associado à doença invasiva em mulheres adultas não gestantes e o segundo mais prevalente em mulheres grávidas. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a aderência, invasão e persistência intracelular de amostras pertencentes ao sorotipo V (88641-vagina/portador e 90186-sangue/paciente) usando as células epiteliais respiratórias A549. As amostras de EGB demonstraram capacidade de aderir e invadir as células epiteliais A549, mas somente a amostra 90186-sangue apresentou maior invasão quando comparada com a de vagina (P <0.001). Ambas as amostras demonstraram persistência intracelular sem replicação no interior das células A549. Apenas o isolado 90186-sangue sobreviveu dentro das células epiteliais até 24h de incubação (P <0,05). A fusão dos lisossomas das células epiteliais com vacúolos contendo bactérias foi observada em células A549 tratadas com Lyso Tracker Grenn DND-26 para todas as amostras testadas. Nossos dados indicam pela primeira vez que as amostras viáveis do sorotipo V permanecem dentro de vacúolos ácidos epiteliais. Curiosamente, a amostra 90186- sangue induziu vacuolização celular e a amostra 88641-vagina promoveu a morte celular após 7h de incubação. Finalmente, nossos resultados aumentam o nosso conhecimento sobre eventos celulares da fagocitose e da patogênese das doenças invasivas promovidas pelos EGB. / Group B Streptococcus (GBS) commonly colonizes healthy asymptomatic adults, yetunder certain circumstances displays the ability to invade host tissues, evade the immune system and cause serious invasive disease. Consequently, GBS remains the major cause of neonatal pneumonia, sepsis and meningitis. However, the pathogenesis of this infection is poorly understood. The serotype V is frequently associated with invasive diseases in non-pregnant adults and the second most prevalent in pregnant women. The aim of this work was to study the adherence; invasion and persistence intracellular of the GBS serotype V (88641-vagina/carriers and 90186-blood/patient) in epithelial cells A549. All GBS strains showed ability to adhere and invade the epithelial A549 cells, but GBS 90186-blood was more invasive than the vagina isolate (P<0,001). Both strains persisted intracellular, but without replicating into the A549 cells. Only 90186-blood strain survived within epithelial cells even after a 24h incubation (P<0,05). Fusion of epithelial lysosomes with bacteria containing phagocytic vacuoles was observed in A549 cells treated with Lysotracker Grenn DND-26 for all strains tested. Our data indicate for the first time that viable strains of serotype V remain within acidic epithelial vacuoles. Interestingly, the 90186-blood strain induced cellular vacuolization and 88641-vagina strain caused cell death after 7h incubation. Lastly, our results increase our knowledge about cellular events of phagocytosis and pathogeneses of GBS diseases.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Estreptococos do grupo B (EGB) comumente colonizam adultos saudáveis, sem sintomas, mas sob certas circunstâncias possui a capacidade de invadir tecidos do hospedeiro, evadir da detecção imunológica e causar doenças invasivas graves. Por conseguinte, os EGB continuam sendo uma das principais causas de mortalidade neonatal, pneumonia, sepse e meningite. Contudo, a patogênese desta infecção ainda está pouco elucidada. O sorotipo V é freqüentemente associado à doença invasiva em mulheres adultas não gestantes e o segundo mais prevalente em mulheres grávidas. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a aderência, invasão e persistência intracelular de amostras pertencentes ao sorotipo V (88641-vagina/portador e 90186-sangue/paciente) usando as células epiteliais respiratórias A549. As amostras de EGB demonstraram capacidade de aderir e invadir as células epiteliais A549, mas somente a amostra 90186-sangue apresentou maior invasão quando comparada com a de vagina (P <0.001). Ambas as amostras demonstraram persistência intracelular sem replicação no interior das células A549. Apenas o isolado 90186-sangue sobreviveu dentro das células epiteliais até 24h de incubação (P <0,05). A fusão dos lisossomas das células epiteliais com vacúolos contendo bactérias foi observada em células A549 tratadas com Lyso Tracker Grenn DND-26 para todas as amostras testadas. Nossos dados indicam pela primeira vez que as amostras viáveis do sorotipo V permanecem dentro de vacúolos ácidos epiteliais. Curiosamente, a amostra 90186- sangue induziu vacuolização celular e a amostra 88641-vagina promoveu a morte celular após 7h de incubação. Finalmente, nossos resultados aumentam o nosso conhecimento sobre eventos celulares da fagocitose e da patogênese das doenças invasivas promovidas pelos EGB. / Group B Streptococcus (GBS) commonly colonizes healthy asymptomatic adults, yetunder certain circumstances displays the ability to invade host tissues, evade the immune system and cause serious invasive disease. Consequently, GBS remains the major cause of neonatal pneumonia, sepsis and meningitis. However, the pathogenesis of this infection is poorly understood. The serotype V is frequently associated with invasive diseases in non-pregnant adults and the second most prevalent in pregnant women. The aim of this work was to study the adherence; invasion and persistence intracellular of the GBS serotype V (88641-vagina/carriers and 90186-blood/patient) in epithelial cells A549. All GBS strains showed ability to adhere and invade the epithelial A549 cells, but GBS 90186-blood was more invasive than the vagina isolate (P<0,001). Both strains persisted intracellular, but without replicating into the A549 cells. Only 90186-blood strain survived within epithelial cells even after a 24h incubation (P<0,05). Fusion of epithelial lysosomes with bacteria containing phagocytic vacuoles was observed in A549 cells treated with Lysotracker Grenn DND-26 for all strains tested. Our data indicate for the first time that viable strains of serotype V remain within acidic epithelial vacuoles. Interestingly, the 90186-blood strain induced cellular vacuolization and 88641-vagina strain caused cell death after 7h incubation. Lastly, our results increase our knowledge about cellular events of phagocytosis and pathogeneses of GBS diseases.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estreptococos do grupo B (EGB), principalmente sorotipo III são a principal causa de pneumonia neonatal, sepse e meningite. O potencial de virulência das amostras de EGB pode determinar a colonização ou a infecção do hospedeiro. Como o pulmão constitui uns dos primeiros órgãos durante o processo de invasão sistêmica por EGB, nós decidimos investigar os mecanismos de adesão e invasão de amostras do sorotipo III (90356-líquor e 80340-vagina) com linhagem de células epiteliais do pulmão humano (A549). Desta forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de aderência e invasão de duas amostras de EGB sorotipo III com células de epiteliais pulmonares A549, a persistência bacteriana intracelular, a fusão com compartimentos acídicos, potencial citotóxico e indução de apoptose. As amostras mostraram capacidade de aderir e invadir o epitélio pulmonar A549, onde a amostra 90356-líquor isolada de paciente a que apresentou maior propriedade adesiva e invasiva que a amostra 80340-vagina (p<0,05). Ambas as cepas mostraram persistência intracelular sem replicação no interior do epitélio respiratório até 24h de incubação. Além disso, verificamos que os EGB são capazes de promover vacuolização celular permanecendo viáveis dentro de vacúolos acídicos, sugerindo a ocorrência de fusão lisossomo-fagossomo. A amostra 90356-líquor também mostrou maior citotoxidade quando comparada com a amostra 80340-vagina. A análise por citometria de fluxo demonstrou, pela primeira vez, que o EGB induz apoptose em epitélio respiratório, podendo representar um mecanismo importante para o desenvolvimento da lesão celular aguda e a patogênese bacteriana. / Group B streptococci (GBS), mainly serotype III, is a major cause of neonatal pneumonia, sepsis and meningitis. Virulence potential of GBS strains may determine the outcome of host colonization or infection. Because the lung constitutes a first step in GBS systemic invasion processes, we have investigates the adherence and invasion mechanisms of GBS-III isolates to human lung epithelial cell line (A549). Thus, the main objective of this study was to evaluate the ability of adhesion and invasion of GBS strains serotype III (90356-liquor and 80340-vagina) with A549 lung epithelial cells, intracellular bacterial persistence, fusion with acidic compartments, cytotoxic potential, and induction of apoptosis. The strains showed ability to adhere and invade the epithelial A549 cells; GBS 90356-liquor isolated from a patient showed a more efficient adherence and invasion properties than GBS-III 80340 isolated from vagina (P<0,05). Both strains showed persistent intracellular viability without replication into A549 cells up to 24h incubation. In addition, we found that GBS are able to promote cellular vacuolization and persisted viable inside acidic vacuoles, suggesting lysosome-phagosome fusion. The GBS 90356-líquor also showed higher cytotoxicity when compared with 80340-vagina strain. The present work describe for first time by flow cytometry that GBS induces apoptosis in respiratory epithelium and be an important mechanism for the development of acute cellular injury and bacterial pathogenesis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estreptococos do grupo B (EGB), principalmente sorotipo III são a principal causa de pneumonia neonatal, sepse e meningite. O potencial de virulência das amostras de EGB pode determinar a colonização ou a infecção do hospedeiro. Como o pulmão constitui uns dos primeiros órgãos durante o processo de invasão sistêmica por EGB, nós decidimos investigar os mecanismos de adesão e invasão de amostras do sorotipo III (90356-líquor e 80340-vagina) com linhagem de células epiteliais do pulmão humano (A549). Desta forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de aderência e invasão de duas amostras de EGB sorotipo III com células de epiteliais pulmonares A549, a persistência bacteriana intracelular, a fusão com compartimentos acídicos, potencial citotóxico e indução de apoptose. As amostras mostraram capacidade de aderir e invadir o epitélio pulmonar A549, onde a amostra 90356-líquor isolada de paciente a que apresentou maior propriedade adesiva e invasiva que a amostra 80340-vagina (p<0,05). Ambas as cepas mostraram persistência intracelular sem replicação no interior do epitélio respiratório até 24h de incubação. Além disso, verificamos que os EGB são capazes de promover vacuolização celular permanecendo viáveis dentro de vacúolos acídicos, sugerindo a ocorrência de fusão lisossomo-fagossomo. A amostra 90356-líquor também mostrou maior citotoxidade quando comparada com a amostra 80340-vagina. A análise por citometria de fluxo demonstrou, pela primeira vez, que o EGB induz apoptose em epitélio respiratório, podendo representar um mecanismo importante para o desenvolvimento da lesão celular aguda e a patogênese bacteriana. / Group B streptococci (GBS), mainly serotype III, is a major cause of neonatal pneumonia, sepsis and meningitis. Virulence potential of GBS strains may determine the outcome of host colonization or infection. Because the lung constitutes a first step in GBS systemic invasion processes, we have investigates the adherence and invasion mechanisms of GBS-III isolates to human lung epithelial cell line (A549). Thus, the main objective of this study was to evaluate the ability of adhesion and invasion of GBS strains serotype III (90356-liquor and 80340-vagina) with A549 lung epithelial cells, intracellular bacterial persistence, fusion with acidic compartments, cytotoxic potential, and induction of apoptosis. The strains showed ability to adhere and invade the epithelial A549 cells; GBS 90356-liquor isolated from a patient showed a more efficient adherence and invasion properties than GBS-III 80340 isolated from vagina (P<0,05). Both strains showed persistent intracellular viability without replication into A549 cells up to 24h incubation. In addition, we found that GBS are able to promote cellular vacuolization and persisted viable inside acidic vacuoles, suggesting lysosome-phagosome fusion. The GBS 90356-líquor also showed higher cytotoxicity when compared with 80340-vagina strain. The present work describe for first time by flow cytometry that GBS induces apoptosis in respiratory epithelium and be an important mechanism for the development of acute cellular injury and bacterial pathogenesis.