Une interaction mutualiste peut être définie comme un échange de services, qu’ils soient trophiques ou non, entre individus d’espèces différentes. La myrmécochorie est un mutualisme dans lequel les fourmis récoltent des graines portant un appendice charnu appelé élaïosome (le tout formant une diaspore), les ramènent jusqu’au nid où l’élaïosome est détaché et consommé. La graine, restée intacte, est alors rejetée du nid où elle pourra rester ou être re-dispersée par un autre vecteur avant de germer. Dans ce contexte, le comportement de récolte des fourmis envers les diaspores est décisif pour leur dispersion. Divers traits tels que la morphologie, la composition chimique et la phénologie des graines myrmécochores influencent l’efficacité de leur dispersion par les fourmis. Néanmoins, la disponibilité spatio-temporelle de ces graines est un trait dont l’influence sur le comportement des fourmis reste peu connue.Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés à l’influence de la disponibilité spatiale − en termes d’abondance − des diaspores de Chelidonium majus sur leur récolte et leur dispersion par les fourmis Myrmica rubra. Alors que les ouvrières exploitent la totalité d’un petit agrégat de diaspores, seule la moitié d’un large agrégat est exploité. Ceci suggère que la myrmécochorie stricte est efficace pour des plantes produisant peu de graines tandis qu’une libération massive de diaspores nécessite des modes de dispersion complémentaires. Concernant la disponibilité temporelle, des expositions successives à une même espèce de graines (V. odorata ou C. majus) conduisent à une diminution de l’intensité de leur récolte voire à une complète extinction de ce processus dans le cas de V. odorata. En effet, face à ces dernières, l’extinction de la réponse des fourmis persiste pendant au moins deux mois. Elle apparait également plus rapidement que pour les graines de C. majus et concerne toutes les étapes du processus de myrmécochorie puisque un ratio croissant de graines de V. odorata sont rejetées encore pourvues de leur élaiosome. Cette différence dans le comportement de récolte et dans son évolution temporelle ne semble pas liée à un bénéfice différentiel retiré de la consommation des élaïosomes provenant de ces deux espèces de graines myrmécochores. Par ailleurs, les larves semblent jouer un rôle de régulateurs de la récolte des diaspores de V. odorata et donc dans le phénomène d’extinction. L’ensemble des résultats présentés dans cette thèse met en évidence le caractère dynamique de cette interaction plante-fourmis, dont l’issue et la stabilité varie selon l’espèce considérée et la disponibilité spatio-temporelle des diaspores. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Certains extraits naturels sont très rares et onéreux. La tentation est alors forte pour les producteurs de matières premières ou intermédiaires d’avoir recours à des adultérations. Le mélange avec des extraits issus d’origines botaniques apparentées, d’origines géographiques différentes, l’ajout d’un composé synthétique présent dans l’extrait naturel ou d’un autre extrait végétal, l’utilisation de produits phytosanitaires réglementés, la mise en place de procédés d’extractions non standardisés, en sont quelques exemples. Ces différences de qualité sont de plus en plus difficilement décelables. Cette thèse a pour objet de mettre au point une méthodologie rapide, efficace et non ciblée. Une approche métabolomique en UHPLC-HRMS est développée pour identifier ces défauts ou pratiques frauduleuses pour les absolues destinées au secteur arômes et parfums. Cette mise en évidence est réalisée par la détection de métabolites marqueurs. Les absolues présentent un défi particulier : entre 50 et 95 % de l’extrait peut être constitué de composés non volatils, rarement décrits dans la littérature. La recherche d’authenticité de ces extraits est alors plus complexe que dans le cas d’un extrait volatil tel qu’une huile essentielle, dont la composition peut être plus facilement déterminée par des techniques analytiques éprouvées et l’utilisation de bases de données. Deux plantes emblématiques de la parfumerie ont été étudiées : la violette (Viola odorata) et la rose (Rosa damascena et Rosa centifolia). Des marqueurs d’origine géographique ont été identifiés dans le cas de la violette, et des marqueurs d’origine botanique dans le cas de la rose. / Some natural extracts are very scarce and expensive. The temptation is therefore very high for producers or brokers to resort to adulterations. Mixing of extracts from related botanical origins, from different geographical origins, addition of synthetic compounds with natural occurrence in the extract, or addition of another vegetal extract, use of phytosanitary products, non-standardized extraction processes, are some examples. The quality differences are more and more difficult to detect. The objective of this PhD study was to develop a fast, efficient and non-targeted methodology. Metabolomics approach in UHPLC-HRMS was developped to identify defects or fraudulent practices in absolutes used in flavour and fragrances. These identifications are realized by the detection of chemical markers. Absolutes are a great challenge: between 50 and 95 % of the extracts consist of non-volatile compounds; moreover these products are seldom described in literature. The quest for validation for authenticity is then much more complex than in cases of volatile extracts such as essential oils, whose composition can be more easily determined by robust analytical instruments and numerous databases. Two symbolic plants used in perfumery were studied: viola (Viola odorata) and rose (Rosa damascena and Rosa centifolia). Markers of French origin were identified for viola, and markers of R. centifolia were identified for rose. Their characterizations were nevertheless the fundamental limit for this technique being at trace level in the extract. This work demonstrated the performance and limitation of the non-targeted metabolomics approach on absolutes, which are specialties of perfumery.

Cyclotides are plant proteins with a unique topology, defined as the cyclic cystine knot motif. The motif endows cyclotides with exceptional chemical and biological stability. They also exhibit a wide range of biological activities including insecticidal, cytotoxic, anti-HIV and antimicrobial effects. Hence, cyclotides have become potential candidates in the development of peptide-based drugs; either as scaffolds to stabilize susceptible peptide sequences or as drugs by their own right. In this thesis, important parameters that could be inputs toward this development have been tuned. An extraction protocol that can be extended to industrial scale production of the cyclotides from natural sources was developed; accordingly, a single maceration with hydroalcoholic solutions of medium polarity represented an optimum extraction method. Moreover, it was shown that investigating the cyclotide content of cyclotide-bearing plants from diverse environments is a promising approach for extending the knowledge of both structural and biological diversity of these proteins. Five novel cyclotides with new sequence diversity were isolated and characterized from a violet that grows on Ethiopian highlands at an altitude of 3400 m. One of the areas where the cyclotide framework has attracted interest is the development of stable antimicrobial peptides. A stability study was carried out to determine the stability of the cyclotide framework in a cocktail of bacterial proteases and serum where the native forms of tested cyclotides exhibited high stability profile. Understanding the modes of cyclotide-cell interaction is certainly an important factor for the potential development of cyclotide-based drugs. Cellular studies were carried out using the comet assay and microautoradiography. A bell-shaped dose response curve was obtained for the DNA damaging effect of the cyclotides in the comet assay, which was the first toxicological assay of its kind on this class of proteins. The microautoradiography study revealed that the cyclotides penetrate into the cells even at cytotoxic concentrations. From previous reports, it was known that the cyclotides interact with membranes; the cellular studies in this thesis added to this knowledge by clearly demonstrating that these proteins have multiple modes of action.

The growing problem of antibiotic resistance and the lack of promising prospective antibiotics have forced us to search for new classes of antibiotics. Among the candidates to develop into future antibacterials are antimicrobial peptides (AMPs). These potent, broad spectrum compounds are important components of innate immunity of organism from all kingdoms of life. One such family of mini-proteins from plants is called cyclotides, whose members are defines by cyclic backbone and a cystine knot (CCK), which confers to them extreme stability in the face of biological, chemical and physical insults.     Some cyclotides possess Gram-negative specific antibacterial activity; the purpose of this thesis was to characterize how these molecules kill bacteria, and how bacteria would respond to treatment with cyclotides. For this purpose, Salmonella enterica and Escherichia coli mutants resistant to the cyclotides cycloviolacin O2 and cycloviolacin O19, respectively, were selected. These mutants were characterized by whole genome sequencing, genetic reconstitution, fitness measurements, and cross-resistance studies. These studies identified a number of genetic pathways for resistance development to cyclotides. These mutants displayed variable fitness profiles in laboratory growth media and in mice competition experiments, with some mutants possessing a fitness advantage in mice. Cross-resistance studies resulted in the identification of several cases of cross-resistance and collateral sensitivity between cyclotides and other AMPs/antibiotics.      Antimicrobial effects of cyclotides were assayed in different conditions and in bacterial organisms with different surface characteristics. In addition, immunolocalization experiments were performed to explore the biological distribution of cyclotides in plants and to determine the mechanism of action of cyclotides in bacteria, respectively. Antibodies raised against cyO2 were used for this purpose. Immunohistochemical techniques applied to plant cells, tissues and organs provided the information that cyclotides were distributed in all plant organs, and were found in tissues vulnerable to pathogen attack, and that cyclotides were stored in the vacuoles of plant cells. Immunogold staining of cyclotide treated cells of S. typhimurium, showed effects of cyclotide treatment on the cell envelope components as well as cytoplasm. A higher number of cyclotide molecules was associated with the cell envelope, but a considerable fraction of them penetrated into the cytoplasm.

Ce travail porte sur la dispersion des graines par les fourmis et se divise en deux parties : l’une expérimentale (Chapitres 1, 2 & 3) et l’autre synthétique (Chapitres 4 & 5). L’approche expérimentale a consisté en une exploration en conditions de laboratoire des comportements des fourmis à deux étapes du processus de myrmécochorie: à la source de graines et dans le nid. Des graines des plantes myrmécochores Viola odorata et Chelidonium majus ont été présentées aux fourmis Lasius niger et Myrmica rubra. Chaque étape de la séquence myrmécochorique a généré une variabilité des comportements propre à chacun des quatre couples fourmis-graines. L’élaiosome n’attire pas les fourmis à distance. Les fourmis suivent toujours la même séquence de comportements : antennation, manipulation et prise des graines. Le nombre d’antennations et de manipulations avant la prise de graines peut être considéré comme un indicateur de l’« hésitation » des fourmis à prendre les graines. L’espèce à tendance carnivore Myrmica rubra a été plus rapide et efficace dans la prise de graines que l’espèce éleveuse de pucerons Lasius niger. Parallèlement, les fourmis ont moins antenné, moins manipulé et plus pris de graines de Chelidonium majus, ce qui montre un intérêt particulier pour cette espèce. Un jour après l’expérience, toutes les graines des deux espèces se trouvaient dans les déchets à l’extérieur du nid, avec au moins la moitié des élaiosomes consommés (Chapitre 1). Lors du passage des graines à l’intérieur du nid, les fourmis Myrmica rubra ont également montré une capacité à traiter les graines rapidement, en montrant une dynamique d’arrachage de l’élaiosome et de rejet des graines hors du nid plus rapide. Le taux d’arrachage de l’élaiosome a été influencé par l’espèce de graine, plus important pour les graines de Chelidonium majus. Nous avons montré qu’une proportion variable de graines rapportées au nid (moins de la moitié) étaient déposées directement au contact des larves, les autres étant traitées ailleurs par les ouvrières ou laissées temporairement à l’abandon dans le nid. Par ailleurs, les dynamiques de rejet des items hors du nid ont curieusement été peu influencées par l’espèce de graine. Pour une graine, le fait de ne plus avoir d’élaiosome diminue le nombre moyen d’ouvrières qui la contacte simultanément. Parallèlement, même si la réponse n’est pas de type « tout ou rien », l’absence d’élaiosome accroit aussi la probabilité qu’une graine a d’être rejetée. (Chapitre 2). Nous avons isolé expérimentalement le paramètre de dessiccation des graines afin mesurer son influence sur le taux de prises. La dessiccation progressive des graines réduit les taux de prises par les fourmis Myrmica rubra. La réhydratation des mêmes graines leur permet de retrouver une attractivité et donc une valeur fonctionnelle prolongée. Les graines de Viola odorata perdent presque toute attractivité après 4 jours de dessiccation et leur réhydratation ne rétabli que faiblement leur attractivité. A l’inverse, les graines de Chelidonium majus gardent un tiers de leur attractivité après un mois de dessiccation et leur réhydratation restaure presque entièrement leur attractivité (Chapitre 3). La synthèse bibliographique a permis de dresser un aperçu des principales caractéristiques des fourmis dispersatrices de graines myrmécochores. Certains traits « généralistes » rendent les rencontres entre fourmis et graines très probables : leur ubiquité et diversité taxonomique, leur régime alimentaire omnivore, et leur fourragement « diffus » et opportuniste. Les fourmis possèdent des traits qui les rendent uniques par rapport aux autres insectes : le fourragement au sol, la capacité à transporter de la nourriture, ainsi que la nidification. Certains traits des fourmis ont une influence considérable sur la dispersion des graines : leur taille, les préférences de régime alimentaire, la phénologie, la capacité d’apprentissage et la fréquence de déménagement des nids. Nous développons également l’hypothèse que la rapidité et l’efficacité du traitement des graines par les fourmis seraient une conséquence d’un comportement hygiénique des fourmis à tendance carnivore, habituées à gérer des proies périssables (Chapitre 4). Nous avons dressé pour la première fois une liste des espèces de plantes myrmécochores et potentiellement myrmécochores des régions d’Europe tempérée (260 spp.). Nous montrons que ces dernières sont majoritairement herbacées, et ont tendance à fleurir plus précocement que les autres espèces. La proportion de graines myrmécochores comprises entre 1 et 3 mm et entre 0,6 et 10 mg est plus importante que dans le reste de la flore (Chapitre 5). / This study concerns seed dispersal by ants and is divided in two parts: one experimental (chapters 1, 2 & 3), and one synthetic (chapters 4 & 5). Experimental work consisted in a series of laboratory experiments, in which ant behaviour was studied at two stages of the dispersal process: at the seed source and inside the nest. Seeds of the myrmecochorous plants Viola odorata and Chelidonium majus were presented to two ant species: Lasius niger and Myrmica rubra. Each stage of the myrmecochory sequence generated a variability of behaviours for each of the four ant-seed pairs. The elaiosomedo not attract seed at a distance. Ants followed always the same behavioural sequence: antennations, manipulations, and removal. The number of antennations and manipulations before removal can be considered as a measure of ants’ “hesitation” to remove seeds. The carnivorous species Myrmica rubra was faster and more efficient at taking seeds than the aphid-tending Lasius niger. At the same time, ants antennated and manipulated less Chelidonium majus seeds, which shows a particular interest for this seed species. One day after the experiment, all seeds of both species were located outside the nest in the refuse piles. At least half of their elaiosomes had been consumed (chapter 1). Inside the nest, Myrmica rubra also showed a great ability to treat seeds quickly, i.e. quicker dynamics of elaiosome removal and seed rejection outside the nest. Elaiosome removal rates were influenced by seed species (higher for Chelidonium majus). We showed that a variable proportion of seeds (less than half) was directly deposited in contact with larvae. The rest of the seeds were handled elsewhere by workers, or left temporarily unattended in the nest. Dynamics of seed rejection outside the nest were curiously little influenced by the seed species. For a seed, to loose the elaiosome decreased the number of workers manipulating it. At the same time, even if the rejection response is not automatic, the absence of elaiosome increases the probability for a seed to be rejected (Chapter 2). We isolated the desiccation parameter in order to measure its influence on seed removal rates. Progressive seed desiccation reduced Myrmica rubra removal rates. Rehydration of the same seeds restored their attractiveness, thereby prolonging their functional life. Viola odorata seeds lost almost all their attractiveness after 4 days of desiccation, and rehydration only restored a reduced part of their attractiveness. On the contrary, Chelidonium majus seeds kept one third of their attractiveness after one month of desiccation, and recovered almost all their attractiveness after rehydration (Chapter 3). The bibliographic review allowed us to compile an outline of the main features of seed-disperser ants. Some generalist features highly increase the probability that ants encounter seeds: their ubiquity and taxonomic diversity, omnivorous diet and their opportunistic “diffuse” foraging. Among insects, ants have unique traits that make them broad dispsersers: ground foraging, the ability to transport items, and nesting behaviour. Some other traits have a great influence on the seed dispersal system: the ant body size, their diet preferences, the phenology of the colony, the learning, and the frequence of nest relocation. We also develop the hypothesis according to which, handling efficiency of ants is a byproduct of hygienic behaviour of carnivorous oriented species, since they are used to manage perishable preys (Chapter 4). We compiled the first list of myrmecochorous and potentially myrmecochorous plants species of European temperate regions (260 spp.). We show that these plants are mainly herbaceous. They also tend to flower earlier than the whole flora. The proportions of myrmecochorous seeds having a size range between 1 and 3 mm, and a weight range between 0.6 and 10 mg are higher than in the rest of the flora (Chapter 5).

Ce travail porte sur la dispersion des graines par les fourmis et se divise en deux parties :l’une expérimentale (Chapitres 1, 2 & 3) et l’autre synthétique (Chapitres 4 & 5). L’approche expérimentale a consisté en une exploration en conditions de laboratoire des comportements des fourmis à deux étapes du processus de myrmécochorie: à la source de graines et dans le nid. Des graines des plantes myrmécochores Viola odorata et Chelidonium majus ont été présentées aux fourmis Lasius niger et Myrmica rubra. Chaque étape de la séquence myrmécochorique a généré une variabilité des comportements propre à chacun des quatre couples fourmis-graines. <p>L’élaiosome n’attire pas les fourmis à distance. Les fourmis suivent toujours la même séquence de comportements :antennation, manipulation et prise des graines. Le nombre d’antennations et de manipulations avant la prise de graines peut être considéré comme un indicateur de l’« hésitation » des fourmis à prendre les graines. L’espèce à tendance carnivore Myrmica rubra a été plus rapide et efficace dans la prise de graines que l’espèce éleveuse de pucerons Lasius niger. Parallèlement, les fourmis ont moins antenné, moins manipulé et plus pris de graines de Chelidonium majus, ce qui montre un intérêt particulier pour cette espèce. Un jour après l’expérience, toutes les graines des deux espèces se trouvaient dans les déchets à l’extérieur du nid, avec au moins la moitié des élaiosomes consommés (Chapitre 1).<p>Lors du passage des graines à l’intérieur du nid, les fourmis Myrmica rubra ont également montré une capacité à traiter les graines rapidement, en montrant une dynamique d’arrachage de l’élaiosome et de rejet des graines hors du nid plus rapide. Le taux d’arrachage de l’élaiosome a été influencé par l’espèce de graine, plus important pour les graines de Chelidonium majus. Nous avons montré qu’une proportion variable de graines rapportées au nid (moins de la moitié) étaient déposées directement au contact des larves, les autres étant traitées ailleurs par les ouvrières ou laissées temporairement à l’abandon dans le nid. Par ailleurs, les dynamiques de rejet des items hors du nid ont curieusement été peu influencées par l’espèce de graine. Pour une graine, le fait de ne plus avoir d’élaiosome diminue le nombre moyen d’ouvrières qui la contacte simultanément. Parallèlement, même si la réponse n’est pas de type « tout ou rien », l’absence d’élaiosome accroit aussi la probabilité qu’une graine a d’être rejetée. (Chapitre 2).<p>Nous avons isolé expérimentalement le paramètre de dessiccation des graines afin mesurer son influence sur le taux de prises. La dessiccation progressive des graines réduit les taux de prises par les fourmis Myrmica rubra. La réhydratation des mêmes graines leur permet de retrouver une attractivité et donc une valeur fonctionnelle prolongée. Les graines de Viola odorata perdent presque toute attractivité après 4 jours de dessiccation et leur réhydratation ne rétabli que faiblement leur attractivité. A l’inverse, les graines de Chelidonium majus gardent un tiers de leur attractivité après un mois de dessiccation et leur réhydratation restaure presque entièrement leur attractivité (Chapitre 3).<p>La synthèse bibliographique a permis de dresser un aperçu des principales caractéristiques des fourmis dispersatrices de graines myrmécochores. Certains traits « généralistes » rendent les rencontres entre fourmis et graines très probables :leur ubiquité et diversité taxonomique, leur régime alimentaire omnivore, et leur fourragement « diffus » et opportuniste. Les fourmis possèdent des traits qui les rendent uniques par rapport aux autres insectes :le fourragement au sol, la capacité à transporter de la nourriture, ainsi que la nidification. Certains traits des fourmis ont une influence considérable sur la dispersion des graines :leur taille, les préférences de régime alimentaire, la phénologie, la capacité d’apprentissage et la fréquence de déménagement des nids. Nous développons également l’hypothèse que la rapidité et l’efficacité du traitement des graines par les fourmis seraient une conséquence d’un comportement hygiénique des fourmis à tendance carnivore, habituées à gérer des proies périssables (Chapitre 4).<p>Nous avons dressé pour la première fois une liste des espèces de plantes myrmécochores et potentiellement myrmécochores des régions d’Europe tempérée (260 spp.). Nous montrons que ces dernières sont majoritairement herbacées, et ont tendance à fleurir plus précocement que les autres espèces. La proportion de graines myrmécochores comprises entre 1 et 3 mm et entre 0,6 et 10 mg est plus importante que dans le reste de la flore (Chapitre 5).<p>/<p>This study concerns seed dispersal by ants and is divided in two parts: one experimental (chapters 1, 2 & 3), and one synthetic (chapters 4 & 5). <p>Experimental work consisted in a series of laboratory experiments, in which ant behaviour was studied at two stages of the dispersal process: at the seed source and inside the nest. Seeds of the myrmecochorous plants Viola odorata and Chelidonium majus were presented to two ant species: Lasius niger and Myrmica rubra. Each stage of the myrmecochory sequence generated a variability of behaviours for each of the four ant-seed pairs.<p>The elaiosomedo not attract seed at a distance. Ants followed always the same behavioural sequence: antennations, manipulations, and removal. The number of antennations and manipulations before removal can be considered as a measure of ants’ “hesitation” to remove seeds. The carnivorous species Myrmica rubra was faster and more efficient at taking seeds than the aphid-tending Lasius niger. At the same time, ants antennated and manipulated less Chelidonium majus seeds, which shows a particular interest for this seed species. One day after the experiment, all seeds of both species were located outside the nest in the refuse piles. At least half of their elaiosomes had been consumed (chapter 1). <p>Inside the nest, Myrmica rubra also showed a great ability to treat seeds quickly, i.e. quicker dynamics of elaiosome removal and seed rejection outside the nest. Elaiosome removal rates were influenced by seed species (higher for Chelidonium majus). We showed that a variable proportion of seeds (less than half) was directly deposited in contact with larvae. The rest of the seeds were handled elsewhere by workers, or left temporarily unattended in the nest. Dynamics of seed rejection outside the nest were curiously little influenced by the seed species. For a seed, to loose the elaiosome decreased the number of workers manipulating it. At the same time, even if the rejection response is not automatic, the absence of elaiosome increases the probability for a seed to be rejected (Chapter 2).<p>We isolated the desiccation parameter in order to measure its influence on seed removal rates. Progressive seed desiccation reduced Myrmica rubra removal rates. Rehydration of the same seeds restored their attractiveness, thereby prolonging their functional life. Viola odorata seeds lost almost all their attractiveness after 4 days of desiccation, and rehydration only restored a reduced part of their attractiveness. On the contrary, Chelidonium majus seeds kept one third of their attractiveness after one month of desiccation, and recovered almost all their attractiveness after rehydration (Chapter 3). <p>The bibliographic review allowed us to compile an outline of the main features of seed-disperser ants. Some generalist features highly increase the probability that ants encounter seeds: their ubiquity and taxonomic diversity, omnivorous diet and their opportunistic “diffuse” foraging. Among insects, ants have unique traits that make them broad dispsersers: ground foraging, the ability to transport items, and nesting behaviour. Some other traits have a great influence on the seed dispersal system: the ant body size, their diet preferences, the phenology of the colony, the learning, and the frequence of nest relocation. We also develop the hypothesis according to which, handling efficiency of ants is a byproduct of hygienic behaviour of carnivorous oriented species, since they are used to manage perishable preys (Chapter 4). <p>We compiled the first list of myrmecochorous and potentially myrmecochorous plants species of European temperate regions (260 spp.). We show that these plants are mainly herbaceous. They also tend to flower earlier than the whole flora. The proportions of myrmecochorous seeds having a size range between 1 and 3 mm, and a weight range between 0.6 and 10 mg are higher than in the rest of the flora (Chapter 5). <p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished