Proefschrift Universiteit Maastricht. / Auteursnaam op omslag: Francy Crijns. Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Près de la moitié des patients atteints de sclérodermie systémique (ScS) présentent des troubles de la pigmentation cutanée. La mélanogenèse est sous la dépendance, outre les facteurs épidermiques, de facteurs dermiques produits par les fibroblastes et les cellules endothéliales. Parmi ces facteurs se trouve NOV (CCN3) (protéine appartenant à la même famille que CTGF (CCN2), protéine pro-fibrotique augmentée dans la ScS) qui aurait un rôle anti-fibrotique. Nous souhaitons ainsi disséquer le lien entre la composante fibrotique dermique et la pigmentation épidermique. Pour cela, des biopsies cutanées ont été réalisées chez 21 patients ScS, en zone lésionnelle (scléreuse avec ou sans trouble de pigmentation) et non lésionnelle pour 12 d’entre eux. Ces biopsies ont été séparées en 3 fragments qui ont été soit fixés pour analyses histologiques et immunohistochimiques, soit congelés à -80°C pour analyse protéomique ou transcriptomique, soit dissociés pour isoler les cellules cutanées afin de les analyser en protéomique ou transcriptomique. Des témoins de peau et des cellules saines sont utilisées en contrôle. Nous avons dégagé deux types de troubles pigmentaires : une hyperpigmentation s’apparentant à un photo-vieillissement, et une dépigmentation péri-folliculaire apparaissant de manière précoce. Les niveaux d’expression de CCN2 et CCN3 varient chez les patients en fonction des données cliniques, aussi bien au niveau protéique qu’au niveau immunohistochimique. S’il existe des différences en fonction de l’atteinte pigmentaire, il semble que dans les fibroblastes sclérodermiques, la balance CCN2/CCN3 soit déséquilibrée tant au niveau de la zone lésionnelle que cliniquement non lésionnelle, suggérant que CCN2 et 3 pourraient être dérégulés intrinsèquement ou à des stades précoces. Ce travail pourrait aboutir à l’identification d’un phénotype précoce basé sur l’atteinte pigmentaire, et au développement d’une thérapie basée sur la rééquilibration du ratio CCN2/CCN3. / Systemic Sclerosis (SSc) is a rare but potentially deadly connective tissue disease. Its pathophysiology remains partly unknown but combines auto-immunity, small and large vessels involvement and fibrosis of the connective tissue, affecting all organs. Skin features are considered as diagnostic and prognosis markers and include for some patients the presence of pigmentary disorders. In this work, we looked into pigmentary disorders in SSc and their relationship with the pathophysiology of the disease. First, we analyzed the presence of pigmentary disorders among a local cohort of 239 patients as well as their association with systemic involvement in the disease. We have found that diffuse hyperpigmentation was associated with an increased risk of vascular involvement in SSc, particularly digital ulcers. Then, we investigated the molecular basis behind this association. Proteins of the CCN (CYR61 / CTGF / NOV) family are multimodular proteins secreted in the extra-cellular matrix, where they take part in numerous biological processes, such as cell proliferation, adhesion, collagen secretion. Within this family, CCN3 (also called NOV) is a promising candidate, being implicated both in angiogenesis and epidermal homeostasis. We studied CCN3 expression in the skin of SSc patients presenting or not pigmentary disorders, as compared to healthy controls. We found that CCN3 expression was particularly decreased in the dermal vessels in situ, as well as in endothelial cells in vitro. CCN3 inhibition in endothelial cells resulted in altered angiogenesis in vitro, through a decrease in cell migration. We also studied CCN3 expression in SSc epidermis. SSc patients presenting hyperpigmentation exhibited decreased CCN3 in their melanocytes as well as increased CCN3 in their keratinocytes, compared to patients without pigmentary disorders. Overall, CCN3 represents a promising therapeutic lead for SSc patients with vascular involvement, which could bespotted early thanks to the presence of hyperpigmentation.

L’immunosuppression a permis d’améliorer l’incidence du rejet aigu sans toutefois améliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractérisé par une vasculopathie du greffon (VG) similaire à une forme accélérée d’athérosclérose native accompagnée de fibrose. La pathophysiologie de la VG découle de l’hypothèse de réponse à l’insulte proposée par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, l’endothélium stressé par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie l’apoptose endothéliale suivi d’une réponse de réparation vasculaire via un épaississement myo-intimal aux sites d’insultes. Toutefois, lorsque les stress endothéliaux initiaux demeurent soutenus, l’apoptose endothéliale et la réponse de réparation perpétuent. Compte tenu que l’inhibition de l’apoptose endothéliale bloque le développement de la VG in vivo, notre hypothèse de travail reposait sur les répercussions paracrines de l’apoptose endothéliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons généré un système expérimental in vitro afin d’induire l’apoptose endothéliale en absence significative de nécrose cellulaire. À l’aide d’une approche protéomique multidimensionnelle et comparative, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques exportent spécifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons démontré que certains de ces SPM ont des propriétés anti-apoptotiques (TCTP et EGF), d’autre fibrogénique (CTGF), récapitulant ainsi certains phénotypes cellulaires associés au développement de la VG. Parmi les médiateurs identifiés, 16 n’avaient pas de signal de sécrétion, incluant TCTP, suggérant que des mécanismes de sécrétion non conventionnels soient favorisés durant l’apoptose. Nous avons démontré que la caspase-3 effectrice régule la voie de sécrétion non classique exosomiale associée à l’export extracellulaire de nanovésicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, l’ensemble des données protéomiques ont permis d’émettre l’hypothèse qu’en réponse à un stress apoptotique, la cellule exporte différents médiateurs (solubles et vésiculaires) de manière non conventionnelle nécessitant la fusion d’organelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mécanisme serait régulé durant la phase effectrice de l’apoptose permettant ainsi d’initier une réponse de réparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protéique et nanovésiculaire légué durant l’apoptose endothéliale pourrait servir simultanément de biomarqueur de la VG et de cible thérapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique. / Immunosuppression regiments improved steadily the incidence of acute rejection with minimal positive effects on chronic rejection. The latter is characterized by a transplant vasculopathy (TV) similar to native atherosclerosis, accompanied with fibrosis throughout the vascular wall of the allograft. The pathophysiology associated to TV arose from pionnering work of Russell Ross in 1977. He proposed the 'Response to Injury' hypothesis revealing that endothelium injury initiated by immunological and non immunological factors favors a vascular repair response through neo-intima thickening at the sites of cellular injury. However, when endothelial insult is maintained, apoptosis ensues and the vascular repair process perpetuates. Since inhibition of endothelial apoptosis prevents TV development in vivo, we hypothesized that endothelial apoptosis regulates the vascular repair process through a paracrine program active on the cellular components of the vessel wall. We have generated an in vitro experimental system to induce endothelial apoptosis in absence of necrosis. Using a multifunctional and comparative proteomic approach, we have identified 27 post mortem signals (PMS) specifically exported by apoptotic endothelial cells. Some of these PMS display anti-apoptotic function (TCTP and EGF), whereas CTGF was identified as a fibrogenic factor, recapitulating the cellular events associated to the development of TV. Interestingly, 16 of these SPM did not contain a peptide signal, suggesting that non conventional secretion mechanisms could be favored during the effector phase of apoptosis. We demonstrated that activated caspase-3 regulates the exosomal secretion pathway associated to the export of nanovesicles TCTP +ve, anti-apoptotic and biochemically different from apoptotic blebs. Finally, the overall proteomic data generated a new hypothesis suggesting that in response to apoptotic stress, the cell exports different mediators (soluble and vesicular) by non conventional mechanism through the fusion of endocytic organelles and autophagic vacuoles with the plasma membrane, releasing their content into the extracellular milieu. This mechanism should be regulated during the effector phase of apoptosis favoring a vascular repair response only when cell’s demise reaches a point of no return. Therefore, these PMS could be used both as biomarkers of apoptosis or as biopharmaceutical targets to decrease the incidence of chronic vascular repair.

L’immunosuppression a permis d’améliorer l’incidence du rejet aigu sans toutefois améliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractérisé par une vasculopathie du greffon (VG) similaire à une forme accélérée d’athérosclérose native accompagnée de fibrose. La pathophysiologie de la VG découle de l’hypothèse de réponse à l’insulte proposée par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, l’endothélium stressé par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie l’apoptose endothéliale suivi d’une réponse de réparation vasculaire via un épaississement myo-intimal aux sites d’insultes. Toutefois, lorsque les stress endothéliaux initiaux demeurent soutenus, l’apoptose endothéliale et la réponse de réparation perpétuent. Compte tenu que l’inhibition de l’apoptose endothéliale bloque le développement de la VG in vivo, notre hypothèse de travail reposait sur les répercussions paracrines de l’apoptose endothéliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons généré un système expérimental in vitro afin d’induire l’apoptose endothéliale en absence significative de nécrose cellulaire. À l’aide d’une approche protéomique multidimensionnelle et comparative, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques exportent spécifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons démontré que certains de ces SPM ont des propriétés anti-apoptotiques (TCTP et EGF), d’autre fibrogénique (CTGF), récapitulant ainsi certains phénotypes cellulaires associés au développement de la VG. Parmi les médiateurs identifiés, 16 n’avaient pas de signal de sécrétion, incluant TCTP, suggérant que des mécanismes de sécrétion non conventionnels soient favorisés durant l’apoptose. Nous avons démontré que la caspase-3 effectrice régule la voie de sécrétion non classique exosomiale associée à l’export extracellulaire de nanovésicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, l’ensemble des données protéomiques ont permis d’émettre l’hypothèse qu’en réponse à un stress apoptotique, la cellule exporte différents médiateurs (solubles et vésiculaires) de manière non conventionnelle nécessitant la fusion d’organelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mécanisme serait régulé durant la phase effectrice de l’apoptose permettant ainsi d’initier une réponse de réparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protéique et nanovésiculaire légué durant l’apoptose endothéliale pourrait servir simultanément de biomarqueur de la VG et de cible thérapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique. / Immunosuppression regiments improved steadily the incidence of acute rejection with minimal positive effects on chronic rejection. The latter is characterized by a transplant vasculopathy (TV) similar to native atherosclerosis, accompanied with fibrosis throughout the vascular wall of the allograft. The pathophysiology associated to TV arose from pionnering work of Russell Ross in 1977. He proposed the 'Response to Injury' hypothesis revealing that endothelium injury initiated by immunological and non immunological factors favors a vascular repair response through neo-intima thickening at the sites of cellular injury. However, when endothelial insult is maintained, apoptosis ensues and the vascular repair process perpetuates. Since inhibition of endothelial apoptosis prevents TV development in vivo, we hypothesized that endothelial apoptosis regulates the vascular repair process through a paracrine program active on the cellular components of the vessel wall. We have generated an in vitro experimental system to induce endothelial apoptosis in absence of necrosis. Using a multifunctional and comparative proteomic approach, we have identified 27 post mortem signals (PMS) specifically exported by apoptotic endothelial cells. Some of these PMS display anti-apoptotic function (TCTP and EGF), whereas CTGF was identified as a fibrogenic factor, recapitulating the cellular events associated to the development of TV. Interestingly, 16 of these SPM did not contain a peptide signal, suggesting that non conventional secretion mechanisms could be favored during the effector phase of apoptosis. We demonstrated that activated caspase-3 regulates the exosomal secretion pathway associated to the export of nanovesicles TCTP +ve, anti-apoptotic and biochemically different from apoptotic blebs. Finally, the overall proteomic data generated a new hypothesis suggesting that in response to apoptotic stress, the cell exports different mediators (soluble and vesicular) by non conventional mechanism through the fusion of endocytic organelles and autophagic vacuoles with the plasma membrane, releasing their content into the extracellular milieu. This mechanism should be regulated during the effector phase of apoptosis favoring a vascular repair response only when cell’s demise reaches a point of no return. Therefore, these PMS could be used both as biomarkers of apoptosis or as biopharmaceutical targets to decrease the incidence of chronic vascular repair.

La sclérodermie (SSc) est une maladie rare affectant les personnes génétiquement prédisposées d’une réponse immunitaire défectueuse. Malgré les derniers avancements et développements dans le domaine, l’étiologie et la pathogénèse de la maladie demeurent peu comprises. Par ailleurs, il y a un ralentissement dans la compréhension de cette maladie à cause du manque de modèle animal représentatif de la SSc humaine. Malgré plusieurs lacunes, les souris traitées avec la bléomycine ou portant des modifications génétiques (TSK-1) sont très utilisées dans les études précliniques de la SSc mais elles ne présentent pas toutes les caractéristiques de cette maladie. Pour contribuer à la recherche sur la SSc, la stagiaire postdoctorale Dre Heena Mehta a développé dans le laboratoire du Dre Sarfati en collaboration avec le Dr Senécal, un modèle de souris expérimental induit par l’immunisation de cellules dendritiques (DCs) chargées de peptides de la protéine topoisomérase I (TOPOIA et TOPOIB). Dans le but de caractériser ce modèle murin et d’établir un profil immunitaire, j’ai concentré mes analyses principalement sur les caractéristiques de la SSc telles que la fibrose, l’inflammation, l’hyper-γ-globulinémie polyclonale, la vasculopathie ainsi que de l’expression de cytokines. Brièvement, l’immunisation de souris avec les DCs chargées avec la topoisomérase I (TOPOI) a induit l’inflammation pulmonaire et cutanée, en plus de la fibrose sous forme diffuse (dcSSc). Les souris présentaient également des symptômes de la vasculopathie ainsi que des taux élevés d’anticorps polyclonaux. Les résultats démontraient que les peptides TOPOIA étaient efficaces dans l’induction de la fibrose et de la réponse inflammatoire alors que les peptides TOPOIB étaient surtout impliqués dans la fibrose cutanée. En plus de nos résultats, les observations préliminaires sur le profil de cytokines tissulaires suggéraient que ce modèle pourrait remplacer ou complémenter les autres modèles animaux de SSc. / Systemic sclerosis (SSc) is a rare disease of unknown etiology that affects people that have a genetic predisposition to autoimmunity. Despite the latest advancement and development in the field, the mechanisms underlying disease development remain poorly understood. The lack of animal model that encompasses the cardinal features of human systemic sclerosis is a major cause of the slowdown in the understanding of this disease. In fact, some mouse models such as the bleomycin induced-SSc and TSK-1 mouse are widely used in preclinical studies of scleroderma. However, these models have several shortcomings since these mice do not display all the cardinal features of the disease found in humans. To contribute to the research of SSc, postdoctoral fellow Dre Heena Mehta has developed in Dre Sarfati’s laboratory in collaboration with Dr Senécal, an experimental murine model of SSc induced by dendritic cells loaded with topoisomerase I peptide. In order to characterise the model and establish an immune profile of our experimental mice, my analysis focused mainly on the cardinal features of scleroderma such as fibrosis, inflammation and polyclonal hyper-γ-globulinemia, vasculopathy and cytokines gene expression. Hence, immunization with dendritic cells loaded topoisomerase I peptides (TOPOIA and TOPOIB) induced pulmonary and dermal inflammation together with diffuse form of fibrosis. The mice also showed symptoms of vasculopathy and high levels of polyclonal antibodies. These results showed that TOPOIA peptides are effective in inducing fibrosis and inflammatory response while TOPOIB peptides are involved in skin fibrosis. Together with the results, the preliminary data on cytokine profile in tissue suggested that our mouse model could possibly replace/complement other current animal models of scleroderma.

L'atteinte vasculaire cérébrale est une complication grave et fréquente chez les enfants drépanocytaires, car elle impacte leur pronostic, en termes de morbidité (handicap) et de mortalité. L’accélération des vitesses mesurées par le doppler transcrânien (DTC) est prédictive du risque d'infarctus cérébral et implique une modification de la prise en charge thérapeutique. Chez l’enfant drépanocytaire, l'infarctus cérébral est d'origine multifactorielle, lié à la vasculopathie cérébrale sténotique ainsi qu'à une hypercoagulabilité et une activation cellulaire. Nous avons étudié de manière prospective l'association de marqueurs biologiques au DTC chez 108 enfants porteurs de syndrome drépanocytaire majeur et recherché des éléments prédictifs d'événement vasculaire périphérique ou cérébral. Nous avons ainsi réalisé une analyse approfondie de la fonction endothéliale, de l’activation de l’hémostase primaire et de la coagulation, de l'activation cellulaire et de la mécanique artérielle. L’atteinte vasculaire cérébrale a été estimée en considérant les données du DTC comme une variable continue plutôt que catégorielle. Le principal résultat est le rôle prédictif du nombre des cellules souches hématopoïétiques CD34+ pour la survenue d'événements cliniques vasculaires. Nous avons également mis en évidence un profil particulier de coagulation chez les enfants drépanocytaires présentant des céphalées récurrentes ou des accès migraineux. Ceci supporte l'hypothèse que les céphalées chez l'enfant drépanocytaire, et notamment celles répondant aux critères de la migraine, peuvent être le reflet d'événements ischémiques cérébraux ultra-transitoires. Elles représentent donc peut-être un indicateur indirect de risque ischémique cérébral. Nous avons par ailleurs montré que le risque hémorragique cérébral chez les enfants drépanocytaires restait proportionnellement stable par rapport au risque ischémique, malgré l'utilisation en routine de stratégies de prévention du risque ischémique. L'observation de lésions sténotiques et d'anévrismes permet de supposer que ces atteintes vasculaires cérébrales procèdent de mécanismes physiopathologiques communs. L'amélioration de la compréhension des mécanismes physiopathologiques des complications neurovasculaires et la mise en évidence de facteurs prédictifs d'événements cliniques est un pas supplémentaire vers l'amélioration de la sensibilité diagnostique de la vasculopathie cérébrale drépanocytaire, de la compréhension des mécanismes des accidents vasculaires cérébraux de ces enfants et probablement de leur pronostic neurologique en permettant une prise en charge thérapeutique adaptée plus précoce. / Cerbrovascular involvement is frequent in children with sickle-cell disease (SCD). It is severe in terms of morbidity (handicap) and mortality. Accelerated intracranial arterial blood flow velocity measured by transcranial doppler (TCD) is predictive for stroke occurrence and leads to therapeutic modifications. In SCD children, ischemic stroke results from stenotic cerebral vasculopathy associated with hypercoagulability, and cell activation. We prospectively addressed associations between biological markers and TCD velocity in 108 children with sickle-cell anemia (HbSS or HbSβ°) and looked for predictive factors for vascular peripheral or cerebral events. We performed extensive work-up of endothelial function, coagulation activation, cell activation, and arterial wall mechanics. Cerebral vasculopathy was defined using TCD velocity (continuous data) rather than the classical category classification. The main result is the demonstration of the role of hematopoietic stem cell CD34+ for the prediction of clinical vascular event occurrence. We also demonstrated an imbalanced coagulation profile in SCD children with recurrent cephalalgia or migraine. This finding supports the hypothesis that recurrent cephalalgia, especially migraine, could be a symptom of ultra-transient ischemic cerebrovascular events in SCD children. Therefore, this symptom may also indicate increased cerebrovascular ischemic risk. We demonstrated that the ratio cerebral hemorrhagic risk / cerebral ischemic risk in SCD children remains stable, despite the routine use of strategies aiming at reducing ischemic stroke risk. The concurrent observation of intracranial arterial stenotic lesions and aneurysm suggests common pathophyiological mechanisms. Improving pathophysiological understanding of cerebrovascular complications and demonstrating predictive risk factors for clinical events may help clinicians to improve early diagnosis of SCD-associated cerebral vasculopathy, to better understand stroke mechanism in this population, and probably to improve neurological outcome with earlier and more adapted management

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