Es wurde überprüft, ob sich Zusammenhänge zwischen der Tumordurchblutung und Vaskularisation nachweisen lassen, ob Unterschiede in der Durchblutung zwischen malignen und benignen Herdbefunden der Brust gemessen werden können, ob sich aus der Tumordurchblutung und Vaskularisation Aussagen zur Prognose der Patientin ableiten lassen und ob sich die Durchblutung und Vaskularisation unter der präoperativen Chemotherapie bei Mammakarzinomen ändert. Die CD war im direkten Vergleich nicht der Mammographie und der konventionellen B-Bild-Mammasonograpie überlegen. Mit verschiedenen Parametern der Kontrastmittel-Videodensitometrie, wie die Zeiten bis zum maximalen Signalanstieg (Tmax) mit dem Kontrastmittel Levovist(, konnte mit einer Spezifität von bis zu 92% sicher zwischen benignen und malignen Herdbefunden unterschieden werden. Mit der Videodensitometrie war es im Gegensatz zum konventionellen CD möglich, Veränderungen der Durchblutung von Mammakarzinomen unter einer präoperativen Chemotherapie durch die Änderung der Kontrastmittelkinetik zu erkennen. Bei den kleinlumigen Gefäßen korrelierten gefäßmorphologische Parametern mit den klassischen Prognoseparametern (Lymphknotenstatus) und der Durchblutung. Selbst unter einer effektiven Chemotherapie, die auch zu einer histologischen Regression geführt hat, veränderten sich die Vaskularisationsparameter nicht signifikant. / Various qualitative and semi-quantitative blood flow and vascularisation parameters were analyzed for their value in the fields of differential diagnosis, evaluation of prognosis, and of monitoring over the time of preoperative chemotherapy. Color Doppler sonography was not superior to other diagnostic methods for preoperative and prognostic assessment of a breast lesion. In contrast agent videodensitometry the values for Tmax were significantly higher for benign breast than for breast cancer. The combination of contrast agent and subsequent video-densitometry would be able to increase the specificity (92% in this investigation) of the diagnosis of breast cancer. Color Doppler can be used to image the blood supply in the smaller blood vessels. The vascularization and the blood flow of a breast carcinoma permits conclusions to be drawn as to the metastatic lymph-node status of a patient. There were only minimal changes of vascularisation visible even in patients with histological regression of breast cancer after preoperative chemotherapy.

Les chromophores classiques ne sont pas toujours efficaces en absorption à deux photons. Leur faible efficacité nécessite l'utilisation de fortes puissances laser et de grandes concentrations en colorants. Dans ce sens, la microscopie à deux photons in vivo requière le développement de nouvelles stratégies de marquage utilisant des chromophores spécialement dédiés à la microscopie à deux photons. Dans le cadre de collaborations avec des chimistes spécialisés dans la synthèse de molécules à forte section efficace d'absorption à deux photons, différents chromophores ont été synthétisés. Ces molécules organiques sont souvent hydrophobes et ne sont pas utilisables directement pour les applications en biologie. Le travail effectuer ici a consisté à encapsuler ces molécules dans des micelles de copolymères biocompatibles, les Pluronic. Les Pluronic sont des matériaux pouvant s'auto assembler en milieu aqueux sous forme de micelles et permettent de solubiliser des composés hydrophobes. Cette stratégie est déjà utilisé pour permettre de transporter différents composés hydrophobes dans les organismes vivants et a été utilisée ici pour transporter des chromophores ultrasensibles à deux photons dans le sang de manière à imager la vascularisation in vivo.

Notre approche biomimétique permet de régénérer une dent entière. Un protocole en deux étapes à partir de réassociations de cellules dentaires embryonnaires permet le développement de la couronne in vitro et, après implantation, la différenciation fonctionnelle des cellules, l’initiation du développement radiculaire et la vascularisation dentaire. Cependant, l’absence d’innervation a nécessité des expériences complémentaires :- La co-implantation de réassociations cellulaires avec un ganglion trigéminal permet la croissance d’axones autour de la dent formée, mais pas dans le mésenchyme dentaire.- Pour tenter de résoudre ce problème, la régénération axonale a été testée dans un contexte immunodéprimé en utilisant la cyclosporine A (CsA). Dans ces conditions, des fibres nerveuses entrent dans la pulpe dentaire, jusqu’aux odontoblastes. Cependant, la CsA a aussi un effet direct sur la croissance axonale.- Des co-implantations chez des souris immunodéprimées (Nude) montrent que l’immunomodulation seule suffit pour l’innervation de la dent.- Dans la dent, les axones assurent différentes fonctions en interagissant avec les cellules voisines. Les relations entre axones et autres cellules (odontoblastes, cellules endothéliales, péricytes et cellules gliales) ont été analysées dans les mésenchymes dentaire et péri-dentaire de réassociations implantées et comparées à ce que l’on observe pour une molaire physiologique à un stade similaire.Ce travail décrit les conditions permettant l’innervation des dents régénérées. Des expériences préliminaires encourageantes ont été réalisées avec des cellules souches pour remplacer la CsA. / Our biomimetic approach allowed the regeneration of a whole tooth. Using embryonic dental cells, a two-steps protocol allowed crown formation in vitro and, after implantation, functional cells differentiation, initiation of root formation and tooth vascularization. However, the teeth were not innervated, which led to complementary experiments:- The co-implantation of cell re-associations with a trigeminal ganglion allowed axonal growth around the forming teeth, but not in the dental mesenchyme. - To try to solve this point, axonal regeneration was tested in immunodepressed conditions, using cyclosporin A (CsA). In these conditions, nerve fibers entered the dental pulp and reached odontoblasts. However, CsA shows multiple effects, including direct ones on nerve growth. - Co-implantations were performed in immunocompromised Nude mice allowed axons to reach the odontoblast layer, thus showing that immunomodulation is sufficient.- Axons in the dental mesenchyme interfere with several functions by interacting with neighbor cells. Relationships between axons and other cells (odontoblasts, endothelial cells, pericytes and glial cells) were analyzed in the peridental and dental mesenchymes of implanted reassociations and compared to the physiological situation in developing molars at similar stage. This work describes conditions allowing the innervation of engineered teeth. Preliminary encouraging attempts have been made to replace CsA by using stem cells.

La dystrophine Dp71, issue du gène DMD impliqué dans la dystrophie musculaire de Duchenne intervient dans le maintien de l'homéostasie rétinienne et de la barrière hémato-rétinienne. Nous avons mis en évidence une localisation rétinienne jusque-là méconnue de la Dp71 au sein des astrocytes rétiniens. Nous avons également étudié l'effet in vivo de l'absence de Dp71, sur le développement vasculaire et observé une plus faible densité et une morphologie astrocytaire différente comparativement aux souris contrôles, à l'origine d'un développement vasculaire retardé. Compte tenu de la spécificité du réseau vasculaire rétinien dont l'étanchéité des parois est maintenue en partie par les pieds des CGM et des astrocytes, nous avons émis l'hypothèse, étant donné l'implication de la Dp71 dans la stabilisation de ces cellules, d'une altération de cette protéine dans les phénomènes de rupture de la BHR. Ainsi dans un modèle transitoire de rupture de la BHR in vivo relativement " pur ", sans ischémie ni injection de VEGF, nous avons observé une diminution de l'expression de la dystrophine Dp71 ainsi que du canal aqueux AQP4 et une délocalisation du canal potassique Kir4.1 dans les CGM. L'injection intra-vitréenne de Dexaméthasone dans ce modèle a permis de prévenir les modifications d'expression et de localisation de ces protéines. / Dp71, a dystrophin produced from DMD gene, is involved in retinal homeostasis and maintenance of blood retinal barrier. We have previously shown that Dp71, part of a complex called Dystrophin associated protein, is involved in the localization of aqueous and potassic channels in Muller glial cell (MGC), particularly around blood vessels, allowing maintenance of retinal homeostasis. Based on the knowledge that growing retinal vessels migrate on an astrocyte template during development, we highlighted the expression of Dp71 in retinal astrocytes. In absence of Dp71, in vivo, we observed a lower density and a different morphology of retinal astrocytes compared to control retina in mice, responsible for a delayed vascular development. Due to the role of barrier of the retinal vascular network, insured also by astrocytes, we studied a model of post surgical BRB breakdown and found a decreased of Dp71 protein expression associated with Kir4.1 delocalization and AQP4 decrease in MGC. Intravitreal Dexamethasone prevents these protein expression changes. We suggest here that the membrane associated cytoskeletal protein, Dp71, expressed in astrocytes is involved in the maintenance of astrocytes density and morphology necessary as a template for retinal vascular development. This protein insure also a key role in retinal homeostasis by localizing and maintaining aqueous and potassic channels in MGC. Moreover when this protein is altered, Dexamethasone seems to be capable to promote Dp71 expression which could have wide clinical implications in retinal diseases treatment and the target for retinal neuroprotection under pathological conditions seems to be the macroglial cells.

La régénération après une lésion de la moelle épinière (ME) est abortive. Elle est du à une cascade d'événements cellulaires et moléculaires, dont la rupture de la barrière hémato-encéphalique, une inflammation persistante, une cicatrice gliale et la formation d'une cavité, combinée à la présence de molécules inhibitrices pour la repousse. Actuellement, aucune thérapie n'est efficace, mais le design de biomatériaux implantables pourrait permettre leur développement. L'hydrogel de chitosane (hCh) apparait prometteur, notamment grâce à la modulation de ses propriétés biologiques, notamment en modifiant son degré de déacétylation (DA). J'ai donc testé, dans une hémisection dorsale de la ME de rat, différentes formulations d'hCh fragmenté et examiné leur capacité à s'intégrer dans le tissu hôte lésé, sans produire une inflammation ou une réaction astrocytaire excessive. Mon travail montre que l'implantation de fragments d'hCh avec un DA de 4% est favorable à la reconstruction du tissu, en attirant différents types cellulaires et en recréant une vascularisation fonctionnelle. Il permet aussi de moduler la réponse inflammatoire, en favorisant une polarisation des macrophages en un phénotype M2. La cicatrice gliale est aussi réduite et les processus astroytaires s'orientent vers l'implant, en s'associant aux axones qui régénèrent et caractérisés par traçage axonale et immunohistochimie. Plusieurs sont myélinisés ou entourés par des cellules de Schwann, au moins jusqu'à 10 semaines après la lésion. Enfin, le remodelage structural est associé à une récupération locomotrice significative. / Regeneration after traumatic spinal cord injury generally fails due to a cascade of cellular and molecular events, including blood-spinal cord barrier breakdown,persistent and uncontrolled inflammation, and glial scarring and cavity formation combined with the presence of axon growth-inhibitory molecules. While efficient therapies are still lacking, recent progress in the design of implantable biomaterials may well open up new possibilites for their development. Chitosan hydrogels (hCh) seem particularly promising as their biological properties can be fine-tuned, notably by their degree of acetylation (DA). In the context of a rat dorsal spinal cord hemisection, I have tested different formulations of fragmented hCh for their ability to integrate into lesioned host tissue without creating additional inflammation, or excessive astrocytic reaction. Thus, I found that implantation of hCh particles of 4% DA allows for tissue reconstruction by attracting different cell types and recreating a functional vasculature. Importantly, it modulates the inflammatory response, favoring polarization of invading macrophages towards the M2 phenotype. In lesioned-implanted animals, the glial scar is less fibrous, astrocyte processes are mainly oriented towards the lesion and accompany a robust regrowth of fibers, whose origin was identified by axon tracing and immunohistochemistry. Many of these fibers are myelinated or ensheathed by Schwann cells, maintained at long term in the implant. Finally, this structural remodeling is associated with significant, long-lasting recovery of locomotor function, as I have shown by open-field and gait analysis.

Dans des études animales, nous avons étudié le développement des métastases osseuses, leur vascularisation ainsi que des biomatériaux de comblement ou pouvant cibler l'angiogenèse. Nous avons utilisé le poly 2-hydroxyéthyl méthacrylate (pHEMA) connu pour sa biocompatibilité, pour fabriquer des microbilles fluorescentes portant à leur surface des charges anioniques ou cationiques. Les microbilles ont été incubées avec une lignée de cellules endothéliales qui internalisent de préférence les microbilles portant une charge anionique. Un silicone radio-opaque a été utilisé pour caractériser l'architecture en 3D des vaisseaux sanguins à différents stades d'évolution des métastases osseuses chez le rat. Nous avons montré au niveau des os tumoraux une hypervascularisation et une désorganisation importante de l'architecture vasculaire avec un réseau très dense de micro vaisseaux à l'aspect tortueux s'étendant dans toute la zone trabéculaire, envahissant la corticale et la diaphyse en sens rétrograde. Dans une autre étude, l'acide zolédronique, un puissant bisphosphonate ayant aussi un effet anti-angiogénique, a été utilisé de façon préventive dans un modèle de métastase osseuse chez le rat. Il permet la conversion des métastases du carcinome MatLyLu, initialement ostéolytiques, en formes ostéocondensantes en limitant les perforations corticales. Enfin, chez le lapin, dans un modèle de comblement osseux par le bêta tricalcium phosphate (β−TCP), nous avons montré que des anti-inflammatoires non stéroïdiens, utilisés en chirurgie osseuse, ne retardent pas l'ostéogenèse au contact du biomatériau. La vascularisation joue un rôle important dans le remodelage osseux normal mais aussi dans les ostéopathies bénignes et malignes ainsi que dans l'ostéointégration des biomatériaux utilisés pour le traitement des pertes de substance osseuse.

Pre-cellularised scaffolds are limited in volume due to the constraints of the time delay required for angiogenic cells ingrowth forming a vascular network and allowing for delivery of nutrients and waste exchange. Channels have the potential to improve the time taken for cellular penetration. The effectiveness of channels in improving angiogenic cells penetration was assessed in vitro and in vivo in porous 3-D collagen scaffolds. Initial studies conducted in vitro demonstrated that the scaffolds supported angiogenic cells ingrowth in culture and the channels improved the depth of penetration of cells into the scaffold. The cells reside mainly around the channels and migrate along the channels. In vivo, channels increased cell migration into the scaffolds and in particular angiogenic cells resulting in a clear branched vascular network of micro vessels in the channelled samples which was not apparent in the non-channelled samples. This correlated well with macrophage invasion into scaffolds since angiogenesis in vivo is usually accompanied by infiltration of macrophages which participate in organization of angiogenesis, and in regulation of tissue regeneration. Thus, macrophage-mediated biodegradation of collagen scaffolds in vitro was also assessed. Furthermore, pre-seeding channelled collagen scaffolds with endothelial cells implantation has potential of speeding up vascularisation of scaffolds compared to human bone marrow stromal cells.

La bronchiolite oblitérante (BO) est la principale cause de décès à long terme après transplantation pulmonaire. La BO se manifeste par une diminution des capacités respiratoires liée à l’obstruction des petites voies aériennes par un tissu inflammatoire et fibroprolifératif. Dans cette thèse nous avons étudié l’hypothèse de l’implication de la kinase nucléaire MSK1 dans la BO. Nous avons utilisé la transplantation hétérotopique de trachée comme modèle murin de BO. La pertinence du choix de ce modèle a été confirmée par l’étude de la re-vascularisation fonctionnelle de la greffe après transplantation. Dans ce modèle nous avons montré une augmentation de l’expression et de l’activité de MSK1 pendant le développement de la BO. Le traitement des souris transplantées avec des inhibiteurs pharmacologiques de MSK1 a permis d’inhiber l’inflammation et la fibroprolifération, montrant le rôle de MSK1 dans la BO. Nous avons également mis en place un essai de criblage utilisant la technologie HTRF pour rechercher de nouveaux inhibiteurs de MSK1. Les résultats décrits dans cette thèse, montrent que la kinase MSK1 est une potentielle cible thérapeutique pour combattre la BO. / Obliterative bronchiolitis (OB) is the chronic rejection after lung transplantation and is the main cause for late death post-transplantation. OB is characterized by decrease of the pulmonary function caused by obstruction of the small airways by inflammatory and fibroproliferative tissue. We studied the hypothesis of the implication of the nuclear kinase MSK1 in the OB. The relevance of the model was demonstrated by showing the rapid functional re-vascularization of the graft. In this model the allograft, shows an increased MSK1 expression and activity. We therefore treated mice with pharmacological inhibitors of the MSK1 activity and we demonstrated an inhibition of the inflammation and the fibroproliferation during OB. We next set up an enzymatic assay using the heterogeneous time-resolved fluorescence, to proceed for a screening for new MSK1 inhibitors. In summary, this study proposed MSK1 as potential therapeutic target to combat OB.

Le N-acétylcolchinol est un composé hémi-synthétique connu pour inhiber la polymérisation de la tubuline en microtubules. Il a montré une activité prometteuse en tant qu’agent ciblant la vascularisation tumorale, cependant, sa cardiotoxicité a conduit à l’arrêt des essais cliniques en phase I. Cette thèse porte sur la synthèse et l'évaluation biologique de nouveaux allocolchicinoïdes, composés analogues du N-acétylcolchinol. Dans un premier temps, une nouvelle voie de synthèse permettant l’accès, de façon racémique, au squelette dibenzoxépine de ces molécules a été mise au point. Elle comprend notamment trois étapes clés, un couplage de Suzuki-Miyaura, une addition de Grignard et une cyclodéshydratation effectuée en présence d’un acide de Brønsted. Par la suite, trois séries d’allocolchicinoïdes de structures variées, que ce soit au niveau du cycle médian oxépine ou des substituants présents sur les noyaux benzéniques, ont été synthétisées. L’activité sur tubuline de la plupart de ces molécules a été évaluée, ce qui a conduit à une rationalisation des relations structure-activité. / N-acetylcolchinol is a semi-synthetic inhibitor of the polymerization of tubulin into microtubules, that showed promising activity as vascular-disrupting agent. However, its toxicity evidenced in phase I clinical trials precluded its further development. This thesis describes the synthesis and biological evaluation of new allocolchicinoids, analogues of N-acetylcolchinol.A racemic synthesis of the dibenzoxepine framework of these compounds was first established. A Suzuki-Miyaura coupling, a Grignard addition and a Brønsted acid-mediated cyclodehydration constituted the key steps of the strategy. Then, three different series of dibenzoxepines have been synthesized, which differ by the nature of the substituent on the oxepine medium ring and on phenyl rings. These new dibenzoxepines were tested against the inhibition of microtubule assembly, leading to a structure-activity relationship study.

Il a été démontré que l’acidité de l’environnement tumoral jouait un rôle dans la résistance aux chimiothérapies. L’utilisation de nanovecteurs, tels que les nanocapsules lipidiques (LNC), permet non seulement d’améliorer le temps de biodistribution de substances actives, mais aussi de cibler l’environnement tumoral tout en protégeant les actifs de cet environnement acide. L’objectif de cette thèse porte ainsi sur l’optimisation et l’évaluation de LNC furtives et pH-sensibles dans le contexte du mélanome.Dans un premier temps, ces travaux ont consisté à caractériser la vascularisation de mélanomes humain et murin. Ces études ont permis de comparer différentes tumeurs (densité, taille et structure) et de déterminer si l’usage de nanomédecines est approprié dans ce contexte.La seconde partie s’est orientée sur l’élaboration de polymères combinant furtivité et pH-sensibilité. Ces copolymères composés de N-vinylpyrrolidone (NVP)et de vinylimidazole ont été synthétisés par polymérisation RAFT et post-insérés à la surface des LNC. Ces modifications ont donné lieu à des LNC présentant des charges de surface pH-dépendantes,entrainant une augmentation de leur internalisation à pH acide dans des cellules de mélanome. Finalement, des études de biodistribution ont mis en évidence l’intérêt de la NVP dans le développement de nanovecteurs furtifs. En conclusion, les copolymères développés ont permis de prolonger le temps de circulation, mais aussi d’apporter des propriétés pH-sensibles qui pourraient améliorer l’internalisation tumorale des LNC in vivo et donc de potentialiser l’effet d’une thérapie anticancéreuse. / Tumor acidity has been shown to play a major role in resistance to chemotherapy. The use of nanomedicines, as lipid nanocapsules (LNC), allows to protect drugs from this acidic environment. They can also improve the biodistribution of therapeutics and to target the tumor environment. The aim of this thesis concerns the evaluation and characterization of stealth and pH-sensitive LNC in the context of melanoma. Firstly, these works consisted in characterizing the vascularization of human and mice melanoma. These studies allowed to compare different tumors (density, size and structure), and determine if the used of nanocarrier is suitable in the context of melanoma.The second part of this thesis described the development and the characterization of new copolymers, combining stealth and pH-sensitive properties. These copolymers, composed of Nvinylpyrrolidone(NVP) and vinylimidazole, were synthesized by RAFT polymerization and were post in sertedonto LNC surface. These modifications allowed to obtain charge reversal nanocarriers, leading to increase their melanoma cell uptake underacid pH. Finally, biodistribution of these modified nanoparticles was studied in vivo and highlighted the interest of NVP in the development of stealth nanocarriers. To conclude, the developed copolymers able to extend nanocarrier circulation time and to provide pH-responsive properties which should increase the tumor internalization of LNC invivo and potentiate the effect of anticancer drugs.