Thirty bovine with neoplasms of the upper digestive tract (UDT) associated to the spontaneous consumption of bracken fern (Pteridium aquilinum) were studied. They were from 27 farms, localized in the municipalities of Jaguari (23) and Nova Esperança do Sul (4), Rio Grande do Sul, Brazil. The total bovine population in those farms was 1,090 and large amounts of bracken fern were found in the pastures. Twenty-six were cows e four were castrated males. The age ranged from 3 to 13-years-old. Most of them were 7 to 8-years-old (46,6%). Clinical signs observed in the affected animals were progressive weight loss, absence of ruminal movements, cough, dysphagia, regurgitation, halitosis, diarrhea, and bloat. Less frequent signs were selective appetite, dyspnea, and salivation. Two bovines died and 28 were euthanatized in extremis and submitted to necropsy. The main gross and microscopic findings were found in the same areas of the UDT. They were digestive papillomatosis, transforming papillomas, and squamous cell carcinomas (SCC). Twenty-nine bovines had papillomas of various sizes in several areas of the UDT. The digestive papillomatosis ranged from mild (45%), to moderate (38%), to severe (17%). Three developing phases were observed microscopically in the examined papillomas: an early growing phase, a developing phase, and a regressing phase. The regressing phase was characterized by lymphocytic infiltrates at the base of the papilloma. In 16 cases, the microscopic examination of lesions grossly resembling papillomas (although some were slightly round, with lower or ulcerated finger-like projections) revealed malignant transformation of the papillomas into SCCs. The SCCs were solitary (12/30) or multiple (18/30) and were histologicaly characterized as well, moderately, or poorly differentiated. Grouping the distribution of SCCs of larger extension in the UDT into cranial region (base of the tongue, pharynx/oropharynx, and epiglottis), medial region (esophagus), and caudal region (cardia and rumen), the distribution was cranial in 39%, middle in 16%, and caudal in 45% of the cases. By the same grouping criteria, but considering the total number of times SCCs of varied extensions were diagnosed in the cranial, middle, and caudal regions, the percentages changed to 34%, 26%, and 40%, respectively. Metastases to regional lymph nodes and other organs, like liver and lungs, were observed in 18 cases. Immunohistochemistry for cytokeratin was performed in selected sections of SCCs and metastases, showing strong positive reaction in the well and moderately differentiated SCCs, but weak positive reaction in the poorly differentiated ones. The epidemiological and histomorphological evidences showed in this study are in agreement with the observations that point out the co-carcinogesis between bovine papillomavirus type 4 infection and chemicals of bracken fern in the pathogenesis of the SCCs in the UDT of cattle. / Foram estudados 30 bovinos com neoplasias no trato alimentar superior (TAS) associadas ao consumo espontâneo de samambaia (Pteridium aquilinum) provenientes de 27 propriedades rurais, sendo 23 no município de Jaguari e quatro em Nova Esperança de Sul, Rio Grande do Sul. A população bovina total das 27 propriedades em que ocorreram os casos era de 1.090 bovinos e havia quantidade abundante de samambaia nas áreas de pastoreio dos animais. Vinte e seis bovinos eram vacas e quatro eram machos castrados. A idade variou de três a 13 anos, sendo o maior número de casos entre sete e oito anos (46,6%). Os sinais clínicos observados incluíram emagrecimento progressivo, atonia ruminal, tosse, disfagia, regurgitação, halitose, diarréia e timpanismo. Outros sinais clínicos menos freqüentes foram apetite seletivo, dispnéia e salivação. Dois bovinos tiveram morte espontânea e 28 foram submetidos à eutanásia in extremis e necropsiados. Os principais achados macroscópicos e histológicos observados nos 30 bovinos localizavam-se nos mesmos locais do TAS e consistiam de papilomas, papilomas em transformação para carcinomas de células escamosas (CCEs) e CCEs. Vinte e nove bovinos tinham papilomas de diversos tamanhos, sendo a quantidade variável entre leve (45%), moderada (38%) e acentuada (17%). Nos papilomas examinados microscopicamente, foram observadas três fases de desenvolvimento: a) fase inicial de crescimento; b) fase de desenvolvimento; e c) fase de regressão; essa última era caracterizada por infiltrados linfocitários nos eixos fibrovasculares de sustentação. Em 16 bovinos, o exame histológico de lesões macroscópicas compatíveis com papilomas, porém alguns deles apresentando-se mais arredondados, com projeções digitiformes atenuadas ou ulceradas, revelou a transformação maligna desses papilomas em CCEs. Os CCEs eram únicos (12/30) ou múltiplos (18/30) e variaram quanto ao grau de diferenciação celular entre bem diferenciados, moderadamente diferenciados ou pouco diferenciados. Quando a distribuição dos CCEs de maior extensão foi agrupada em regiões cranial (base da língua, faringe/orofaringe, epiglote), média (terços cranial, médio e caudal do esôfago) e caudal (entrada do rúmen e rúmen) do TAS, observou-se que a localização era cranial em 39% dos casos, média em 16%, e caudal em 45%. Utilizando-se esse mesmo critério de agrupamento, porém considerando o número total de vezes em que CCEs (de extensões variadas) foram diagnosticados nas regiões cranial, média e caudal, os números alteraram-se para 34%, 26% e 40%, respectivamente. Metástases de CCEs para linfonodos regionais e outros órgãos como fígado e pulmão foram observadas em 18/30 bovinos. A técnica de imunoistoquímica para citoqueratina foi realizada em cortes selecionados de CCEs e metástases, observando-se células fortemente positivas nos CCEs bem e moderadamente diferenciados, e fraca imunomarcação nos pouco diferenciados. As evidências epidemiológicas e histomorfológicas relatadas neste estudo reforçam as observações de uma estreita correlação entre a infecção pelo papilomavírus bovino tipo 4, causador da papilomatose digestiva, e a co-carcinogênese química dos princípios tóxicos da samambaia na patogênese dos CCEs do TAS de bovinos.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The pathogenesis of the lesions of the Ramaria flavo-brunnescens poisoning in cattle was studied throughout a retrospective evaluation of selected tissues from nine spontaneous and four experimental cases of the disease. The pathogenesis of lesions observed in the tongue, esophagus, hoof, and tail was investigated analyzing microscopic lesions, histochemical and histochemical-ultrastuctural changes. Histochemical techniques utilized were Masson s Trichrome and Selective Oxidation of Keratin (SOK). The histochemicalultrastuctural study was acomplished throughout the Swift method under transmission electron microscopy. Hair shafts of the tip of the tail were analyzed under polarized light. Lesions of varying degrees of severity were observed. They were more severe in spontaneous than in experimental cases. In the tongue, most microscopic lesions showed keratinization defects, such as loss of the filiform papillae, thinning, irregular stratification, focal lamelar keratinization, and individual cell keratinization (dyskeratosis) in the dorsal epithelium. In the esophagus, there were thinness of superficial epithelium and multifocal ulcers. In the hoof, lesions were in the laminar stratum and characterized by different grades of fusion, shortness, multiple layers of non-keratinized cells in the laminar tip, irregular and discontinuous keratinization with nuclear persistency, individual cell keratinization with citoplasmic vacuolization of keratinocytes of the epidermal laminae. In the skin of the tip of the tail, changes could by separated in follicular wall lesions (affecting the outer [ORS] and the inner root sheets [IRS]) and changes of the hair shaft itself. The main changes observed in the follicular epithelium were disorganization, misalignment, and disceratosis of keratinocytes of the ORS. On tissue sections, main changes in the hair shafts showed irregular contour, tortuousness, and disintegration of shaft. Morphological changes similar to the ones observed on tissue sections and changes in polarizing patterns were seen on polarized light microscopy of hair shafts. Tissue sections stained by Masson s Trichrome technique (with picric acid) revealed defective hard keratinization of filliform papillae, of epidermal lamina of hoof, and of tail tip hair shafts. Sections stained by the SOK technique revealed strong loss of cistine contents, visualized as light staining of these same structures. On the histochemical-ultrastructural study of the hair cuticle, performed throughout the Swift technique under transmission electron microscopy, a low content of cistine was also observed. All changes observed in the keratinized structures studied, mostly in the hard keratin, showed defective keratinization. The morphologic study and the results obtained with SOK and Swift techniques showed that the defective keratinization results of low amounts of sulphur containing amino acids (cystine) in hard keratin structures. This is probably the main pathogenetic mechanism of the lesions observed in R. flavo brunnescens poisoning in cattle. / O estudo da patogênese da intoxicação pelo cogumelo Ramaria flavo-brunnescens em bovinos foi realizado através da avaliação retrospectiva de tecidos selecionados de nove casos espontâneos e quatro casos experimentais. Para a investigação da patogênese das lesões observadas na língua, esôfago, casco e cauda, foram avaliadas as alterações histopatológicas e aspectos histoquímicos e histoquímico-ultra-estruturais das lesões. As técnicas histoquímicas utilizadas foram o Tricrômico de Masson e a oxidação seletiva da ceratina (OSC). O estudo histoquímico-ultra-estrutural foi realizado através da técnica de Swift sob microscopia eletrônica de transmissão. Os pelos da vassoura da cauda foram examinados sob microscopia de luz polarizada. Nos tecidos examinados foram observados diferentes graus e estágios de lesões. Nos bovinos intoxicados espontaneamente as lesões foram mais acentuadas que nos casos experimentais. Na língua, a grande maioria das lesões histopatológicas observadas demonstrou defeitos na ceratinização como desaparecimento das papilas filiformes, adelgaçamento, estratificação irregular, ceratinização lamelar focal e ceratinização individual de células (disceratose) no epitélio de revestimento dorsal. No esôfago observaram-se adelgaçamento do epitélio superficial e úlceras multifocais. Nos cascos havia alterações no estrato laminar, caracterizadas por graus variáveis de fusão, encurtamento, múltiplas camadas de células não-ceratinizadas no topo, ceratinização irregular e descontínua com persistência de núcleos, ceratinização individual e vacuolização citoplasmática de ceratinócitos das lâminas epidérmicas. Na pele da região da vassoura da cauda, as alterações foram divididas em lesões da parede folicular (nas bainhas radicular externa e interna) e alterações nos pelos propriamente ditos. As principais alterações observadas no epitélio folicular foram desorganização, desalinhamento e disceratose de ceratinócitos da bainha radicular externa. Nas seções histológicas, as principais alterações nas hastes pilosas demonstraram contornos irregulares, tortuosidade e desintegração da haste. Alterações morfológicas semelhantes às descritas nas seções histológicas e alterações no padrão de birrefringência foram observadas através do exame polaroscópico dos pelos. Através da técnica do Tricrômico de Masson (com ácido pícrico) observou-se ceratinização dura defeituosa das papilas filiformes linguais, das lâminas epidérmicas do casco e dos pelos da cauda. A técnica da OSC revelou redução marcada do conteúdo de cistina, visualizado como fraca coloração rósea dessas mesmas estruturas. No estudo histoquímico-ultra-estrutural da cutícula pilosa, realizado através da técnica de Swift sob microscopia eletrônica de transmissão, observou-se também um baixo conteúdo de cistina. Todas as alterações observadas nas estruturas ceratinizadas estudadas, mas especialmente nas que sofrem ceratinização dura, revelaram defeitos na ceratinização. Aliando ao estudo morfológico os resultados obtidos através da técnica da OSC e da microscopia eletrônica/técnica de Swift pode-se associar os defeitos na ceratinização a uma redução na quantidade de aminoácidos sulfurados (cistina), principalmente nas estruturas que sofrem ceratinização dura, sendo este provavelmente o principal mecanismo patogenético na intoxicação por R. flavo brunnescens em bovinos.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Spontaneous cases of chronic poisoning by Pteridium aquilinum in cattle were studied. The clinical forms of the disease were squamous cell carcinoma (SCCs) of the upper digestive tract (UDT) and bovine enzootic hematuria (BEH). The cases were from the midland Region of the Midwest of Rio Grande do Sul State, Brazil. For the epidemiological study, the profile of the farms was analyzed about herd purpose, main activity of the farm, altitude, and area of plant infestation. No differences were observed among the clinical forms, according to these criteria. Analysis of the ager, gender, and breed of the affected cattle revealed that, in both clinical forms of disease, mixed breed cows (more common in that region) were more affected. In BEH, adult cattle (3-to-7-years-old) were more frequently affected. In the form of UDT SCCs, aged cattle (more than 8- years-old) were more affected. For the clinical study, clinical signs and blood work were evaluated at terminal phase of disease. Cattle with UDT SCCs, had progressive weigth loss, ruminal atony, cough, dysphagia, bloating, and regurgitation. Hematuria was clinically observed in one case of this disease form. In cattle with BEH, hematuria was observed in all cases, followed by progresive weigth loss. Non-regenerative anemia was detected in 33.33% in UDT SCCs form and in 66.66% of BEH form. Changes in white blood count occurred in some cases but drop in lymphocytes was uncommon in both forms of disease. For the morfological study, urinary bladders of 46 UDT SCCs cases and 11 BEH cases were analyzed. Grossly, 16/46 bladders of the UDT SCCs form had gross lesions (vesical red or pale nodules, hemorrhages, and papilomas; red urine in the three cases). In BEH form, the bladder had nodules, large neoplastic masses, red urine, papilomas, and hemorrhages. Pielonephritis and hidronephosis were seen in a few cases. Microscopically, in the UDT SCCs form, 44/46 (95.65%) bladders had 22 different types of morphological changes, caracterized by neoplastic lesions (5/22) and non-neoplastic lesions (17/22), which were subdivided in non-neoplastic epithelial changes (6/17), general changes of the lamina propria (6/17), and inflammatory changes (5/17). The bladder changes in BEH form were of 19 different types, caracterized by neoplastic lesions (5/19) and non-neoplastic lesions (14/19), which were subdivided in non-neoplastic epitelial changes (9/14), general changes of the lamina propria (3/14), and inflammatory changes (2/14). In BEH, mesenchymal neoplasms were more observed than epithelial ones, and most of them were malignant. Immunohistochemistry was utilized to characterize the histogenesis of poorly differentiated neoplasms. In conclusion, the morfological study showed that urinary bladder lesions are very often in cattle with the UDT SCCs form, and were identical to the ones seen in cattle with BEH. / Foram estudados casos espontâneos de intoxicação crônica por samambaia em bovinos nas formas clinicopatológicas de carcinoma de células escamosas (CCE) no trato alimentar superior (TAS) e de hematúria enzoótica bovina (HEB), provenientes da Mesorregião Centro Ocidental do Rio-Grandense e encaminhados ao Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Para o estudo epidemiológico, foi avaliado o perfil das propriedades quanto à finalidade da criação, principal atividade da propriedade, altitude e área de infestação pela planta. Quanto a esses parâmetros, as propriedades com uma ou outra forma de intoxicação crônica não apresentaram diferenças. Foi determinado o perfil dos bovinos afetados quanto à idade, sexo e raça. Os mais afetados por ambas as formas clínicas foram fêmeas de raça mista (predominante na região). Na HEB houve predomínio de bovinos adultos (três a sete anos) e a forma de CCEs no TAS afetou mais bovinos idosos (mais de oito anos). Para o estudo clínico foram avaliados os sinais clínicos de bovinos com CCEs no TAS e com HEB e realizados hemogramas na fase terminal da doença. Os principais sinais clínicos nos bovinos com CCEs no TAS foram emagrecimento progressivo, atonia ruminal, tosse, disfagia, timpanismo, regurgitação e hematúria, vista em um caso. Nos bovinos com HEB, hematúria foi o principal sinal, observado em todos os casos, seguido de emagrecimento progressivo. No exame hematológico, 33,33% dos bovinos com CCEs no TAS e 66,67% dos bovinos com HEB apresentaram anemia arregenerativa. Alterações no leucograma ocorreram em alguns casos, mas linfopenia foi um achado infreqüente em ambas as formas de intoxicação. Para o estudo morfológico, foram avaliadas as bexigas de 46 casos de CCEs no TAS e de 11 casos de HEB. Macroscopicamente, 16/46 bexigas dos casos de CCEs no TAS apresentaram alterações macroscópicas, que foram nódulos vermelhos ou pálidos, hemorragia e papilomas; urina vermelha foi observada em três casos. Nos casos de HEB, os achados macroscópicos vesicais foram nódulos vermelhos, massas neoplásicas focalmente extensas, urina vermelha, papilomas, hemorragias e ruptura de bexiga; pielonefrite e hidronefrose foram observados em poucos casos. Histologicamente, 44/46 (95,65%) bexigas de bovinos com CCEs no TAS apresentaram 22 tipos diferentes de alterações morfológicas, que foram classificadas em alterações neoplásicas (5/22) e alterações não-neoplásicas (17/22), as quais foram divididas em alterações epiteliais não-neoplásicas (6/17), alterações gerais na lâmina própria (6/22) e alterações inflamatórias (5/17). Os achados histológicos das bexigas dos casos de HEB foram classificados da mesma forma, resultando em 19 tipos diferentes de alterações morfológicas. Dessas, 5/19 eram alterações neoplásicas e 14/19, alterações não-neoplásicas (9/14 alterações epiteliais não neoplásicas, 3/14 alterações gerais na lâmina própria e 2/14 alterações inflamatórias). Na HEB, os neoplasmas mesenquimais foram mais observados que os epiteliais, e a maior parte era maligno. A técnica de imuno-histoquímica foi utilizada para caracterizar os aspectos morfológicos, principalmente dos neoplasmas. Através do estudo morfológico concluiu-se que é muito freqüente a ocorrência de lesões vesicais em bovinos com a forma crônica de CCEs no TAS e que essas são idênticas às encontradas nos bovinos com HEB.

<p><em>Background:</em> UC is the most common urogenital cancer, comprising up to 2% of all naturally occurring neoplasia in dogs and can be challenging to diagnose. With early diagnosis, the disease can be controlled in most dogs with a good quality of life. MiRNAs are small non-coding RNAs that function by post-transcriptional regulation of gene expression. Their abundant presence and stability in the body make them promising tools for disease diagnosis. </p> <p><em>Hypothesis:</em> A microRNA (miRNA) signature can be used to differentiate canine urothelial carcinoma (UC) from other lower urinary tract diseases.</p> <p><em>Literature review:</em> There is an overlap of miRNA expression changes between normal physiologic processes, non-infectious and non-inflammatory conditions, infectious and/or inflammatory conditions, and neoplasia. Additionally, the mechanism of action of these overlapping miRNAs varies depending on the disease process. There is a lack of standardization of miRNA evaluation and consistency within a single evaluation method. Herein we evaluate three papers on miRNA expression in canine UC and compared the reported expression profile to human UC literature and identified experimentally validated targets of the dysregulated miRNA. </p> <p><em>Methods and results:</em> <strong>(Aim 1)</strong> Using reverse transcriptase quantitative PCR (RT-qPCR), we assessed the effects of sample handling on miRNA expression in formalin-fixed Paraffin-embedded (FFPE) tissue and urine sediment. We showed that the time of tissue fixation in formalin does not alter the detection of miRNA expression, but the inclusion of the muscularis layer altered the miRNA expression profile in bladder tissue. Additionally, miRNAs in urine sediment were proven to be stable despite the storage temperature for up to two weeks. <strong>(Aim 2)</strong> Using Next Generation Sequencing (NGS) with validation of findings via RT-qPCR, we evaluated differential miRNA expression in bladder tissue collected from normal canine urothelium and the invasive type of UC (iUC) to elucidate the dysregulated pathways. We found that twenty-eight miRNAs were differentially expressed (DE). The DE miRNAs were most often associated with gene silencing by miRNA, miRNAs in cancer, and miRNAs involved in DNA damage responses. Proteins involved include HRAS, KRAS, ARAF, RAF1, MAPK1, MAP2K1, MAPK3, FGFR3, EGFR, HBEGF, RASSF1, E2F2, E2F3, ERBB2, SRC, MMP1, and UP3KA. <strong>(Aim 3)</strong> Using RT-qPCR, expression of miR-214, miR-181a, miR-361, and miR-145 were evaluated. We failed to reject the null hypothesis that the relative gene expression in all groups was the same for any miRNA, nor did we find any multivariate summary that could effectively differentiate UC from inflammatory and non-neoplastic transitional cells. </p> <p><em>Conclusions:</em>   The findings within this thesis highlight the need for standardized methods for miRNA evaluation, support the use of stored samples for miRNA expression analysis, and show the importance of isolating the tissue of interest in FFPE. We defined the miRNome of iUC and investigated numerous protein pathways affected by dysregulation of differentially expressed miRNA in urothelial carcinoma. While we failed to reject our null hypothesis that the miRNA signature we evaluated could be utilized as a diagnostic tool for canine urothelial carcinoma, we showed the promise of miRNA as diagnostic tools and highlight several novel pathways that miRNA regulation affects in this disease. </p>

CAPES / O presente trabalho tem por objetivo apresentar uma nova técnica de instrumentação para estudo dos diferentes tipos de andaduras realizadas por equinos, utilizando sistemas baseados na tecnologia de sensoriamento ótico quase-distribuído, redes de Bragg em fibra ótica-FBG. Essa técnica poderá ser usada como ferramenta auxiliar de diagnóstico precoce de lesões relacionadas ao sistema locomotor do cavalo, principalmente na porção distal do dígito, uma das causas mais comuns de aposentadoria destes quando atletas. São apresentadas, portanto, duas técnicas de instrumentação in vivo: a primeira t´técnica consiste na fixação de FBGs sem encapsulamento, diretamente na parede dorsal do casco em cada um dos membros de três cavalos atletas em treinamento; a segunda técnica apresentada ´e o desenvolvimento de um protótipo sensor com formato de ferradura encapsulado em material compósito reforçado com fibra de carbono, este método foi utilizado na instrumentação de dois equinos também em fase de treinamento. O primeiro método permite avaliar o comportamento do casco em diferentes fases da passada, durante as andaduras passo e trote. A segunda técnica, com o elemento sensor encapsulado, permite avaliar diferentes tipos de andadura, como passo, trote e galope sob condições de treinamento. Estas duas técnicas de instrumentação, utilizando sensores FBGs, se mostram promissoras para o estudo clínico e biomecânico de equinos, em avaliações m´médicas ou até mesmo durante treinamentos ou competições. / The main goal of this paper is to study the viability of the application of the system based on the optic sensing almost distribute (Fiber Bragg Gratings-FBG) technology, to study different kinds of equine gaits and how it is a possible helpful tool to early diagnose of injuries related to the locomotor system of the horse, mainly the distal part of the digit, which is one of the most common reasons for retire of athlete horses. Two different technics are presented in vivo: The first one consists in the attachment of the FBGs without encapsulation, directly on the wall of the hoof of each member of three athlete horses during training; the second technic presented, is the development of a prototype sensor with the same form of a horse shoe, encapsulated in a composite material reinforced with Carbon Fiber, this method was used in two horses during training as well. The first method allowed evaluate the behavior of the hoof in different phases of the horse gaits, such as walk and trot. The second technic, with the sensor element now encapsulated, allowed to evaluate different types of equine gaits, like walk, trot and run under training conditions. Both of the instrumentation using FGBs sensors technics were considered promising to clinical and biomechanics equine study in the medical evaluations or even during training or competition.

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