Já foi demonstrado que a aminoguanidina (AG), um conhecido inibidor de AGEs (Produtos Finais de Glicação Avançada), aumenta a atividade de NOX2 (Sistema NADPH oxidase fagocítico) em neutrófilos peritoneais de ratos diabéticos. Experimentos adicionais demonstraram que o mesmo efeito ocorre em neutrófilos de ratos não diabéticos. Visando elucidar o mecanismo e a importância deste aumento de NOX2 pela AG em neutrófilos, utilizou-se um modelo experimental de ratos diabéticos e não diabéticos e um modelo in vitro com neutrófilos humanos isolados de sangue periférico ou HUVEC, uma linhagem de células endoteliais. Para isso, ratos machos Wistar diabéticos e não diabéticos foram tratados ou não por gavagem com AG (100mg/kg/dia) por 50 dias. Os neutrófilos foram recrutados e isolados do peritônio após 4 horas da injeção de caseinato de sódio e foram usados para avaliar a produção de superóxido, ERO e as atividades fagocítica e candicida destas células. No modelo in vitro, neutrófilos isolados de sangue periférico ou HUVEC foram ou não incubados com AG ou Metformina (MET) por 18h em estufa de CO2. O tratamento in vivo com a AG, mostrou aumento na produção de superóxido em comparação com grupos tratados com água, em ambos os grupos, diabéticos e não diabéticos. O aumento de atividade e expressão de NOX2 (p47phox e p67 phox) pela AG aumentou as atividades fagocíticas e candicida de Candida albicans, entretanto este aumento foi menos pronunciado no grupo diabético. Adicionalmente, os resultados demonstram a eficácia do tratamento com a AG na prevenção de glicação de proteínas, reduzindo os níveis de HbA1C e AGEs, além de reduzir os níveis de ureia e manter os níveis de creatinina no soro dos animais. O tratamento com AG reduziu a pressão arterial e a produção de nitratos no soro dos animais, mas a atividade das enzimas antioxidantes foi mantida. Verificou-se que as HUVEC tratadas com AG ou MET no estado basal ou estimuladas com LPS, tiveram menor produção de ERO. Neutrófilos humanos incubados com AG aumentaram a produção de ERO e de superóxido, enquanto o tratamento com MET manteve a produção de ambos. Além disso, o tratamento com AG aumentou a fagocitose e a atividade candicida de neutrófilos humanos nos tempos avaliados. O tratamento de neutrófilos humanos com MET manteve a expressão das subunidades avaliadas e o tratamento com AG aumentou a expressão de gp91phox. A liberação de IL-8 foi diminuída nos neutrófilos humanos tratados com a MET, e a AG aumentou a liberação de IFN-y . Em HUVEC a liberação de IL-8 e INF-y foram mantidas com ambos os tratamentos. Pode-se sugerir que a AG aumentou a atividade e a expressão de NOX2 em neutrófilos humanos e de ratos e que isso contribuiu diretamente para o aumento da atividade microbicida dos neutrófilos. Além disso, nos neutrófilos humanos, o aumento da liberação de IFN-y pode ter contribuído para o aumento da expressão de gp91phox. Adicionalmente, a influência da AG em células em processo de diferenciação para um estado mais maduro pode ser diferente dos seus efeitos in vitro, em células já maduras. / It has been showed that aminoguanidine (AG), a known inhibitor of AGE (Advanced Glycation End Products) increases the activity of NOX2 (phagocyte system NADPH Oxidase) peritoneal neutrophils of diabetic rats. Additional experiments demonstrated that the same effect occurs in non-diabetic rat neutrophils. To elucidate the mechanism and significance of NOX2 increase in neutrophils by AG, it was used an experimental model of diabetic and non-diabetic rats and an in vitro model in which human neutrophils isolated from peripheral blood or HUVEC endothelial cell lineage. For this, Wistar rats diabetic and non-diabetic were treated or not with AG by gavage (100 mg / kg / day) for 50 days. Neutrophils were recruited and isolated from the peritoneum 4h after injection of sodium caseinate and were used to evaluate superoxide generation, ROS and phagocytic and candicida activity of these cells. In vitro model, neutrophils isolated from peripheral blood or HUVEC were incubated or not with AG or Metformin (MET) for 18h in CO2 incubator. In vivo treatment with AG showed an increase in superoxide production compared with groups treated with water, in both groups diabetics and non-diabetics. The increased activity and expression of NOX2 (p47phox and p67phox) by AG increased phagocytic and candicida activity of Candida albicans, however this increase was less pronounced in the diabetic group. Additionally, the results demonstrate the effectiveness of treatment with AG on preventing glycation of proteins, reducing HbA1c and AGEs, in addition to reducing levels of urea and maintain the creatinine levels in serum of animals. The treatment with AG reduced the blood pressure and the production of nitrates and antioxidant enzymes activity were maintained in animals. It was found that HUVEC treated with AG or MET at baseline, or stimulated with LPS had lower production of ROS. Human neutrophils incubated with AG increase ROS and superoxide while treatment with MET remained the production of both. In addition, treatment with AG increased phagocytosis and candicidal activity of human neutrophils at times evaluated. In addition, treatment with AG increased phagocytosis and candicida activity of human neutrophils at times evaluated. The MET treatment maintained the expression of subunits assessed, and treatment with AG caused increased expression of gp91. The release of IL-8 by human neutrophils was decreased by treatment with MET, and AG increased the release of IFN-y The release of IL-8 was reduced in human neutrophils treated with MET, and AG increased IFN-y . In HUVEC the release of IL-8 and IFN-y were maintained with both treatments. It can be suggested that the AG used to inhibit the formation of AGEs increased activity and NOX2 expression in human and rat neutrophils and that directly contributed to the increased microbicidal activity by neutrophils. In addition, the human neutrophils the increased of IFN-y may have contributed to the increased expression of gp91phox. In addition, the influence of AG in cells in differentiation process to more mature state may be different of in vitro effects on cells already mature.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-01T16:45:23Z No. of bitstreams: 1 Fernanda Katharine de Souza Lins Borba.pdf: 4059966 bytes, checksum: cce20c494a8d5b3926e4508d0ff50750 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-01T16:45:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Katharine de Souza Lins Borba.pdf: 4059966 bytes, checksum: cce20c494a8d5b3926e4508d0ff50750 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Chondroitin Sulfate (CS) and Glucosamine Sulfate (GS) are functional constituents of vertebrate tissues. GS is an amino sugar and CS is part of the glucosaminoglycans group (GAGs). Studies have suggested CS and GS to have anti-inflammatory properties, however it has also been shown that these compounds promote scarring and proliferation of fibroblasts, which express molecules important for blood vessel growth (angiogenesis). This study was aimed at evaluating the effects of CS and GS on in vitro models regarding cell viability (cytotoxicity - MTT), proliferation (BrdU incorporation) and differentiation (tubulogenesis in Matrigel support) on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC line). In vivo angiogenesis was also evaluated in (1) extraembryonic membranes of Gallus domesticus (number of chorioallantoic vessels - CAM assay and vitelinic YSM assay; and fractal geometry analysis); (2) and subcutaneous tissue of adult mice (Mus muscullus) by hemoglobin quantification (Spectroscopy) in Gelfoam implants. In the HUVEC assay, both CS and GS (1-3000 g/mL) displayed partial cytotoxic effect (~50% viability), but only in the highest tested concentrations (3000 and 1000 g/mL). It was observed that CS (3 g/mL), but not GS, promoted proliferation and tubulogenesis of HUVEC in 40% (P < 0.05) and 64% (P < 0.05), respectively, relative to control (RPMI-1640 medium). These effects did not significantly differ from the respective 28% and 53% promoted by the well known angiogenic growth factor FGF-2 (50 ng/mL). In the in vivo vasculoangiogenesis YSM assay on 2 to 4-day old embryos, GS (0.001-0.1mg/disk) and, to a lesser extent, CS (0.030-0.1mg/disk) increased the amount of vessels relative to control (P < 0.05). The effects of administration of CS and GS (0.1mg/disk) did not differ from what was observed in groups treated with 50 ng/mL FGF2. In the CAM angiogenesis assay on 6 to 8-days old embryos, again both CS and GS increased the amount of vessels relative to control, but only in concentrations as high as 2.0 mg/disk. This effect was no different from what was observed in groups treated with 50 ng/mL FGF2. The pro-angiogenic effects of CS (2 mg/disk) in embryonary angiogenesis were confirmed in the advanced angiogenesis of mice: only the group treated with CS (2 mg/implant) displayed a significant increase in the amount of blood vessels, expressed as hemoglobin content (0.52 ± 0.08g/dL), relative to control (vehicle; PBS; 0.20 ± 0.07 g/dL). This pro-angiogenic effect was no different than that of FGF2 (0.53 ± 0.1g/dL). The in vitro and in vivo results indicate the pro-angiogenic properties of CS and GS. However, CS (GAG) was the more effective compound in the tests performed. As a constituent of proteoglycans, it is suggested that CS exerts its effects by interacting with FGF and other angiogenic factors in the extracellular matrix, stabilizing the receptor, and thus positively modulating the pro-angiogenic signal in endothelial cells. While the cellular mechanisms underlying CS and GS activity demand more specific research, there is an evident potential therapeutic use for both compounds in clinical situations, such as those related to vascular discrepancy. / Sulfato de glucosamina (SG) e Sulfato de condroitina (SC) são constituintes funcionais dos tecidos de vertebrados. O SG é um aminoaçúcar e o SC integra o grupo das glicosaminoglicanas (GAG). Estudos apontam propriedades antiinflamatórias do SC e SG, e demonstram ainda que essas substâncias promovem a cicatrização e a proliferação de fibroblastos, os quais expressam moléculas que atuam na formação de vasos sanguíneos (angiogênese). Os objetivos deste estudo foram avaliar a ação do SC e SG em modelos in vitro sobre a viabilidade (citotoxicidade pelo MTT), proliferação (incorporação por BrdU) e diferenciação (tubulogênese em suporte matrigel) na linhagem de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). Também se investigou a angiogênese in vivo: (1) em membranas anexas de embriões de Gallus domesticus (número de vasos corioalantóides - ensaio da CAM, e vitelínicos – ensaio da YSM; e análise por geometria fractal); (2) e no tecido subcutâneo de camundongos adultos por meio de quantificação da hemoglobina em implantes de Gelfoam. No ensaio com HUVEC, SC e SG (1-3000 g/mL) exerceram efeito citotóxico parcial (~50% de viabilidade), e somente nas respectivas maiores concentrações (3000 e 1000 g/mL). Verificou-se que o SC (3 g/mL), mas não o SG, estimulou a proliferação e a tubulogênese de HUVEC em 40% (p < 0,05) e em 64% (p < 0,05) respectivamente, em relação ao controle (meio RPMI-1640). Estes efeitos não diferiram estatisticamente dos 28% e 53%, respectivamente, promovidos pelo bem conhecido fator de crescimento angiogênico FGF-2 (50 ng/mL). No ensaio de vasculo-angiogênese na YSM de embriões de 2-4 dias de idade o SG (0,001-0,1mg/disco) principalmente, e o SC (0,030-0,1mg/disco) aumentaram o número de vasos em relação ao grupo controle (p < 0,05). Os efeitos da administração de SC e SG (0,1 mg/disco) não diferiram do observado no grupo tratado com 50 ng/mL de FGF-2. No ensaio de angiogênese na CAM de embriões de 6-8 dias de idade, ambos, SC e SG também elevaram o número de vasos em relação ao controle na concentração elevada de 2,0 mg/disco. Este efeito também não diferiu do observado no grupo exposto a 50 ng/mL de FGF- 2. O efeito pró-angiogênico do SC (2 mg/disco) na angiogênese embrionária foi confirmado na angiogênese avançada de camundongos adultos. Apenas o grupo que recebeu SC (2 mg/implante) mostrou um aumento significativo de vasos sanguíneos, expresso como conteúdo de hemoglobina (0,52 ± 0,08g/dL), comparado ao controle (veículo; PBS; 0,20 ± 0,07 g/dL). Este efeito pró-angiogênico não diferiu do obtido com FGF2 (0,53 ± 0.1g/dL). Os resultados in vitro e in vivo demonstram as propriedades pró-angiogênicas do SC e SG, contudo o SC (GAG) foi o mais efetivo nos ensaios. Como um constituinte de proteoglicanas, o SC sugere exercer seus efeitos pela interação com o FGF e outros fatores angiogênicos na matriz extracelular, estabilizando-os nos receptores e modulando assim, positivamente, o sinal pró-angiogênico nas células endoteliais. Embora mecanismos celulares subjacentes à atividade de SC e SG demandem mais estudos, evidencia-se um potencial papel terapêutico das duas substâncias em situações clínicas relacionadas à defasagem vascular.